探討微囊微環境對HepG2細胞氧化應激基因表達影響及外源性抗氧化物質干預效果。采用靜電液滴法制備微囊化細胞,real-time PCR法檢測不同培養方式下血紅素加氧酶-1(HO-1)和谷胱甘肽轉硫酶-A1(GST-A1)表達;通過MTT法檢測細胞活性、ELISA法檢測白蛋白含量,比較還原型谷胱甘肽(GSH)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)干預后指標變化。結果顯示,培養第6 d和第16 d時,微囊細胞中HO-1基因表達水平分別為同天數下平面細胞的4.9倍和3.1倍,GST-A1表達分別為平面細胞的11.2倍和33倍(P＜0.05);添加5~10 mmol/L NAC后,微囊化細胞活性較對照組增加40%~70%,白蛋白水平增加20%~30%(P＜0.05),而GSH在10 mmol/L時可使囊內細胞活性增加20%~55%,白蛋白水平增加15%(P＜0.05)。結果提示微囊內存在氧化應激因素誘導基因表達改變,NAC和GSH能緩解其對細胞的抑制作用。
引用本文： 肖靜, 張英, 于瑋婷, 王為, 馬小軍. 微囊化對HepG2細胞氧化應激基因表達影響及調控研究. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(2): 373-378. doi: 10.7507/1001-5515.20140070 復制
引言
細胞微囊化是將細胞包埋在具半透膜性質的微囊膜內并保持其活性的過程，囊內細胞呈三維立體多細胞聚集生長，更接近在體組織特性，在異體移植[1]、大規模培養[2]、藥物控釋篩選[3]等領域廣泛應用。但微囊化細胞依然存在囊內細胞壞死、增殖速率降低、生長延遲期增加等問題。這些問題的解決依賴于對微囊環境及囊內細胞行為的充分認識。
近年來，雖然研究者們從物質傳遞方面對微囊環境進行了探索，對微囊化細胞代謝規律有了初步認識，但因微囊微環境的復雜性而使結果相對局限。現在研究發現，除了物質傳遞因素外，微囊化過程中還存在多種“脅迫”應激因素，如熱“脅迫”、氧化“脅迫”、滲透壓“脅迫”等，這些應激因素可通過誘導基因表達和相關信號傳遞，調控囊內細胞生長和功能[4-7]。但目前相關研究多建立于微生物模型如微囊化酵母細胞，在動物細胞微囊化中的研究少見報道。而事實上微生物生長代謝規律有異于哺乳動物細胞，且動物細胞對外界環境變化更為敏感。如我實驗室發現，微囊化HepG2細胞滲透壓相關應激基因表達增高，并出現代謝通量改變[6]。鑒于微囊中影響因素眾多，是否還有其他應激基因表達改變并對細胞生長發揮調控作用尚不可知，因此有必要以微囊化動物細胞為模型，對微囊微環境以及相關應激反應進行考察，以便為微囊化技術改進和應用提供更多數據。
鑒于以上情況，本文選擇以HepG2為模型,以平面細胞為參照,考察微囊化對氧化應激相關的血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽轉硫酶-A1 (glutathione S-transferases-A1,GST-A1)基因表達的影響，同時添加抗氧化物質即還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)進行外源性干預，以了解囊內細胞生存狀態，為優化微囊化細胞培養提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗用人肝癌細胞株HepG2購自ATCC，海藻酸鈉、聚賴氨酸、胰蛋白酶、Hoechst 33258、還原型谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸購自Sigma公司，白蛋白檢測試劑盒購自Bethyl公司，Trizol裂解液、RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，MEM培養液購自Hyclone公司，胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所，其他試劑均為國產分析純。實驗儀器包括YD-4型微膠囊靜電液滴發生器(中國科學院大連化學物理研究所)、CX31數碼圖像采集系統(日本Olympus公司)、PCR 儀(德國Eppendorf公司)、微量紫外定量分析儀(日本NanoDrop公司)、全自動酶標儀(芬蘭Labsystems公司)和LS55熒光分光光度計(英國PerkinElmer公司)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
平面細胞：HepG2細胞用MEM培養液(15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 mmol/L丙酮酸鈉)5% CO2細胞培養箱中常規培養。微囊化細胞：細胞生長至對數期，用0.25%胰酶消化離心收集，懸浮于1.5% (w/v)海藻酸鈉溶液，細胞密度2×109 /L。利用微囊靜電液滴發生器噴入0.1 mol/L CaCl2溶液形成海藻酸鈣膠珠，電壓400 V，頻率0.05 Hz，脈寬2 ms，然后用0.05% (w/v)多聚賴氨酸包裹，再與0.15% (w/v)海藻酸鈉溶液反應，最后用55 mmol/L檸檬酸鈉溶液液化，微囊直徑為(300±50) μm。獲得微囊化HepG2細胞37 ℃、5% CO2培養箱中培養。
1.2.2 細胞形態學觀察
用相差顯微鏡觀察微囊化細胞生長狀態。
1.2.3 MTT法測定細胞活性
平面細胞：待測孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，PBS 溶液配制，4 ℃避光保存)，37 ℃培養4 h，鏡下觀察有不溶性甲臜顆粒生成，棄上清加入200 μL DMSO溶解結晶。微囊化細胞：待測孔加入100 μL MTT 溶液，37 ℃ 孵育24 h 后篩網過濾收集微囊，溶于1 mL DMSO 溶液。檢測時吸取平面細胞或微囊化細胞紫色DMSO溶解上清液100 μL，置酶標儀測定每孔OD 值，測定波長570 nm，參考波長620 nm。
1.2.4 DNA分析法測定細胞數量
平面細胞胰酶消化后用含proteinase K裂解液50 ℃孵育12 h，釋放DNA；微囊化細胞用PBS清洗破囊，加入含proteinase K裂解液釋放DNA。加入熒光染料Hoechst 33258，測定熒光光度值變化(Ex=355 nm，Em=460 nm)，根據細胞數和DNA熒光光度標準曲線確定細胞數。
1.2.5 ELISA檢測白蛋白分泌水平
白蛋白檢測依試劑說明書，每檢測孔加100 μL樣品或標準品，用酶標儀測定450 nm的吸光度值。
1.2.6 NAC和GSH對細胞生長和蛋白合成影響
分別配置含有不同濃度NAC (1、2、5、10 mmol/L) 和GSH (1、2、5、10 mmol/L) 的培養液，培養微囊化細胞或平面細胞。于培養不同時間留取上清，檢測白蛋白含量，MTT法測定細胞活性，DNA分析法測定細胞數量。
1.2.7 real time-PCR檢測基因表達
提取細胞總RNA，兩步法反轉錄和實時PCR，反轉錄條件37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s；實時PCR條件：預變性95 ℃ 30 s，PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，擴增40個循環，引物設計如表 1所示。
表1
基因引物設計
Table1.
Prime sequences of different gene detected by PCR
1.3 統計學分析
實驗所涉及數據用
2 結果
2.1 微囊化細胞生長情況
如圖 1中所示，微囊化細胞在制備初期生長相對緩慢,且以數個分散細胞團的方式進行聚團，逐漸匯集。隨著培養時間延長，逐漸形成大小不同的細胞聚集體，并向微囊中心遷移，到培養第13 d細胞團大小達到100 μm左右，并在培養第23 d時聚集成較大細胞團，占據大部分囊內空間。
圖1
微囊化HepG2細胞生長方式
Figure1.
The growth profile of microencapsulated HepG2 cells
2.2 微囊化培養對氧化應激基因表達影響
培養第6 d和第16 d時，微囊化細胞HO-1表達水平分別為平面細胞的4.9倍和3.1倍，而GST-A1表達水平則為同天數下平面細胞的11.2和33倍，由結果可知，兩種氧化應激基因的表達均在微囊內出現了顯著增高(P＜0.05)。
2.3 NAC和GSH對不同培養方式下HepG2活性及白蛋白分泌的影響
針對以上實驗結果，向培養液中分別添加NAC和GSH，以考察不同抗氧化物質對HepG2細胞生長及功能產物白蛋白分泌的影響。
NAC是一種含巰基小分子氨基酸衍生物，作為谷胱甘肽合成前體進入細胞，經脫乙酰基促進GSH合成。GSH是胞內主要抗氧化物質，主要通過其巰基結構穩定生物大分子功能以降低活性氧攻擊造成的損傷，具有抗氧化以及干擾和清除自由基生成等作用，是調節胞內氧化還原狀態的關鍵。添加NAC后，平面細胞結果如表 2所示。NAC在1 ~10 mmol/L濃度范圍內對平面細胞活性并無顯著提升，雖然在培養后期10 mmol/L NAC能使HepG2細胞活性出現小幅度上升，但差異并無統計學意義。同時也未發現平面細胞NAC各濃度組白蛋白水平顯著變化，說明NAC的添加對平面培養下HepG2細胞的活性和功能產物分泌均無顯著效果。但如表 3所示，對于微囊化細胞，NAC濃度在5~10 mmol/L時使細胞活性出現增高，從第3 d開始，細胞活性上升了40%~70%(P＜0.05)。與此結果類似，從第5 d開始5~10 mmol/L NAC使微囊化細胞白蛋白水平增加約20%~30%(P＜0.05)，且隨培養時間延長，趨勢更為明顯。
表2
NAC對平面HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table2.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表3
NAC對微囊HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table3.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
與NAC結果一致的是，由表 4可知，在平面細胞中GSH對細胞活性和白蛋白分泌同樣無顯著效果。而在微囊中(見表 5)，自第5 d起囊內細胞活性增加20%~55%，白蛋白水平增加15%~40%，但這種改善效果僅在10 mmol/L 時具有統計學意義(P＜0.05)。
表4
GSH對平面HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table4.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表5
GSH對微囊HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table5.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
3 討論
隨著生物技術和膜技術研究不斷深入,微膠囊已在固定化培養、藥物控釋篩選、人工器官及基因運載等領域廣泛應用。但微囊微環境對囊內細胞影響機制尚不清楚，制約了該技術的改進和應用。近年研究結果顯示，微囊化細胞特殊行為可能是囊內多種應激脅迫因素作用的結果，但其中涉及的作用方式和機制尚不清晰[4]，為此，我們選擇了與氧化應激相關的HO-1和GST-A1基因進行研究，考察其在囊內表達變化，以便為相關機制研究提供實驗依據。
HO-1是廣泛存在的抗氧化防御酶，在缺氧、熱休克、過氧化氫等誘導的氧化應激反應中表達上調，以加強細胞對氧化應激的抵抗性[7]。而GST-A1則是GST超家族中一員，其編碼蛋白參與催化GSH巰基反應。GST-A1通過抑制微粒體過氧化、修復自由基膜磷脂損傷等途徑，解除氧化應激誘變劑損傷效果，是Nrf2/ARE下游重要抗氧化應激分子[8]。
實驗中發現，以上基因在微囊化細胞中均出現表達增高，表明囊內存在氧化應激因素，其產生原因可能來自以下幾個。首先是微囊制作過程中存在的高壓脈沖靜電場和Ca2+的沖擊。高壓靜電可使H2O分解，其中OH-在電場作用下被水中O2獲得形成超氧負離子。同時，電場也會直接破壞胞膜兩側電荷平衡，提高胞內過氧化氫和超氧負離子含量，氧化胞膜上的不飽和脂肪酸，使其產生相變而降低膜流動性，從而激發胞內氧化應激反應[9]。而微囊鈣化過程中的Ca2+可提高黃嘌呤氧化酶活性，一方面促進烷自由基向脂質過氧化物的轉換得以繼續，產生新的自由基，另一方面促進OH-轉化，重新激發自由基連鎖反應，造成瀑布式的氧化應激應答，而 Ca2+內流在線粒體內聚集同樣會造成黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性復合物途徑被過度利用，誘發氧化應激[10]。因此在以上因素影響下，微囊化細胞抗氧化應激基因表達出現上調，其主要目的是保護細胞，啟動氧化應激防御以減輕細胞損傷。
其次，除了微囊制備條件影響外，HO-1和GST-A1的表達改變還可能是囊內細胞三維生長方式影響的結果。Brian等發現三維細胞球中HO-1表達高出平面細胞13倍以上[7]，而Chang等[8]在旋轉反應器培養的細胞球中也發現了GST-A1的表達上調。研究者們認為，這一方面與細胞間接觸和緊密結構的形成有關，另一方面也是細胞在底物和氧氣缺乏下的生長維持需要[7-8]。考慮到微囊結構對物質擴散的影響[4]，HO-1和GST-A1表達上調可能也與囊內細胞在物質擴散受限條件下的生存維持有關。
針對以上結果，我們在培養液中添加兩種抗氧化物NAC和GSH，以考察其作為外源性調控因子在微囊化條件培養中的應用價值。GSH和NAC能夠改善氧化應激狀態下的細胞功能，可通過清除自由基維持細胞氧化還原平衡，抑制活性氧致突變性，并可作用于信號轉導過程，調整細胞因子生成釋放，調節DNA修復，保護細胞正常生長和增殖[11]。以往研究顯示，在肝衰血清中加入NAC和GSH，不但對細胞無生物毒性，相反可改善細胞增殖活力，增加對安定的清除能力[11]。且NAC處理細胞后，能降低重金屬造成的氧化應激性損傷，抑制線粒體膜電勢崩塌以及細胞色素C的釋放，降低細胞凋亡應答[12]。從我們的實驗結果可知，在微囊化細胞培養過程中添加NAC和GSH，一定程度上起到了降低細胞氧化性損傷的作用，從而保存了細胞活力和功能。另外，本研究顯示，與GSH相比，NAC可使細胞在微囊環境下具有相對較好的活力狀態，且在提高白蛋白水平方面，GSH效果也不如NAC明顯。這可能是由于NAC可減少炎性細胞因子、趨化因子產生[12]，間接改善細胞狀態，而且兩者在分子量上的差異并因此造成的在微囊膜孔及囊內擴散率上的不同，可能也是造成NAC在調控效果上優于GSH原因。
4 結論
微囊內存在氧化應激因素，能誘導氧化應激基因HO-1和GST-A1表達增高；NAC和GSH能在一定程度上緩解此類應激環境對細胞活性的抑制作用，提高白蛋白合成。以上實驗結果，將有助于了解微囊微環境對細胞生長代謝影響的具體機制，為微囊化技術改進和實際應用提供實驗依據。
引言
細胞微囊化是將細胞包埋在具半透膜性質的微囊膜內并保持其活性的過程，囊內細胞呈三維立體多細胞聚集生長，更接近在體組織特性，在異體移植[1]、大規模培養[2]、藥物控釋篩選[3]等領域廣泛應用。但微囊化細胞依然存在囊內細胞壞死、增殖速率降低、生長延遲期增加等問題。這些問題的解決依賴于對微囊環境及囊內細胞行為的充分認識。
近年來，雖然研究者們從物質傳遞方面對微囊環境進行了探索，對微囊化細胞代謝規律有了初步認識，但因微囊微環境的復雜性而使結果相對局限。現在研究發現，除了物質傳遞因素外，微囊化過程中還存在多種“脅迫”應激因素，如熱“脅迫”、氧化“脅迫”、滲透壓“脅迫”等，這些應激因素可通過誘導基因表達和相關信號傳遞，調控囊內細胞生長和功能[4-7]。但目前相關研究多建立于微生物模型如微囊化酵母細胞，在動物細胞微囊化中的研究少見報道。而事實上微生物生長代謝規律有異于哺乳動物細胞，且動物細胞對外界環境變化更為敏感。如我實驗室發現，微囊化HepG2細胞滲透壓相關應激基因表達增高，并出現代謝通量改變[6]。鑒于微囊中影響因素眾多，是否還有其他應激基因表達改變并對細胞生長發揮調控作用尚不可知，因此有必要以微囊化動物細胞為模型，對微囊微環境以及相關應激反應進行考察，以便為微囊化技術改進和應用提供更多數據。
鑒于以上情況，本文選擇以HepG2為模型,以平面細胞為參照,考察微囊化對氧化應激相關的血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽轉硫酶-A1 (glutathione S-transferases-A1,GST-A1)基因表達的影響，同時添加抗氧化物質即還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)進行外源性干預，以了解囊內細胞生存狀態，為優化微囊化細胞培養提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗用人肝癌細胞株HepG2購自ATCC，海藻酸鈉、聚賴氨酸、胰蛋白酶、Hoechst 33258、還原型谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸購自Sigma公司，白蛋白檢測試劑盒購自Bethyl公司，Trizol裂解液、RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，MEM培養液購自Hyclone公司，胎牛血清購自北京元亨圣馬生物技術研究所，其他試劑均為國產分析純。實驗儀器包括YD-4型微膠囊靜電液滴發生器(中國科學院大連化學物理研究所)、CX31數碼圖像采集系統(日本Olympus公司)、PCR 儀(德國Eppendorf公司)、微量紫外定量分析儀(日本NanoDrop公司)、全自動酶標儀(芬蘭Labsystems公司)和LS55熒光分光光度計(英國PerkinElmer公司)。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
平面細胞：HepG2細胞用MEM培養液(15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 mmol/L丙酮酸鈉)5% CO2細胞培養箱中常規培養。微囊化細胞：細胞生長至對數期，用0.25%胰酶消化離心收集，懸浮于1.5% (w/v)海藻酸鈉溶液，細胞密度2×109 /L。利用微囊靜電液滴發生器噴入0.1 mol/L CaCl2溶液形成海藻酸鈣膠珠，電壓400 V，頻率0.05 Hz，脈寬2 ms，然后用0.05% (w/v)多聚賴氨酸包裹，再與0.15% (w/v)海藻酸鈉溶液反應，最后用55 mmol/L檸檬酸鈉溶液液化，微囊直徑為(300±50) μm。獲得微囊化HepG2細胞37 ℃、5% CO2培養箱中培養。
1.2.2 細胞形態學觀察
用相差顯微鏡觀察微囊化細胞生長狀態。
1.2.3 MTT法測定細胞活性
平面細胞：待測孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，PBS 溶液配制，4 ℃避光保存)，37 ℃培養4 h，鏡下觀察有不溶性甲臜顆粒生成，棄上清加入200 μL DMSO溶解結晶。微囊化細胞：待測孔加入100 μL MTT 溶液，37 ℃ 孵育24 h 后篩網過濾收集微囊，溶于1 mL DMSO 溶液。檢測時吸取平面細胞或微囊化細胞紫色DMSO溶解上清液100 μL，置酶標儀測定每孔OD 值，測定波長570 nm，參考波長620 nm。
1.2.4 DNA分析法測定細胞數量
平面細胞胰酶消化后用含proteinase K裂解液50 ℃孵育12 h，釋放DNA；微囊化細胞用PBS清洗破囊，加入含proteinase K裂解液釋放DNA。加入熒光染料Hoechst 33258，測定熒光光度值變化(Ex=355 nm，Em=460 nm)，根據細胞數和DNA熒光光度標準曲線確定細胞數。
1.2.5 ELISA檢測白蛋白分泌水平
白蛋白檢測依試劑說明書，每檢測孔加100 μL樣品或標準品，用酶標儀測定450 nm的吸光度值。
1.2.6 NAC和GSH對細胞生長和蛋白合成影響
分別配置含有不同濃度NAC (1、2、5、10 mmol/L) 和GSH (1、2、5、10 mmol/L) 的培養液，培養微囊化細胞或平面細胞。于培養不同時間留取上清，檢測白蛋白含量，MTT法測定細胞活性，DNA分析法測定細胞數量。
1.2.7 real time-PCR檢測基因表達
提取細胞總RNA，兩步法反轉錄和實時PCR，反轉錄條件37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s；實時PCR條件：預變性95 ℃ 30 s，PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，擴增40個循環，引物設計如表 1所示。
表1
基因引物設計
Table1.
Prime sequences of different gene detected by PCR
1.3 統計學分析
實驗所涉及數據用
2 結果
2.1 微囊化細胞生長情況
如圖 1中所示，微囊化細胞在制備初期生長相對緩慢,且以數個分散細胞團的方式進行聚團，逐漸匯集。隨著培養時間延長，逐漸形成大小不同的細胞聚集體，并向微囊中心遷移，到培養第13 d細胞團大小達到100 μm左右，并在培養第23 d時聚集成較大細胞團，占據大部分囊內空間。
圖1
微囊化HepG2細胞生長方式
Figure1.
The growth profile of microencapsulated HepG2 cells
2.2 微囊化培養對氧化應激基因表達影響
培養第6 d和第16 d時，微囊化細胞HO-1表達水平分別為平面細胞的4.9倍和3.1倍，而GST-A1表達水平則為同天數下平面細胞的11.2和33倍，由結果可知，兩種氧化應激基因的表達均在微囊內出現了顯著增高(P＜0.05)。
2.3 NAC和GSH對不同培養方式下HepG2活性及白蛋白分泌的影響
針對以上實驗結果，向培養液中分別添加NAC和GSH，以考察不同抗氧化物質對HepG2細胞生長及功能產物白蛋白分泌的影響。
NAC是一種含巰基小分子氨基酸衍生物，作為谷胱甘肽合成前體進入細胞，經脫乙酰基促進GSH合成。GSH是胞內主要抗氧化物質，主要通過其巰基結構穩定生物大分子功能以降低活性氧攻擊造成的損傷，具有抗氧化以及干擾和清除自由基生成等作用，是調節胞內氧化還原狀態的關鍵。添加NAC后，平面細胞結果如表 2所示。NAC在1 ~10 mmol/L濃度范圍內對平面細胞活性并無顯著提升，雖然在培養后期10 mmol/L NAC能使HepG2細胞活性出現小幅度上升，但差異并無統計學意義。同時也未發現平面細胞NAC各濃度組白蛋白水平顯著變化，說明NAC的添加對平面培養下HepG2細胞的活性和功能產物分泌均無顯著效果。但如表 3所示，對于微囊化細胞，NAC濃度在5~10 mmol/L時使細胞活性出現增高，從第3 d開始，細胞活性上升了40%~70%(P＜0.05)。與此結果類似，從第5 d開始5~10 mmol/L NAC使微囊化細胞白蛋白水平增加約20%~30%(P＜0.05)，且隨培養時間延長，趨勢更為明顯。
表2
NAC對平面HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table2.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表3
NAC對微囊HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table3.
Effect of NAC on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
與NAC結果一致的是，由表 4可知，在平面細胞中GSH對細胞活性和白蛋白分泌同樣無顯著效果。而在微囊中(見表 5)，自第5 d起囊內細胞活性增加20%~55%，白蛋白水平增加15%~40%，但這種改善效果僅在10 mmol/L 時具有統計學意義(P＜0.05)。
表4
GSH對平面HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table4.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of monolayer HepG2 cells
表5
GSH對微囊HepG2細胞增殖和白蛋白水平的影響
Table5.
Effect of GSH on proliferation and albumin level of microencapsualted HepG2 cells
3 討論
隨著生物技術和膜技術研究不斷深入,微膠囊已在固定化培養、藥物控釋篩選、人工器官及基因運載等領域廣泛應用。但微囊微環境對囊內細胞影響機制尚不清楚，制約了該技術的改進和應用。近年研究結果顯示，微囊化細胞特殊行為可能是囊內多種應激脅迫因素作用的結果，但其中涉及的作用方式和機制尚不清晰[4]，為此，我們選擇了與氧化應激相關的HO-1和GST-A1基因進行研究，考察其在囊內表達變化，以便為相關機制研究提供實驗依據。
HO-1是廣泛存在的抗氧化防御酶，在缺氧、熱休克、過氧化氫等誘導的氧化應激反應中表達上調，以加強細胞對氧化應激的抵抗性[7]。而GST-A1則是GST超家族中一員，其編碼蛋白參與催化GSH巰基反應。GST-A1通過抑制微粒體過氧化、修復自由基膜磷脂損傷等途徑，解除氧化應激誘變劑損傷效果，是Nrf2/ARE下游重要抗氧化應激分子[8]。
實驗中發現，以上基因在微囊化細胞中均出現表達增高，表明囊內存在氧化應激因素，其產生原因可能來自以下幾個。首先是微囊制作過程中存在的高壓脈沖靜電場和Ca2+的沖擊。高壓靜電可使H2O分解，其中OH-在電場作用下被水中O2獲得形成超氧負離子。同時，電場也會直接破壞胞膜兩側電荷平衡，提高胞內過氧化氫和超氧負離子含量，氧化胞膜上的不飽和脂肪酸，使其產生相變而降低膜流動性，從而激發胞內氧化應激反應[9]。而微囊鈣化過程中的Ca2+可提高黃嘌呤氧化酶活性，一方面促進烷自由基向脂質過氧化物的轉換得以繼續，產生新的自由基，另一方面促進OH-轉化，重新激發自由基連鎖反應，造成瀑布式的氧化應激應答，而 Ca2+內流在線粒體內聚集同樣會造成黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性復合物途徑被過度利用，誘發氧化應激[10]。因此在以上因素影響下，微囊化細胞抗氧化應激基因表達出現上調，其主要目的是保護細胞，啟動氧化應激防御以減輕細胞損傷。
其次，除了微囊制備條件影響外，HO-1和GST-A1的表達改變還可能是囊內細胞三維生長方式影響的結果。Brian等發現三維細胞球中HO-1表達高出平面細胞13倍以上[7]，而Chang等[8]在旋轉反應器培養的細胞球中也發現了GST-A1的表達上調。研究者們認為，這一方面與細胞間接觸和緊密結構的形成有關，另一方面也是細胞在底物和氧氣缺乏下的生長維持需要[7-8]。考慮到微囊結構對物質擴散的影響[4]，HO-1和GST-A1表達上調可能也與囊內細胞在物質擴散受限條件下的生存維持有關。
針對以上結果，我們在培養液中添加兩種抗氧化物NAC和GSH，以考察其作為外源性調控因子在微囊化條件培養中的應用價值。GSH和NAC能夠改善氧化應激狀態下的細胞功能，可通過清除自由基維持細胞氧化還原平衡，抑制活性氧致突變性，并可作用于信號轉導過程，調整細胞因子生成釋放，調節DNA修復，保護細胞正常生長和增殖[11]。以往研究顯示，在肝衰血清中加入NAC和GSH，不但對細胞無生物毒性，相反可改善細胞增殖活力，增加對安定的清除能力[11]。且NAC處理細胞后，能降低重金屬造成的氧化應激性損傷，抑制線粒體膜電勢崩塌以及細胞色素C的釋放，降低細胞凋亡應答[12]。從我們的實驗結果可知，在微囊化細胞培養過程中添加NAC和GSH，一定程度上起到了降低細胞氧化性損傷的作用，從而保存了細胞活力和功能。另外，本研究顯示，與GSH相比，NAC可使細胞在微囊環境下具有相對較好的活力狀態，且在提高白蛋白水平方面，GSH效果也不如NAC明顯。這可能是由于NAC可減少炎性細胞因子、趨化因子產生[12]，間接改善細胞狀態，而且兩者在分子量上的差異并因此造成的在微囊膜孔及囊內擴散率上的不同，可能也是造成NAC在調控效果上優于GSH原因。
4 結論
微囊內存在氧化應激因素，能誘導氧化應激基因HO-1和GST-A1表達增高；NAC和GSH能在一定程度上緩解此類應激環境對細胞活性的抑制作用，提高白蛋白合成。以上實驗結果，將有助于了解微囊微環境對細胞生長代謝影響的具體機制，為微囊化技術改進和實際應用提供實驗依據。
