設計一種新型的冷凍水浴型夾具,用于解決大鼠跟腱力學測試的問題。以SD大鼠肌肉-跟腱-跟骨為單元的樣本隨機分成A、B兩組。A組:大鼠跟腱樣本采用設計的新型水浴型冷凍夾具;B組:大鼠跟腱樣本采用傳統非水浴冷凍夾具。結果顯示,在力學測試過程中,A組樣本無一滑脫,跟腱處于生理活性狀態;B組樣本有一根滑脫,其他樣本跟腱有明顯被冷凍現象。A組樣本平均最大應力、最大斷裂點位移以及楊氏模量較B組差異均有統計學意義(P＜0.05)。實驗結果表明,新的冷凍水浴型夾具優于傳統非水浴條件冷凍夾具,能夠更好地模擬體內環境條件測試跟腱的力學性質。
引用本文： 劉二福, 孫妍君, 彭永金, 徐偉, 王業全, 許康, MOHANADKhalidAhmed, 呂永鋼, 楊力. 一種新型水浴冷凍夾具在大鼠跟腱力學測試中的應用. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(3): 678-681. doi: 10.7507/1001-5515.20140126 復制
引言
大鼠跟腱作為肌腱組織工程的損傷動物模型，手術簡單易于操作，花費相對較少，得到了越來越多研究者的青睞[1-4]。受損后跟腱修復的檢測，最簡捷和最有效的方式是對跟腱組織的力學拉伸測試。但由于肌腱組織具有黏彈性，以往的夾持方法不能很好地滿足測試需求[5]。因此，如何模擬體內環境固定肌腱進行力學性質測定，一直是很多學者關注的問題[6]。
對軟組織末端直接夾持進行拉伸時，由于軟組織的特殊性質，樣本容易滑脫。以往防止滑脫通常是設法增大表面摩擦力，如在夾具與樣本之間加多層紙張、夾具表面做成溝槽狀、增大夾具的夾持力等[7-9]。上述方法盡管減少了樣本滑脫，但在夾具夾持區域，常常出現應力集中，導致樣本末端被夾持部位的提前斷裂。為了防止上述問題，研究者不再采用對樣本直接夾持的方法，而是對樣本末端進行縫合、包埋等，此法雖然避免了應力集中，但是會對樣本造成一定程度的破壞。
Riemersa 等[8]首先采用冷凍夾具固定肌腱兩端，測得馬的腳趾屈肌肌腱最大斷裂受力為10 200 N。Sharkey等[10]在Riemersa的基礎上改進了夾具，用液氮代替干冰作為制冷劑，提供了更低的溫度，測得牛股四頭肌的斷裂受力為3 500 N。由于樣本含有大量水分，當干冰或者液氮等制冷劑作用于樣本末端時，末端會與夾具凍結成為一個整體，力學測試時就不會出現滑脫現象。但是由于制冷劑造成的低溫環境，所測得的樣本力學數據也就不能表現出體內環境條件下的性質。
大鼠跟腱的長度較短，只有10 mm左右，進行力學測試時不論是脫水還是冷凍末端處理都不適合。但是，跟腱一端是跟骨，另一端是肌肉，因此可以將跟骨和冷凍肌肉作為直接受力兩端，間接測試跟腱。Wieloch等[9]將大鼠冷凍的肌肉-跟腱-跟骨作為一個受力單位，測得大鼠跟腱最大斷裂力為(48±11)N，最大伸長量為(0.8±0.2) mm。 由于在力學加載時液氮直接冷凍肌肉端，一方面肌肉端可能未完全冷凍，導致加載時肌肉變形或者樣本從肌肉端滑脫；另一方面跟腱在加載時可能處于低溫冷凍環境，從而影響樣本測試結果。
因此，本研究設計了一種新的冷凍夾具成功用于測試大鼠跟腱，并得到模擬生理條件下的跟腱力學性質，所獲得的跟腱力學測試結果更加符合體內環境下的性質。
1 材料和方法
1.1 實驗材料和工具
1.1.1 設計冷凍夾具所用材料和工具
新型水浴冷凍裝置所有部件由鋁合金制成，并使用6 mm×35 mm錐銷來連接夾芯，所用工具為車床、電鉆、切割機等。
1.1.2 實驗動物與力學裝置
7只220 g左右的SD大鼠(大坪國家動物實驗室，重慶)，外科手術器械、燒杯、游標卡尺、鑷子、液氮罐、生理鹽水、Instron1011材料試驗機(Instron,美國)、設計的冷凍夾具等。
1.2 水浴型冷凍夾具的設計
一種新的應用于小動物跟腱拉伸的水浴型冷凍夾具(見圖 1)，包括連接拉伸機臺面且安裝有下夾件的下固定件和連接拉伸機升高件且安裝有上夾件的上固定件，下固定件上安裝的密封套管水浴鍋與下夾件之間形成容納生理鹽水的水浴腔，上固定件安裝有環繞上夾件的具有活塞的液氮容器。將小動物跟腱肌肉端固定在夾芯中，可以防止在拉伸的過程中樣品脫落。液氮容器與上固定件通過螺紋可調連接。調節上固定件與液氮容器的相對位置，可以控制夾芯的冷凍溫度。水浴腔的深度可調，可以使樣品盡可能地處于水浴中。預先冷凍的樣本裝入上夾件，然后倒入制冷劑液氮，夾具由導熱性能良好的鋁合金制作，從而使上夾件處于持續低溫冷凍狀態，防止了樣本肌肉端的融化。樣本跟腱置于37 ℃生理鹽水中，跟腱由冷凍狀態轉變為常溫狀態，模擬了跟腱在體時的生理狀態。
圖1
水浴型冷凍夾具設計圖
Figure1.
Design of the water bath cryo-jaw
1.3 大鼠跟腱試驗
7只220 g左右的SD大鼠得到14根跟腱單元，去除多余的成分，測量跟腱的長、寬、厚度，將14份樣本隨機分成A組和B組，每組7例，A組采用本文裝置，B組采用傳統的冷凍夾具。修剪肌肉組織，使得符合試驗測試要求，啟動加載：啟動Instron儀器，以10 mm/min的速度加載。
1.4 統計學分析
采用Origin8.0軟件進行統計處理，數據以
2 結果
2.1 樣品處理結果與加載狀態
修剪后的跟腱[見圖(2a)]長(6.50±0.20) mm，寬(2.60±0.10) mm，厚(1.10±0.10 ) mm。樣品裝入夾芯[見圖 2(b)]，其中A組樣本在-80 ℃冰箱預冷凍。樣品冷凍與裝置預冷后，安裝到Instron上，啟動加載。A組預冷后的樣本跟腱置于37 ℃生理鹽水中[見圖 2(c)]，B組樣本不給予預冷凍，只在加載前在夾具上用液氮冷凍，也沒有采用生理鹽水容器[見圖 2(d)]。
圖2
樣品處理及加載狀態
(a)跟腱的預處理和測量;(b)跟腱固定于夾芯;(c)A組樣本加載時的狀態;(d)B組樣本加載時的狀態
Figure2. Sample manage and the condition of loading(a) the pretreatment and measurement of the achilles tendon; (b) the achilles tendon fixed in the clamp; (c) the loading state of the Group A; (d) the loading state of the Group B
2.2 力學測試結果
A組跟腱實驗過程中無一滑脫；B組跟腱實驗過程中有一根滑脫，并且所有跟腱部分處于冷凍狀態。A、B兩組力學測試數據的比較如圖 3所示。其中A組最大斷裂力、最大斷裂位移、楊氏模量、應力均顯著高于B組 (P＜0.05)。A組應變與B組的差異無統計學意義(P＞0.05)。
圖3
力學測試結果
(a)力-位移曲線；(b)斷裂應變的比較；(c)斷裂應力的比較；(d)楊氏模量的比較。*
(a) the force-displacement curve; (b) the comparison of the elongation at break; (c) the comparison of the ultimate tensile strength; (d) the comparison of the Young’s modulous. *
3 討論
小動物跟腱模型力學測試越來越受到科技工作者的重視。傳統小動物力學測試對軟組織末端直接夾持進行拉伸，由于軟組織的特殊性質樣本容易滑脫，影響試驗的進行。同時，傳統夾具采用低溫冷凍劑固定測試樣品，不能真實地反映測試樣品的生理學性質。因此，新型夾具的設計為小動物力學測試提供了保障。新設計的冷凍水浴型夾具，能夠很好地測試跟腱組織的力學性質，不僅成功避免了跟腱拉伸過程中遇到的樣本滑脫和應力集中現象，而且成功模擬了跟腱在體的受力環境。
通過A、B兩組實驗結果分析，由于A組跟腱肌肉端與夾芯預先完全冷凍，所以加載時樣本無滑脫現象，并且由于加載時跟腱置于37 ℃生理鹽水中，保證了跟腱不會處于冷凍狀態。而B組采用液氮加載前冷凍，冷凍時間的長短直接影響樣本的狀態，冷凍時間較長時，雖然肌肉端可能被完全冷凍，但是跟腱也會被冷凍，加載得到的力學數據是冷凍的跟腱的性質，而不是活性狀態下的性質；當液氮冷凍時間較短時，由于肌肉端與夾芯未完全冷凍，肌肉端會變形從而發生滑脫。所以B組加載時出現了滑脫和跟腱冷凍現象，造成加載時樣本不是處于相同狀態，從而使得加載數據偏差較大。由此可知，采用A組的實驗裝置和方法，效果明顯好于B組。
Instron和Bose公司作為世界兩大力學測試儀器供應商，以其儀器產品的精度高、穩定性好、夾具的多樣性而聞名，但是其產品價格昂貴，并且沒有針對小動物跟腱的夾具。本實驗裝置價格低，能較好地測試小動物跟腱的力學性質，且較真實地反映了跟腱的生理活性狀態，具有一定的應用價值。
引言
大鼠跟腱作為肌腱組織工程的損傷動物模型，手術簡單易于操作，花費相對較少，得到了越來越多研究者的青睞[1-4]。受損后跟腱修復的檢測，最簡捷和最有效的方式是對跟腱組織的力學拉伸測試。但由于肌腱組織具有黏彈性，以往的夾持方法不能很好地滿足測試需求[5]。因此，如何模擬體內環境固定肌腱進行力學性質測定，一直是很多學者關注的問題[6]。
對軟組織末端直接夾持進行拉伸時，由于軟組織的特殊性質，樣本容易滑脫。以往防止滑脫通常是設法增大表面摩擦力，如在夾具與樣本之間加多層紙張、夾具表面做成溝槽狀、增大夾具的夾持力等[7-9]。上述方法盡管減少了樣本滑脫，但在夾具夾持區域，常常出現應力集中，導致樣本末端被夾持部位的提前斷裂。為了防止上述問題，研究者不再采用對樣本直接夾持的方法，而是對樣本末端進行縫合、包埋等，此法雖然避免了應力集中，但是會對樣本造成一定程度的破壞。
Riemersa 等[8]首先采用冷凍夾具固定肌腱兩端，測得馬的腳趾屈肌肌腱最大斷裂受力為10 200 N。Sharkey等[10]在Riemersa的基礎上改進了夾具，用液氮代替干冰作為制冷劑，提供了更低的溫度，測得牛股四頭肌的斷裂受力為3 500 N。由于樣本含有大量水分，當干冰或者液氮等制冷劑作用于樣本末端時，末端會與夾具凍結成為一個整體，力學測試時就不會出現滑脫現象。但是由于制冷劑造成的低溫環境，所測得的樣本力學數據也就不能表現出體內環境條件下的性質。
大鼠跟腱的長度較短，只有10 mm左右，進行力學測試時不論是脫水還是冷凍末端處理都不適合。但是，跟腱一端是跟骨，另一端是肌肉，因此可以將跟骨和冷凍肌肉作為直接受力兩端，間接測試跟腱。Wieloch等[9]將大鼠冷凍的肌肉-跟腱-跟骨作為一個受力單位，測得大鼠跟腱最大斷裂力為(48±11)N，最大伸長量為(0.8±0.2) mm。 由于在力學加載時液氮直接冷凍肌肉端，一方面肌肉端可能未完全冷凍，導致加載時肌肉變形或者樣本從肌肉端滑脫；另一方面跟腱在加載時可能處于低溫冷凍環境，從而影響樣本測試結果。
因此，本研究設計了一種新的冷凍夾具成功用于測試大鼠跟腱，并得到模擬生理條件下的跟腱力學性質，所獲得的跟腱力學測試結果更加符合體內環境下的性質。
1 材料和方法
1.1 實驗材料和工具
1.1.1 設計冷凍夾具所用材料和工具
新型水浴冷凍裝置所有部件由鋁合金制成，并使用6 mm×35 mm錐銷來連接夾芯，所用工具為車床、電鉆、切割機等。
1.1.2 實驗動物與力學裝置
7只220 g左右的SD大鼠(大坪國家動物實驗室，重慶)，外科手術器械、燒杯、游標卡尺、鑷子、液氮罐、生理鹽水、Instron1011材料試驗機(Instron,美國)、設計的冷凍夾具等。
1.2 水浴型冷凍夾具的設計
一種新的應用于小動物跟腱拉伸的水浴型冷凍夾具(見圖 1)，包括連接拉伸機臺面且安裝有下夾件的下固定件和連接拉伸機升高件且安裝有上夾件的上固定件，下固定件上安裝的密封套管水浴鍋與下夾件之間形成容納生理鹽水的水浴腔，上固定件安裝有環繞上夾件的具有活塞的液氮容器。將小動物跟腱肌肉端固定在夾芯中，可以防止在拉伸的過程中樣品脫落。液氮容器與上固定件通過螺紋可調連接。調節上固定件與液氮容器的相對位置，可以控制夾芯的冷凍溫度。水浴腔的深度可調，可以使樣品盡可能地處于水浴中。預先冷凍的樣本裝入上夾件，然后倒入制冷劑液氮，夾具由導熱性能良好的鋁合金制作，從而使上夾件處于持續低溫冷凍狀態，防止了樣本肌肉端的融化。樣本跟腱置于37 ℃生理鹽水中，跟腱由冷凍狀態轉變為常溫狀態，模擬了跟腱在體時的生理狀態。
圖1
水浴型冷凍夾具設計圖
Figure1.
Design of the water bath cryo-jaw
1.3 大鼠跟腱試驗
7只220 g左右的SD大鼠得到14根跟腱單元，去除多余的成分，測量跟腱的長、寬、厚度，將14份樣本隨機分成A組和B組，每組7例，A組采用本文裝置，B組采用傳統的冷凍夾具。修剪肌肉組織，使得符合試驗測試要求，啟動加載：啟動Instron儀器，以10 mm/min的速度加載。
1.4 統計學分析
采用Origin8.0軟件進行統計處理，數據以
2 結果
2.1 樣品處理結果與加載狀態
修剪后的跟腱[見圖(2a)]長(6.50±0.20) mm，寬(2.60±0.10) mm，厚(1.10±0.10 ) mm。樣品裝入夾芯[見圖 2(b)]，其中A組樣本在-80 ℃冰箱預冷凍。樣品冷凍與裝置預冷后，安裝到Instron上，啟動加載。A組預冷后的樣本跟腱置于37 ℃生理鹽水中[見圖 2(c)]，B組樣本不給予預冷凍，只在加載前在夾具上用液氮冷凍，也沒有采用生理鹽水容器[見圖 2(d)]。
圖2
樣品處理及加載狀態
(a)跟腱的預處理和測量;(b)跟腱固定于夾芯;(c)A組樣本加載時的狀態;(d)B組樣本加載時的狀態
Figure2. Sample manage and the condition of loading(a) the pretreatment and measurement of the achilles tendon; (b) the achilles tendon fixed in the clamp; (c) the loading state of the Group A; (d) the loading state of the Group B
2.2 力學測試結果
A組跟腱實驗過程中無一滑脫；B組跟腱實驗過程中有一根滑脫，并且所有跟腱部分處于冷凍狀態。A、B兩組力學測試數據的比較如圖 3所示。其中A組最大斷裂力、最大斷裂位移、楊氏模量、應力均顯著高于B組 (P＜0.05)。A組應變與B組的差異無統計學意義(P＞0.05)。
圖3
力學測試結果
(a)力-位移曲線；(b)斷裂應變的比較；(c)斷裂應力的比較；(d)楊氏模量的比較。*
(a) the force-displacement curve; (b) the comparison of the elongation at break; (c) the comparison of the ultimate tensile strength; (d) the comparison of the Young’s modulous. *
3 討論
小動物跟腱模型力學測試越來越受到科技工作者的重視。傳統小動物力學測試對軟組織末端直接夾持進行拉伸，由于軟組織的特殊性質樣本容易滑脫，影響試驗的進行。同時，傳統夾具采用低溫冷凍劑固定測試樣品，不能真實地反映測試樣品的生理學性質。因此，新型夾具的設計為小動物力學測試提供了保障。新設計的冷凍水浴型夾具，能夠很好地測試跟腱組織的力學性質，不僅成功避免了跟腱拉伸過程中遇到的樣本滑脫和應力集中現象，而且成功模擬了跟腱在體的受力環境。
通過A、B兩組實驗結果分析，由于A組跟腱肌肉端與夾芯預先完全冷凍，所以加載時樣本無滑脫現象，并且由于加載時跟腱置于37 ℃生理鹽水中，保證了跟腱不會處于冷凍狀態。而B組采用液氮加載前冷凍，冷凍時間的長短直接影響樣本的狀態，冷凍時間較長時，雖然肌肉端可能被完全冷凍，但是跟腱也會被冷凍，加載得到的力學數據是冷凍的跟腱的性質，而不是活性狀態下的性質；當液氮冷凍時間較短時，由于肌肉端與夾芯未完全冷凍，肌肉端會變形從而發生滑脫。所以B組加載時出現了滑脫和跟腱冷凍現象，造成加載時樣本不是處于相同狀態，從而使得加載數據偏差較大。由此可知，采用A組的實驗裝置和方法，效果明顯好于B組。
Instron和Bose公司作為世界兩大力學測試儀器供應商，以其儀器產品的精度高、穩定性好、夾具的多樣性而聞名，但是其產品價格昂貴，并且沒有針對小動物跟腱的夾具。本實驗裝置價格低，能較好地測試小動物跟腱的力學性質，且較真實地反映了跟腱的生理活性狀態，具有一定的應用價值。
