為研究抗甲狀腺多肽的特異性與親和力,本研究建立了人促甲狀腺素受體(TSHR)α亞基(hTSHRA)穩定表達株。構建hTSHRA到慢病毒質粒GV218上形成GV218-hTSHRA,挑取GV218-hTSHRA構建物陽性大腸桿菌克隆,提取DNA測序結果與人TSHRA序列比對,100%吻合。結果顯示:GV218-hTSHRA轉染到HEK 293T后,Western blot顯示,HEK 293T細胞提取蛋白出現52 kD的hTSHRA目的條帶。GV218-hTSHRA、輔助質粒在HEK 293T細胞中包裝后,HEK 293T細胞表達綠色熒光蛋白。收取濃縮的包裝病毒,qPCR測定滴度達到了2×108 TU/mL。再將包裝病毒轉染到HEK 293T細胞中,hTSHRA即表達在HEK 293T細胞上,細胞傳代后hTSHRA仍然穩定表達。結果表明獲得GV218-hTSHRA包裝質粒,并建立了hTSHRA-HEK 293T穩定表達株,為研究抗甲狀腺多肽與人TSHRα亞基特異性與親和力提供了必要的實驗材料。
引用本文： 唐恭順. 建立人促甲狀腺素受體α亞基HEK293T細胞穩定表達株. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(1): 146-151. doi: 10.7507/1001-5515.20140029 復制
引言
治療Graves甲亢可選擇抗甲狀腺藥物、放射性131I和外科手術三種方式。抗甲狀腺藥物抑制甲狀腺激素(T4)合成，但可引起嚴重的血小板降低致出血傾向，嚴重白細胞降低致感染，以及嚴重肝功能損害和黃疸[1-3]。放射性131I可能引起甲狀腺功能低下。外科手術是有創手段，可能出現喉返神經損傷等并發癥。因此，尋找抗甲狀腺新藥是必然選擇。
Graves甲亢的病因是人體內產生的甲狀腺刺激性抗體(thyroid stimulating antibody,TSAb)作用在甲狀腺濾泡細胞表面的促甲狀腺素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)，使細胞內產生的cAMP增加，合成T4增加。T4及其代謝產物T3導致甲亢癥狀。TSAb作用在球后脂肪細胞、眼外肌細胞上引起突眼。結構生物學研究闡明了TSAb(M22)的重鏈與TSHR的α亞基(TSHRA)相互作用[4]。
阻斷TSAb與TSHRA相互作用是研究抗甲狀腺藥物的新手段。研究表明，M22的Y49LC/Q53LC、D52LC/Q53LC、L54LC/P55LC/V58LC/V59LC/D60LC組成線性表位，與TSHRA的C端構象表位N208、Q235、R255、N256結合[5]。
研究TSHR小分子阻斷劑時，有人構建了hTSHR-pSVL載體和hTSHR-pcDNA3.1載體，并表達在HEK 293T細胞、COS-7細胞上[6-10]。我們已經構建了TSHR在HEK 293T細胞的穩定表達株，用于研究hTSHR阻斷肽的生物學特性。本研究試圖將hTSHRA組裝到慢病毒載體GV218上成為GV218-hTSHRA包裝質粒，并在HEK 293T細胞上穩定表達。hTSHRA/HEK 293T穩定表達株是研究抗甲狀腺多肽與hTSHRA特異性結合以及親和力的重要工具。
1 材料和方法
1.1 儀器和試劑
主要試劑：1 kb DNA ladder Marker，Fermentas公司。250 bp DNA ladder Marker，捷瑞公司。瓊脂糖，賽百盛公司。In-FusionTM PCR Cloning Kit，clontech。Taq polymerase，SinoBio。dNTP，Takara。Primer，捷瑞生物。限制性內切酶，NEB。Plasmid 抽提 Kit，Promega。GV218載體，AgeⅠ / NcoⅠ酶切，購自上海吉凱基因化學技術有限公司。胎牛血清FBS，GIBCO。DMSO，上海生物試劑廠。DMEM，GIBCO。胰酶，上海化學試劑公司。Opti-MEM，Invitrogen。BCA Protein Assay Kit，HyClone-Pierce。Prestained protein marker，中晶公司。ECL-PLUS/Kit，Amersham公司。醫用X射線光片，Kodak。X線膠片顯影粉、定影粉，上海冠龍照相材料廠。
主要設備：PCR儀，Applied Biosystems公司。positive clone 測序，美季生物技術。穩壓DNA電泳儀，BioRad公司。凝膠成像儀，天能公司。細菌搖床，華利達實驗設備公司。細菌培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。Gilson移液器，吉爾森公司。高速離心機，日立公司。一次性平皿，湖南長沙天地人生物科技有限公司。1 L燒瓶，金壇市晶玻實驗儀器廠。50 mL 聚丙烯管，上海吳化化工有限公司。熒光顯微鏡，奧林巴斯。CO2培養箱，日本三洋SANYO。生物安全柜，上海振樣創空氣凈化設備公司。穩壓電源(電泳用)，上海天能。SDS-PAGE蛋白電泳儀，上海天能。蛋白轉膜儀，上海天能。5417R臺式冷凍高速離心機，Eppendorf公司。
1.2 構建GV218-hTSHRA骨架質粒
1.2.1 載體酶切
慢病毒載體GV218由吉凱基因提供，其元件順序為Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin。多克隆位點包含AgeⅠ/AgeⅠ酶切位點。載體圖譜和序列可從吉凱基因公司網站http://www.genechem.com.cn/Zaiti.aspx?zt=查閱。AgeⅠ單酶切GV218獲得線性化載體，預測長度大于10 kb。
1.2.2 獲取hTSHRA基因片段
分別設計hTSHRA前向引物和反向引物。前向引物：5′- GA-GGA TCCCC GGGTA CCGGT CGCCA CCATG GGAAT GGGGT GTTCG TCTC -3′，其中ACCGGT是AgeⅠ的酶切位點；3′端部分序列是hTSHRA序列，用于釣取目的基因。反向引物5′-TCACC ATGGT GGCGA CCGGA AGAGT CCAGG TGTTT CTTGC -3′，其中CCATGG是NcoⅠ酶切位點。從載體中行RT-PCR擴增獲得hTHSRA基因片段。PCR產物用AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切DNA片段大小。AgeⅠ/NcoⅠ間hTSHRA片段大小為769 bp。
1.2.3 構建GV218-hTSHRA重組質粒
將AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切hTSHRA基因、GV218載體。雙酶切產物用T4連接酶連接構建慢病毒載體GV218-hTSHRA。陽性對照GAPDH用AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切后與GV218構建GAPDH-GV218載體。空白自連載體用T4連接酶連接GV218線性載體，不加入外源基因。連接產物轉化感受態細胞，液體LB搖菌后涂板，觀察克隆生長情況。
挑取若干GV218-hTSHRA克隆，用適當hTSHRA引物PCR擴增。同時挑取數個GAPDH陽性對照克隆、空白自連載體克隆，選擇適當引物PCR擴增。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶。出現目的條帶的GV218-hTSHRA陽性克隆做質粒小抽，提取DNA測序。比對測序結果，證明構建GV218-hTSHRA是否成功。
1.3 Western blot檢測
HEK 293T細胞復蘇、傳代。處于對數生長期的HEK 293T細胞用胰酶消化，制成細胞懸液(細胞數約為4×105)，接種于24-well培養板中培養至細胞融合度達到約80%。按照每孔HEK 293T細胞1 μg質粒、2 μL Lipofectamine 2000比例，分別溶解質粒和Lipofectamine 2000于opti-MEM中，混勻。將質粒、Lipofectamine 2000混合液加入到HEK 293T 細胞中培養，使GV218-hTSHRA轉染到HEK 293T細胞中。GV218上包含綠色熒光蛋白(green fluoresent protein,GFP)基因。轉染24 h后觀察質粒上GFP基因的表達情況以判斷感染效率。
轉染36 h后收集細胞進行Western blot檢測。超聲破碎細胞、離心提取上清中蛋白，測定蛋白濃度后調整蛋白濃度為2 μg/μL。制膠、上樣、SDS-PAGE電泳。將膠中蛋白電轉到PVDF膜上，牛奶封閉。順序孵育一抗、二抗(小鼠)。然后用ECL + plusTM Western blotting system 試劑盒顯色。GAPDH陽性對照HEK 293T細胞用抗GFP一抗，hTSHRA過表達HEK 293T細胞用抗hTSHRA抗體做一抗。
1.4 病毒包裝與滴度測定
1.4.1 包裝
取對數生長期HEK 293T細胞1.2×107(20 mL)，接種于15 mL培養皿中培養24 h后細胞密度達到70%~80%。取GV218 20 μg、輔助質粒10 μg與2.5 mL Opti-MEM混勻。取100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM混勻。將質粒、Lipofectamine 2000混合液移入HEK 293T細胞，轉染48 h后完成病毒包裝。
1.4.2 濃縮病毒
收集以上HEK 293T細胞上清液，離心除去碎片后用0.45 μm濾器過濾。病毒不能被過濾而留在濾器上方，培養基濾入到下方收集瓶。棄去收集瓶中大部分培養基，再將濾器倒置離心將病毒拋入培養基中，病毒得以濃縮。
1.4.3 qPCR測定濃縮病毒滴度
向96孔板中加入100 μL 4×104/孔的HEK 293T細胞，共加8孔，預培養24 h后細胞貼壁。取10 μL病毒原液用培養基1∶10連續稀釋8次。棄去96孔板中的培養基，加入對應稀釋度的包裝病毒，培養4 d。觀察表達GFP的HEK 293T細胞數量。病毒滴度(TU/μL)=(100×視野中細胞個數)/稀釋度。本研究采用qPCR測定病毒滴度，即提取各稀釋孔總RNA，RT-PCR繪制熔解曲線以讀取Ct值(取2孔平均值)。選擇GFP基因、Actin基因設計引物做qPCR。GFP基因的前向引物是5′-TGCTT CAGCC GCTAC CC-3′，反向引物是5′-AGTTC ACCTT GATGC CGTTC-3′。Actin基因的前向引物是5′-GTGGA CATCC GCAAA GAC-3′，反向引物是5′-AAAGG GTGTA ACGCA ACTA-3′。以對照孔Ct值-稀釋孔Ct值≥2作為稀釋孔有病毒的標志計算病毒滴度。并以Actin基因、GFP基因熔解曲線是否呈單峰判斷熔解曲線的可靠性。
1.5 建立hTSHRA穩定表達株
取對數生長期HEK 293T細胞1.2×107接種于15 mL培養皿，培養24 h后細胞密度達到70%~80%。取包裝質粒(GV218-hTSHRA)20 μg與2.5 mL Opti-MEM混勻。取100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM混勻。將包裝質粒、Lipofectamine 2000混合液移入HEK 293T細胞，轉染48 h即獲得hTSHRA穩定表達株。hTSHRA-HEK 293T穩定表達株可以連續傳代，各代細胞株均表達hTSHRA。
2 結果
2.1 GV218載體質量鑒定
AgeⅠ/NcoⅠ酶切GV218載體，由瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖 1)可知：2道為線性化質粒GV218的單一條帶，大小與預測大小一致(＞10 kb)；3道是從細菌提取的未酶切GV218質粒，因為超螺旋、開環、線性等不同的構象，在10 kb附近呈現多個條帶。
圖1
慢病毒載體GV218酶切瓊脂糖凝膠電泳圖
1道：marker；2道：GV218載體單酶切產物呈現單一條帶；3道：從細菌提取的未酶切GV218質粒(因可能存在超螺旋，開環，線性等構象而遷移速率不同)
Figure1. Agarose gel electrophoresis of GV218 by AgeⅠ digestionLane 1：marker; Lane 2: linear GV218; Lane 3: GV218 obtained from bacteria (the illustration is given by GENECHEM)
2.2 獲取hTSHRA基因
AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切hTSHRA基因載體，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后出現單一條帶，大小與預測的769 bp符合，說明獲得了目的基因片段hTSHRA(見圖 2)。
圖2
hTSHRA基因酶切電泳圖
1道：hTSHRA基因片段；2道：marker
Figure2. Agarose gel electrophoresis of hTSHR α-subunit by AgeⅠ/NcoⅠ digestionLane 1: hTSHAR; Lane 2: marker
2.3 GV218-hTSHRA測序前電泳
分別設計hTSHRA引物、GADPH引物，PCR擴增后一同電泳(見圖 3)。泳道3是GAPDH的PCR產物，大小與預測大小相同。泳道5~12為hTSHRA隨機克隆的PCR產物，其中8、9、11、12號克隆為hTSHRA陽性轉化子，與預測大小相同。提取GV218-hTSHRA陽性轉化子克隆DNA測序。
圖3
GV218-hTHSR酶切片段PCR產物電泳圖
0、1道：ddH2O；2道：陰性對照(空白自連對照組)；3道：陽性對照(GAPDH)，457 bp；4道：marker(自上而下依次為5、3、2、1.5、1 kb及750、500、250和100 bp)；5~12道：hTSHRA1~8號轉化子,769 bp。
Figure3. Agarose gel electrophoresis of GV218-hTSHRA restriction enzyme fragmentLane 1: ddH2O; Lane 2: negative control; Lane 3: GAPDH (positive control),457 bp; Lane 4: marker; Lane 5-12: GV218-hTSHRA positive clone,769 bp
2.4 陽性克隆測序結果和序列比對
陽性克隆測序結果是，5′- GAGGA TCCCC GGGTA CCGGT CGCCA CCATG GGAAT GGGGT GTTCG TCTC-(TSHRA)-CGCCA TGG-3′。ACCGGT是前向引物的酶切片段，CCATGG是反向引物的酶切片段，中間的序列用TSHRA表示。包括兩端引物的序列長度769 bp。與已知的人TSHRA基因序列比對，陽性克隆序列與已知序列相同(100%)。
2.5 Western blot質粒轉染與表達檢測
如圖 4所示，泳道1為GADPH陽性對照，用抗GFP抗體為一抗，小鼠二抗，SURVIVIN-3FLAG-GFP預測大小為48 kD；泳道2為空白自連對照。泳道3為過表達hTSHRA融合蛋白；用抗hTSHRA抗體為一抗、小鼠二抗，預測目的基因融合蛋白Western blot的分子量大小是52 kD[11-12]。說明GV218-hTSHRA在HEK 293T細胞過表達。
圖4
Western blot檢測hTSHRA目的條帶
1道：陽性對照，轉染GAPDH-GV218的HEK 293T細胞; 2道：空白自連對照; 3道：過表達hTSHRA的HEK 293T細胞
Figure4. Western blot of hTSHRALane 1: GAPDH-GV218-HEK 293T cells; Lane 2: negative control; Lane 3: over-expression of hTSHRA in HEK 293T cells
2.6 慢病毒包裝和質粒檢測
用GFP抗體顯色，熒光顯微鏡可見HEK 293T細胞顯示綠色熒光(見圖 5)。
圖5
熒光顯微鏡觀察HEK 293T細胞熒光(200×)
Figure5.
Fluorescence expression of GFP gene in HEK 293T(200×)
GV218上包含GFP基因。GFP基因的qPCR曲線(見圖 6)顯示。濃縮病毒儲存液換算出來的病毒滴度為大于2×108 TU/mL。GFP、Actin溶解曲線均為單峰(數據未給出)，證明病毒中沒有污染、引物二聚體、非特異性擴增，計算的病毒滴度可靠。
圖6
GFP基因的qPCR曲線
Figure6.
qPCR curves of GFP gene
3 討論
人TSHR基因位于14q31，mRNA長2 294 bp(CDS：151-2451)，編碼764 氨基酸。1~20氨基酸是信號肽，21~764氨基酸是成熟肽。編碼后的前體A317-F366被剪切掉，形成α、β亞單位。因此TSHRA由21-317氨基酸組成。α亞基N端有兩個loop，中央是亮氨酸富集區(LRR)，C端稱為鉸鏈區，接近細胞膜并與β亞基連接。LRR凹面是TSHRA與TSAb結合區。β亞基的E404-T682是7跨膜區，K683-L744是C端尾，具有酪氨酸激酶活性。人TSHR表達在甲狀腺濾泡細胞、皮膚[13]、腎上腺、腎、胸腺[14-15]、眼眶脂肪結締組織[13, 16-18]。因此，Graves甲亢除甲狀腺病變外還可能有突眼等甲狀腺外表現。
慢病毒包裝質粒轉染HEK 293T細胞的轉染效率明顯高于骨架質粒，轉染后的HEK 293T細胞在傳代后可穩定表達hTSHRA等外源基因。因此，本研究用包裝病毒構建穩定表達株，有利于反復進行抗甲狀腺多肽的研究，獲得更穩定的實驗結果。本研究包括GV218載體酶切、hTSHRA基因獲取，GV218-hTSHRA構建、Western blot證明HEK 293T細胞過表達hTSHRA、慢病毒包裝，以及包裝病毒在HEK 293T細胞的過表達等步驟，圓滿完成實驗。我們凍存了GV218-hTSHRA包裝病毒，獲取并凍存了hTSHRA-HEK 293T細胞穩定表達株。
我們已經構建完成了人TSHR-HEK 293T細胞穩定表達株，主要用途是研究阻斷肽的生物學作用。我們建立人TSHRA-HEK 293T細胞穩定表達株，用于鑒定多肽與TSHR α亞基的特異性和親和力。
我們依據TSAb與TSHRA相互作用的位點，設計了數十條多肽。目前已經合成并凍存了6條有潛力的多肽，這些片段可能是hTSHRA阻斷劑。下一步研究是：① 有或沒有多肽的條件下，比較bTSH刺激hTSHR-HEK 293T細胞穩定表達株后細胞內cAMP變化，從而判斷哪些多肽屬于TSHR阻斷肽；② 用人TSHRA-HEK 293T細胞穩定表達株測定TSHR阻斷肽的特異性與親和力。
4 小結
我們組裝了GV218-hTSHRA包裝質粒，建立了hTSHRA的HEK 293T細胞穩定表達株，為研究TSHR阻斷肽與TSHRA的親和力提供了必要的實驗材料。
引言
治療Graves甲亢可選擇抗甲狀腺藥物、放射性131I和外科手術三種方式。抗甲狀腺藥物抑制甲狀腺激素(T4)合成，但可引起嚴重的血小板降低致出血傾向，嚴重白細胞降低致感染，以及嚴重肝功能損害和黃疸[1-3]。放射性131I可能引起甲狀腺功能低下。外科手術是有創手段，可能出現喉返神經損傷等并發癥。因此，尋找抗甲狀腺新藥是必然選擇。
Graves甲亢的病因是人體內產生的甲狀腺刺激性抗體(thyroid stimulating antibody,TSAb)作用在甲狀腺濾泡細胞表面的促甲狀腺素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)，使細胞內產生的cAMP增加，合成T4增加。T4及其代謝產物T3導致甲亢癥狀。TSAb作用在球后脂肪細胞、眼外肌細胞上引起突眼。結構生物學研究闡明了TSAb(M22)的重鏈與TSHR的α亞基(TSHRA)相互作用[4]。
阻斷TSAb與TSHRA相互作用是研究抗甲狀腺藥物的新手段。研究表明，M22的Y49LC/Q53LC、D52LC/Q53LC、L54LC/P55LC/V58LC/V59LC/D60LC組成線性表位，與TSHRA的C端構象表位N208、Q235、R255、N256結合[5]。
研究TSHR小分子阻斷劑時，有人構建了hTSHR-pSVL載體和hTSHR-pcDNA3.1載體，并表達在HEK 293T細胞、COS-7細胞上[6-10]。我們已經構建了TSHR在HEK 293T細胞的穩定表達株，用于研究hTSHR阻斷肽的生物學特性。本研究試圖將hTSHRA組裝到慢病毒載體GV218上成為GV218-hTSHRA包裝質粒，并在HEK 293T細胞上穩定表達。hTSHRA/HEK 293T穩定表達株是研究抗甲狀腺多肽與hTSHRA特異性結合以及親和力的重要工具。
1 材料和方法
1.1 儀器和試劑
主要試劑：1 kb DNA ladder Marker，Fermentas公司。250 bp DNA ladder Marker，捷瑞公司。瓊脂糖，賽百盛公司。In-FusionTM PCR Cloning Kit，clontech。Taq polymerase，SinoBio。dNTP，Takara。Primer，捷瑞生物。限制性內切酶，NEB。Plasmid 抽提 Kit，Promega。GV218載體，AgeⅠ / NcoⅠ酶切，購自上海吉凱基因化學技術有限公司。胎牛血清FBS，GIBCO。DMSO，上海生物試劑廠。DMEM，GIBCO。胰酶，上海化學試劑公司。Opti-MEM，Invitrogen。BCA Protein Assay Kit，HyClone-Pierce。Prestained protein marker，中晶公司。ECL-PLUS/Kit，Amersham公司。醫用X射線光片，Kodak。X線膠片顯影粉、定影粉，上海冠龍照相材料廠。
主要設備：PCR儀，Applied Biosystems公司。positive clone 測序，美季生物技術。穩壓DNA電泳儀，BioRad公司。凝膠成像儀，天能公司。細菌搖床，華利達實驗設備公司。細菌培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。Gilson移液器，吉爾森公司。高速離心機，日立公司。一次性平皿，湖南長沙天地人生物科技有限公司。1 L燒瓶，金壇市晶玻實驗儀器廠。50 mL 聚丙烯管，上海吳化化工有限公司。熒光顯微鏡，奧林巴斯。CO2培養箱，日本三洋SANYO。生物安全柜，上海振樣創空氣凈化設備公司。穩壓電源(電泳用)，上海天能。SDS-PAGE蛋白電泳儀，上海天能。蛋白轉膜儀，上海天能。5417R臺式冷凍高速離心機，Eppendorf公司。
1.2 構建GV218-hTSHRA骨架質粒
1.2.1 載體酶切
慢病毒載體GV218由吉凱基因提供，其元件順序為Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin。多克隆位點包含AgeⅠ/AgeⅠ酶切位點。載體圖譜和序列可從吉凱基因公司網站http://www.genechem.com.cn/Zaiti.aspx?zt=查閱。AgeⅠ單酶切GV218獲得線性化載體，預測長度大于10 kb。
1.2.2 獲取hTSHRA基因片段
分別設計hTSHRA前向引物和反向引物。前向引物：5′- GA-GGA TCCCC GGGTA CCGGT CGCCA CCATG GGAAT GGGGT GTTCG TCTC -3′，其中ACCGGT是AgeⅠ的酶切位點；3′端部分序列是hTSHRA序列，用于釣取目的基因。反向引物5′-TCACC ATGGT GGCGA CCGGA AGAGT CCAGG TGTTT CTTGC -3′，其中CCATGG是NcoⅠ酶切位點。從載體中行RT-PCR擴增獲得hTHSRA基因片段。PCR產物用AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切DNA片段大小。AgeⅠ/NcoⅠ間hTSHRA片段大小為769 bp。
1.2.3 構建GV218-hTSHRA重組質粒
將AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切hTSHRA基因、GV218載體。雙酶切產物用T4連接酶連接構建慢病毒載體GV218-hTSHRA。陽性對照GAPDH用AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切后與GV218構建GAPDH-GV218載體。空白自連載體用T4連接酶連接GV218線性載體，不加入外源基因。連接產物轉化感受態細胞，液體LB搖菌后涂板，觀察克隆生長情況。
挑取若干GV218-hTSHRA克隆，用適當hTSHRA引物PCR擴增。同時挑取數個GAPDH陽性對照克隆、空白自連載體克隆，選擇適當引物PCR擴增。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶。出現目的條帶的GV218-hTSHRA陽性克隆做質粒小抽，提取DNA測序。比對測序結果，證明構建GV218-hTSHRA是否成功。
1.3 Western blot檢測
HEK 293T細胞復蘇、傳代。處于對數生長期的HEK 293T細胞用胰酶消化，制成細胞懸液(細胞數約為4×105)，接種于24-well培養板中培養至細胞融合度達到約80%。按照每孔HEK 293T細胞1 μg質粒、2 μL Lipofectamine 2000比例，分別溶解質粒和Lipofectamine 2000于opti-MEM中，混勻。將質粒、Lipofectamine 2000混合液加入到HEK 293T 細胞中培養，使GV218-hTSHRA轉染到HEK 293T細胞中。GV218上包含綠色熒光蛋白(green fluoresent protein,GFP)基因。轉染24 h后觀察質粒上GFP基因的表達情況以判斷感染效率。
轉染36 h后收集細胞進行Western blot檢測。超聲破碎細胞、離心提取上清中蛋白，測定蛋白濃度后調整蛋白濃度為2 μg/μL。制膠、上樣、SDS-PAGE電泳。將膠中蛋白電轉到PVDF膜上，牛奶封閉。順序孵育一抗、二抗(小鼠)。然后用ECL + plusTM Western blotting system 試劑盒顯色。GAPDH陽性對照HEK 293T細胞用抗GFP一抗，hTSHRA過表達HEK 293T細胞用抗hTSHRA抗體做一抗。
1.4 病毒包裝與滴度測定
1.4.1 包裝
取對數生長期HEK 293T細胞1.2×107(20 mL)，接種于15 mL培養皿中培養24 h后細胞密度達到70%~80%。取GV218 20 μg、輔助質粒10 μg與2.5 mL Opti-MEM混勻。取100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM混勻。將質粒、Lipofectamine 2000混合液移入HEK 293T細胞，轉染48 h后完成病毒包裝。
1.4.2 濃縮病毒
收集以上HEK 293T細胞上清液，離心除去碎片后用0.45 μm濾器過濾。病毒不能被過濾而留在濾器上方，培養基濾入到下方收集瓶。棄去收集瓶中大部分培養基，再將濾器倒置離心將病毒拋入培養基中，病毒得以濃縮。
1.4.3 qPCR測定濃縮病毒滴度
向96孔板中加入100 μL 4×104/孔的HEK 293T細胞，共加8孔，預培養24 h后細胞貼壁。取10 μL病毒原液用培養基1∶10連續稀釋8次。棄去96孔板中的培養基，加入對應稀釋度的包裝病毒，培養4 d。觀察表達GFP的HEK 293T細胞數量。病毒滴度(TU/μL)=(100×視野中細胞個數)/稀釋度。本研究采用qPCR測定病毒滴度，即提取各稀釋孔總RNA，RT-PCR繪制熔解曲線以讀取Ct值(取2孔平均值)。選擇GFP基因、Actin基因設計引物做qPCR。GFP基因的前向引物是5′-TGCTT CAGCC GCTAC CC-3′，反向引物是5′-AGTTC ACCTT GATGC CGTTC-3′。Actin基因的前向引物是5′-GTGGA CATCC GCAAA GAC-3′，反向引物是5′-AAAGG GTGTA ACGCA ACTA-3′。以對照孔Ct值-稀釋孔Ct值≥2作為稀釋孔有病毒的標志計算病毒滴度。并以Actin基因、GFP基因熔解曲線是否呈單峰判斷熔解曲線的可靠性。
1.5 建立hTSHRA穩定表達株
取對數生長期HEK 293T細胞1.2×107接種于15 mL培養皿，培養24 h后細胞密度達到70%~80%。取包裝質粒(GV218-hTSHRA)20 μg與2.5 mL Opti-MEM混勻。取100 μL Lipofectamine 2000與2.4 mL Opti-MEM混勻。將包裝質粒、Lipofectamine 2000混合液移入HEK 293T細胞，轉染48 h即獲得hTSHRA穩定表達株。hTSHRA-HEK 293T穩定表達株可以連續傳代，各代細胞株均表達hTSHRA。
2 結果
2.1 GV218載體質量鑒定
AgeⅠ/NcoⅠ酶切GV218載體，由瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖 1)可知：2道為線性化質粒GV218的單一條帶，大小與預測大小一致(＞10 kb)；3道是從細菌提取的未酶切GV218質粒，因為超螺旋、開環、線性等不同的構象，在10 kb附近呈現多個條帶。
圖1
慢病毒載體GV218酶切瓊脂糖凝膠電泳圖
1道：marker；2道：GV218載體單酶切產物呈現單一條帶；3道：從細菌提取的未酶切GV218質粒(因可能存在超螺旋，開環，線性等構象而遷移速率不同)
Figure1. Agarose gel electrophoresis of GV218 by AgeⅠ digestionLane 1：marker; Lane 2: linear GV218; Lane 3: GV218 obtained from bacteria (the illustration is given by GENECHEM)
2.2 獲取hTSHRA基因
AgeⅠ/NcoⅠ雙酶切hTSHRA基因載體，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后出現單一條帶，大小與預測的769 bp符合，說明獲得了目的基因片段hTSHRA(見圖 2)。
圖2
hTSHRA基因酶切電泳圖
1道：hTSHRA基因片段；2道：marker
Figure2. Agarose gel electrophoresis of hTSHR α-subunit by AgeⅠ/NcoⅠ digestionLane 1: hTSHAR; Lane 2: marker
2.3 GV218-hTSHRA測序前電泳
分別設計hTSHRA引物、GADPH引物，PCR擴增后一同電泳(見圖 3)。泳道3是GAPDH的PCR產物，大小與預測大小相同。泳道5~12為hTSHRA隨機克隆的PCR產物，其中8、9、11、12號克隆為hTSHRA陽性轉化子，與預測大小相同。提取GV218-hTSHRA陽性轉化子克隆DNA測序。
圖3
GV218-hTHSR酶切片段PCR產物電泳圖
0、1道：ddH2O；2道：陰性對照(空白自連對照組)；3道：陽性對照(GAPDH)，457 bp；4道：marker(自上而下依次為5、3、2、1.5、1 kb及750、500、250和100 bp)；5~12道：hTSHRA1~8號轉化子,769 bp。
Figure3. Agarose gel electrophoresis of GV218-hTSHRA restriction enzyme fragmentLane 1: ddH2O; Lane 2: negative control; Lane 3: GAPDH (positive control),457 bp; Lane 4: marker; Lane 5-12: GV218-hTSHRA positive clone,769 bp
2.4 陽性克隆測序結果和序列比對
陽性克隆測序結果是，5′- GAGGA TCCCC GGGTA CCGGT CGCCA CCATG GGAAT GGGGT GTTCG TCTC-(TSHRA)-CGCCA TGG-3′。ACCGGT是前向引物的酶切片段，CCATGG是反向引物的酶切片段，中間的序列用TSHRA表示。包括兩端引物的序列長度769 bp。與已知的人TSHRA基因序列比對，陽性克隆序列與已知序列相同(100%)。
2.5 Western blot質粒轉染與表達檢測
如圖 4所示，泳道1為GADPH陽性對照，用抗GFP抗體為一抗，小鼠二抗，SURVIVIN-3FLAG-GFP預測大小為48 kD；泳道2為空白自連對照。泳道3為過表達hTSHRA融合蛋白；用抗hTSHRA抗體為一抗、小鼠二抗，預測目的基因融合蛋白Western blot的分子量大小是52 kD[11-12]。說明GV218-hTSHRA在HEK 293T細胞過表達。
圖4
Western blot檢測hTSHRA目的條帶
1道：陽性對照，轉染GAPDH-GV218的HEK 293T細胞; 2道：空白自連對照; 3道：過表達hTSHRA的HEK 293T細胞
Figure4. Western blot of hTSHRALane 1: GAPDH-GV218-HEK 293T cells; Lane 2: negative control; Lane 3: over-expression of hTSHRA in HEK 293T cells
2.6 慢病毒包裝和質粒檢測
用GFP抗體顯色，熒光顯微鏡可見HEK 293T細胞顯示綠色熒光(見圖 5)。
圖5
熒光顯微鏡觀察HEK 293T細胞熒光(200×)
Figure5.
Fluorescence expression of GFP gene in HEK 293T(200×)
GV218上包含GFP基因。GFP基因的qPCR曲線(見圖 6)顯示。濃縮病毒儲存液換算出來的病毒滴度為大于2×108 TU/mL。GFP、Actin溶解曲線均為單峰(數據未給出)，證明病毒中沒有污染、引物二聚體、非特異性擴增，計算的病毒滴度可靠。
圖6
GFP基因的qPCR曲線
Figure6.
qPCR curves of GFP gene
3 討論
人TSHR基因位于14q31，mRNA長2 294 bp(CDS：151-2451)，編碼764 氨基酸。1~20氨基酸是信號肽，21~764氨基酸是成熟肽。編碼后的前體A317-F366被剪切掉，形成α、β亞單位。因此TSHRA由21-317氨基酸組成。α亞基N端有兩個loop，中央是亮氨酸富集區(LRR)，C端稱為鉸鏈區，接近細胞膜并與β亞基連接。LRR凹面是TSHRA與TSAb結合區。β亞基的E404-T682是7跨膜區，K683-L744是C端尾，具有酪氨酸激酶活性。人TSHR表達在甲狀腺濾泡細胞、皮膚[13]、腎上腺、腎、胸腺[14-15]、眼眶脂肪結締組織[13, 16-18]。因此，Graves甲亢除甲狀腺病變外還可能有突眼等甲狀腺外表現。
慢病毒包裝質粒轉染HEK 293T細胞的轉染效率明顯高于骨架質粒，轉染后的HEK 293T細胞在傳代后可穩定表達hTSHRA等外源基因。因此，本研究用包裝病毒構建穩定表達株，有利于反復進行抗甲狀腺多肽的研究，獲得更穩定的實驗結果。本研究包括GV218載體酶切、hTSHRA基因獲取，GV218-hTSHRA構建、Western blot證明HEK 293T細胞過表達hTSHRA、慢病毒包裝，以及包裝病毒在HEK 293T細胞的過表達等步驟，圓滿完成實驗。我們凍存了GV218-hTSHRA包裝病毒，獲取并凍存了hTSHRA-HEK 293T細胞穩定表達株。
我們已經構建完成了人TSHR-HEK 293T細胞穩定表達株，主要用途是研究阻斷肽的生物學作用。我們建立人TSHRA-HEK 293T細胞穩定表達株，用于鑒定多肽與TSHR α亞基的特異性和親和力。
我們依據TSAb與TSHRA相互作用的位點，設計了數十條多肽。目前已經合成并凍存了6條有潛力的多肽，這些片段可能是hTSHRA阻斷劑。下一步研究是：① 有或沒有多肽的條件下，比較bTSH刺激hTSHR-HEK 293T細胞穩定表達株后細胞內cAMP變化，從而判斷哪些多肽屬于TSHR阻斷肽；② 用人TSHRA-HEK 293T細胞穩定表達株測定TSHR阻斷肽的特異性與親和力。
4 小結
我們組裝了GV218-hTSHRA包裝質粒，建立了hTSHRA的HEK 293T細胞穩定表達株，為研究TSHR阻斷肽與TSHRA的親和力提供了必要的實驗材料。
