本文旨在通過對去細胞化天然材料進行肝素化修飾, 改善其作為組織工程支架材料的抗凝血性能。本文以豬肝去細胞化材料為研究對象, 對材料分別進行了層層自組裝(LBL)肝素化修飾、多點連接(MPA)肝素化修飾或末端連接(EPA)肝素化修飾, 然后檢測它們的肝素化效果及抗凝血性能。結果表明, 三種肝素化修飾材料的抗凝血性能與未經處理的去細胞化材料相比均有顯著提高, 其中EPA修飾肝素化材料的凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)均超過檢測儀器最大值。同時, EPA修飾肝素化去細胞化材料修飾時間最短, 肝素釋放最慢, 復鈣時間最長。本研究結果顯示EPA肝素化修飾的去細胞化材料獲得了良好的抗凝血性能。
引用本文： 包驥, 孫赳, 周永杰, 吳瓊, 王宇嘉, 李麗, 姜鑫, 馬朗, 謝明均, 石毓君, 步宏. 去細胞化支架材料肝素化修飾及抗凝性能研究. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(3): 594-598. doi: 10.7507/1001-5515.20150108 復制
引言
去細胞化生物材料作為組織工程支架材料，已被廣泛應用于基礎研究和臨床治療。它具有良好的生物相容性和組織三維結構，解決了細胞植入位點和血液供應兩大難題，是理想的組織工程支架材料。豬肝臟容易獲取，大小與人肝接近，是構建具有臨床應用前景的組織工程肝臟最佳的去細胞化支架來源。但是，豬肝比以往組織工程技術報道的心瓣膜[1]、心包補片[2]、血管[3]、神經支架[4]、膀胱等材料具有更復雜的結構，接收雙重血供，有豐富的肝血竇，而且整個器官與血液接觸緊密，更易因膠原暴露激活內源性凝血途徑而產生血液凝固。為解決去細胞化材料植入體內的血液相容性問題，本文以豬肝去細胞材料為例，對其進行肝素抗凝修飾的研究，希望改善材料的血液相容性，以便將其運用到更廣泛的組織工程領域。
1 材料與方法
1.1 動物、主要試劑及儀器設備
實驗用巴馬香豬由四川大學華西醫院實驗動物中心提供，3月齡，體重15 kg。肝素鈉(成都市科龍化工試劑廠)，1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydro-chloride, EDC, TOSHIMA公司)，聚二甲基二烯丙基氯化銨(polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride, PDADMAC, SIGEMA-ALDRIH公司)，氰基硼氫化鈉(NaBH3CN, 成都市科龍化工試劑廠)。酶標儀(BIOTEK, 美國)，CA-50半自動血凝儀(SYSMEX, 日本)。
1.2 去細胞化豬肝材料的制備
氯胺酮肌注麻醉后，備皮，消毒鋪巾，逐層開腹進入腹腔，仔細解剖肝十二指腸韌帶，分離門靜脈并帶線。結扎并離斷肝胃韌帶、肝動脈、膽總管。結扎門靜脈遠端，在近端剪開一小口置入硅膠導管并固定，立即行0.1%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)液體灌注，同時離斷肝周韌帶，取出肝臟，置于無菌容器內繼續灌注，至肝臟內血液完全流盡，-20℃保存。肝臟在4℃解凍后，用1%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecylsulphate, SDS)溶液以200 mL/min流速灌注9 h，之后1% Triton X-100溶液和去離子水灌洗去除殘留SDS，獲得去細胞化豬肝臟材料。將去細胞化豬肝材料制成厚度為300μm、直徑為1 cm的樣本，放入24孔板中，凍干后射線滅菌備用。本實驗所用去細胞化肝臟材料來自同一頭豬。根據肝素化修飾方式的不同，實驗組材料分為三組：層層自組裝修飾(layer-by-layer self-assembly, LBL)組、多點連接修飾(multi-point attachment, MPA)組和末端連接修飾(end-point attachment, EPA)組。對照組材料為未經肝素化修飾的去細胞化豬肝材料。
1.3 去細胞化豬肝材料肝素化修飾
1.3.1 LBL修飾
按照本組之前報道的LBL方法[5]。用無菌雙蒸水配制成1 g/L的PDADMAC溶液和2 g/L的肝素鈉溶液。將裝有材料的24孔板放置于定軌搖床上，每孔加入PDADMAC溶液1 mL，置于搖床搖動10 min后，靜置20 min。吸除PDADMAC溶液，加入無菌蒸餾水1 mL搖動洗滌10 min。吸除蒸餾水后加入肝素鈉溶液1 mL，搖動10 min，靜置20 min。吸除肝素鈉溶液，加入無菌蒸餾水，搖動洗滌10 min，吸除蒸餾水。重復上述步驟8次，最后吸盡孔板內液體，去離子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.2 MPA修飾
根據Wang等[6]報道的肝素化修飾方法。將裝有材料的24孔板放置于定軌搖床上，加入1 mol/L的硫酸羥胺鹽37℃搖動孵育12 h。吸除硫酸羥胺鹽溶液，用去離子化水漂洗3次，加入肝素鈉-EDC溶液(1.67 g EDC，0.835 g肝素鈉，0.05 mol/L鹽酸200 mL，調pH至1.5)，搖動48 h。吸除肝素鈉-EDC溶液，去離子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.3 EPA修飾
改進Tsai等[7]報道的肝素化修飾方法。用0℃去離子水配制300 mL濃度為3.3 g/L肝素鈉溶液，加入10 mg亞硝酸鈉，用1 mol/L鹽酸調節pH 2.7，攪拌2 h使肝素鈉解聚。用1 mol/L NaOH調節pH至7.0。聚肝素鈉溶液中加入氰基硼氫化鈉(10 mg/L)及NaCl(0.15 mol/L)，用1 mol/L鹽酸調節pH至3.5。向裝有材料的24孔板中每孔加入1 mL上述溶液，37℃靜置2 h。吸除溶液，去離子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.4 甲苯胺藍染色
將實驗組和對照組材料每組各取3個樣本，中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，用50 mg/L甲苯胺藍(toluidine blue, TB)水溶液染色15 min，Olympus光學顯微鏡下觀察拍照，定性檢測支架材料中肝素固定情況，有肝素固定區域染色呈藍色。
1.5 肝素鈉含量測定
將實驗組材料每組各取6個樣本，剪碎后分別放入1.5 mL微量冷凍管。向管中加入80μL TL緩沖液，再加入OB蛋白酶8μL，充分渦旋攪拌。將冷凍管放入55℃水浴鍋中孵育3 h。每20~30 min渦旋攪拌一次。1 000×g離心5 min。吸取上清液，根據劉秀英等[8]提出的方法測量肝素含量。
1.6 肝素釋放速率測定
參照Lu等[9]檢測肝素釋放速度方法，向裝有實驗組材料的24孔培養板每孔加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)2.5 mL，室溫下浸泡制備浸提液。在不同的浸泡時間取樣，用TB法檢測浸提液中的游離肝素量，除以材料中的肝素含量，即可計算肝素分子的釋放速率。
1.7 凝血時間檢測
按照Lv等[10]和Ran等[11]材料體外凝血時間檢測方法，取實驗組和對照組材料，每組6個平行樣，與健康人血漿在37℃孵育30 min后，血漿轉入凝血檢測專用透明硅化玻管，置入CA-50半自動血凝儀，按說明書使用相應試劑盒測定凝血酶時間(thrombin time, TT)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)。
1.8 復鈣時間測定
根據李沁華等[12]復鈣時間的檢測方法，實驗組和對照組每組材料6個平行樣，向裝有實驗組和對照組材料的24孔培養板的每孔中加入0.5 mL抗凝血漿和0.025 mol/L CaCl2溶液0.2 mL，于37℃恒溫水浴，秒表計時，當孔板內出現一絲纖狀物時停表，得到復鈣時間。
1.9 數據處理
數據用均值±標準差(
2 結果
2.1 TB染色
與對照組材料相比，實驗組材料均沿膠原基質表面藍染，內部區域呈淡染，EPA組材料膠原基質內部藍色較另兩組更深，如圖 1所示，表明實驗組材料上均成功固定有肝素。
圖1
三種肝素化修飾支架材料TB染色
Figure1.
TB staining of three kinds of heparin modified scaffolds
2.2 肝素含量
為了使后續抗凝性能研究數據具有可比性，通過對肝素化修飾條件的控制，使三種方法得到的肝素化修飾支架材料中肝素含量相近，LBL組為(24.81±0.12)μg/cm2，MPA組為(24.76±0.14)μg/cm2，EPA組為(25.03±0.15)μg/cm2，三組之間差異沒有統計學意義(P值均＞0.05)。
2.3 肝素釋放速率
如圖 2所示，實驗組各組材料前2 h肝素基本未釋放，在2~6 h迅速釋放，且LBL組釋放最快，EPA組釋放最慢，之后釋放速率逐漸減慢，趨于平穩。第168 h時三者釋放速率接近。EPA組釋放曲線最低，168 h后肝素剩余量最多(35.4%)；LBL組與MPA組曲線接近，168 h后肝素剩余量均為15%左右。
圖2
不同時間點支架材料的肝素累計釋放百分比
Figure2.
Heparin relative release percent of scaffolds in different time points
2.4 凝血指標
實驗組材料TT、PT、APTT值與對照組相比均有顯著增加(P＜0.05)，其中EPA組材料TT、PT、APTT值均超過設備測量值上限，如圖 3所示。結果表明，EPA組材料具有更好的抗凝性能。
圖3
各組材料的凝血指標
與對照組相比, *
Compared with the control group, *
2.5 復鈣時間
復鈣時間測定是在已除去Ca2+的血漿中重新加入Ca2+，測定血液出現凝固的時間即復鈣時間，其意義在于檢測內源凝血系統[13]。一般來講，復鈣時間越長，抗凝血性能越好。經測定實驗組材料的復鈣時間分別為：LBL組(236.1±15.5)s，MPA組(214±21.6)s，EPA組(312±28.5)s。三個實驗組材料復鈣時間均顯著長于對照組[(108.5±10.3)s](P＜0.001)，約為對照組材料復鈣時間的2倍，其中EPA組復鈣時間最長。
3 討論
去細胞化材料中含有大量暴露的膠原蛋白纖維，而膠原纖維暴露是血栓發生過程中的主要事件[14]。凝血過程包含一系列酶原的激活，最終將無活性的凝血酶原轉化為有活性的凝血酶，將可溶性的纖維蛋白轉化為不溶性的纖維蛋白從而引起血液凝固。而抗凝血酶Ⅲ是天然的抗血栓劑，是凝血過程的絲氨酸蛋白酶的抑制劑，并被認為是凝血酶的“自殺型”抑制劑[15]。肝素是帶負電的線形多聚糖，由兩個重復的雙糖單位(L-艾杜糖酸D-葡糖胺和D型乙酰葡糖胺)構成[16]。由于肝素獨特的結構，它可以與抗凝血酶Ⅲ形成復合物，從而結合活化的凝血因子，起到消除這些凝血因子的作用[17]。同大多數絲氨蛋白酶與抑制劑的反應相比，抗凝血酶Ⅲ與凝血酶的反應速度較慢，但在肝素存在的情況下，反應速度可增加幾千倍，能有效地抑制凝血過程，因此肝素被廣泛用作抗凝藥物[17]。在去細胞化材料表面進行肝素修飾，成為解決材料血液相容性問題的一種常用措施。
本文中，實驗組材料TB染色均為陽性，而對照組材料為陰性。EPA組的TB染色最深，而且藍色區域并非局限于細胞外基質(extracellular matrix, ECM)邊緣，而是深入ECM內部。MPA組和EPA組材料中的肝素共價結合于ECM[14]，而LBL組材料中肝素靠靜電吸引結合于ECM上[5]，前一種方式結合力更強，肝素結合較為牢固，釋放較為緩慢。進一步比較EPA組與MPA組材料，EPA組材料解聚后的肝素分子量更小[7]，更容易深入ECM內部，因而釋放更加緩慢。本組結果顯示EPA組材料的血液相容性獲得了最為顯著和穩定的改善。
在TT、PT和APTT測試過程中，去細胞化材料首先與富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)中纖維蛋白原等血漿蛋白接觸，此時材料表面吸附的血漿蛋白數量和牢固程度將直接影響隨后血液—材料間的相互作用，對測量結果產生影響。在EPA組材料中，肝素分子呈纖毛狀末端共價固定在ECM表面[7]，這樣纖維蛋白原首先吸附在了纖毛狀的肝素分子上，而非ECM表面，纖毛的擺動性使吸附上的纖維蛋白原很容易在后續的洗滌過程中被洗脫掉。因此，EPA組材料的TT、PT和APTT測量值都超出了機器檢測上限，同時，復鈣時間也最長，在體外實驗中表現出了優異的抗凝血性能。
在本研究中，我們探討了三種溫和反應條件下對去細胞化材料的肝素修飾方式。與對照組相比，實驗組材料的血液相容性均獲得了顯著改善，特別是EPA組材料的血液相容性各項指標都明顯優于其他兩種修飾方法。通過肝素化修飾改善可植入去細胞化材料的血液相容性，是一項重大的技術改進，具有廣闊的應用前景。當然，目前研究尚處于體外研究階段，該技術的安全性和有效性還有待體內實驗的進一步檢驗。
引言
去細胞化生物材料作為組織工程支架材料，已被廣泛應用于基礎研究和臨床治療。它具有良好的生物相容性和組織三維結構，解決了細胞植入位點和血液供應兩大難題，是理想的組織工程支架材料。豬肝臟容易獲取，大小與人肝接近，是構建具有臨床應用前景的組織工程肝臟最佳的去細胞化支架來源。但是，豬肝比以往組織工程技術報道的心瓣膜[1]、心包補片[2]、血管[3]、神經支架[4]、膀胱等材料具有更復雜的結構，接收雙重血供，有豐富的肝血竇，而且整個器官與血液接觸緊密，更易因膠原暴露激活內源性凝血途徑而產生血液凝固。為解決去細胞化材料植入體內的血液相容性問題，本文以豬肝去細胞材料為例，對其進行肝素抗凝修飾的研究，希望改善材料的血液相容性，以便將其運用到更廣泛的組織工程領域。
1 材料與方法
1.1 動物、主要試劑及儀器設備
實驗用巴馬香豬由四川大學華西醫院實驗動物中心提供，3月齡，體重15 kg。肝素鈉(成都市科龍化工試劑廠)，1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-3-dimethylaminopropylcarbodiimidehydro-chloride, EDC, TOSHIMA公司)，聚二甲基二烯丙基氯化銨(polyelectrolyte polydiallydimethylammonium chloride, PDADMAC, SIGEMA-ALDRIH公司)，氰基硼氫化鈉(NaBH3CN, 成都市科龍化工試劑廠)。酶標儀(BIOTEK, 美國)，CA-50半自動血凝儀(SYSMEX, 日本)。
1.2 去細胞化豬肝材料的制備
氯胺酮肌注麻醉后，備皮，消毒鋪巾，逐層開腹進入腹腔，仔細解剖肝十二指腸韌帶，分離門靜脈并帶線。結扎并離斷肝胃韌帶、肝動脈、膽總管。結扎門靜脈遠端，在近端剪開一小口置入硅膠導管并固定，立即行0.1%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)液體灌注，同時離斷肝周韌帶，取出肝臟，置于無菌容器內繼續灌注，至肝臟內血液完全流盡，-20℃保存。肝臟在4℃解凍后，用1%十二烷基磺酸鈉(sodium dodecylsulphate, SDS)溶液以200 mL/min流速灌注9 h，之后1% Triton X-100溶液和去離子水灌洗去除殘留SDS，獲得去細胞化豬肝臟材料。將去細胞化豬肝材料制成厚度為300μm、直徑為1 cm的樣本，放入24孔板中，凍干后射線滅菌備用。本實驗所用去細胞化肝臟材料來自同一頭豬。根據肝素化修飾方式的不同，實驗組材料分為三組：層層自組裝修飾(layer-by-layer self-assembly, LBL)組、多點連接修飾(multi-point attachment, MPA)組和末端連接修飾(end-point attachment, EPA)組。對照組材料為未經肝素化修飾的去細胞化豬肝材料。
1.3 去細胞化豬肝材料肝素化修飾
1.3.1 LBL修飾
按照本組之前報道的LBL方法[5]。用無菌雙蒸水配制成1 g/L的PDADMAC溶液和2 g/L的肝素鈉溶液。將裝有材料的24孔板放置于定軌搖床上，每孔加入PDADMAC溶液1 mL，置于搖床搖動10 min后，靜置20 min。吸除PDADMAC溶液，加入無菌蒸餾水1 mL搖動洗滌10 min。吸除蒸餾水后加入肝素鈉溶液1 mL，搖動10 min，靜置20 min。吸除肝素鈉溶液，加入無菌蒸餾水，搖動洗滌10 min，吸除蒸餾水。重復上述步驟8次，最后吸盡孔板內液體，去離子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.2 MPA修飾
根據Wang等[6]報道的肝素化修飾方法。將裝有材料的24孔板放置于定軌搖床上，加入1 mol/L的硫酸羥胺鹽37℃搖動孵育12 h。吸除硫酸羥胺鹽溶液，用去離子化水漂洗3次，加入肝素鈉-EDC溶液(1.67 g EDC，0.835 g肝素鈉，0.05 mol/L鹽酸200 mL，調pH至1.5)，搖動48 h。吸除肝素鈉-EDC溶液，去離子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.3.3 EPA修飾
改進Tsai等[7]報道的肝素化修飾方法。用0℃去離子水配制300 mL濃度為3.3 g/L肝素鈉溶液，加入10 mg亞硝酸鈉，用1 mol/L鹽酸調節pH 2.7，攪拌2 h使肝素鈉解聚。用1 mol/L NaOH調節pH至7.0。聚肝素鈉溶液中加入氰基硼氫化鈉(10 mg/L)及NaCl(0.15 mol/L)，用1 mol/L鹽酸調節pH至3.5。向裝有材料的24孔板中每孔加入1 mL上述溶液，37℃靜置2 h。吸除溶液，去離子化水漂洗2次，-20℃保存。
1.4 甲苯胺藍染色
將實驗組和對照組材料每組各取3個樣本，中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，用50 mg/L甲苯胺藍(toluidine blue, TB)水溶液染色15 min，Olympus光學顯微鏡下觀察拍照，定性檢測支架材料中肝素固定情況，有肝素固定區域染色呈藍色。
1.5 肝素鈉含量測定
將實驗組材料每組各取6個樣本，剪碎后分別放入1.5 mL微量冷凍管。向管中加入80μL TL緩沖液，再加入OB蛋白酶8μL，充分渦旋攪拌。將冷凍管放入55℃水浴鍋中孵育3 h。每20~30 min渦旋攪拌一次。1 000×g離心5 min。吸取上清液，根據劉秀英等[8]提出的方法測量肝素含量。
1.6 肝素釋放速率測定
參照Lu等[9]檢測肝素釋放速度方法，向裝有實驗組材料的24孔培養板每孔加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)2.5 mL，室溫下浸泡制備浸提液。在不同的浸泡時間取樣，用TB法檢測浸提液中的游離肝素量，除以材料中的肝素含量，即可計算肝素分子的釋放速率。
1.7 凝血時間檢測
按照Lv等[10]和Ran等[11]材料體外凝血時間檢測方法，取實驗組和對照組材料，每組6個平行樣，與健康人血漿在37℃孵育30 min后，血漿轉入凝血檢測專用透明硅化玻管，置入CA-50半自動血凝儀，按說明書使用相應試劑盒測定凝血酶時間(thrombin time, TT)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)。
1.8 復鈣時間測定
根據李沁華等[12]復鈣時間的檢測方法，實驗組和對照組每組材料6個平行樣，向裝有實驗組和對照組材料的24孔培養板的每孔中加入0.5 mL抗凝血漿和0.025 mol/L CaCl2溶液0.2 mL，于37℃恒溫水浴，秒表計時，當孔板內出現一絲纖狀物時停表，得到復鈣時間。
1.9 數據處理
數據用均值±標準差(
2 結果
2.1 TB染色
與對照組材料相比，實驗組材料均沿膠原基質表面藍染，內部區域呈淡染，EPA組材料膠原基質內部藍色較另兩組更深，如圖 1所示，表明實驗組材料上均成功固定有肝素。
圖1
三種肝素化修飾支架材料TB染色
Figure1.
TB staining of three kinds of heparin modified scaffolds
2.2 肝素含量
為了使后續抗凝性能研究數據具有可比性，通過對肝素化修飾條件的控制，使三種方法得到的肝素化修飾支架材料中肝素含量相近，LBL組為(24.81±0.12)μg/cm2，MPA組為(24.76±0.14)μg/cm2，EPA組為(25.03±0.15)μg/cm2，三組之間差異沒有統計學意義(P值均＞0.05)。
2.3 肝素釋放速率
如圖 2所示，實驗組各組材料前2 h肝素基本未釋放，在2~6 h迅速釋放，且LBL組釋放最快，EPA組釋放最慢，之后釋放速率逐漸減慢，趨于平穩。第168 h時三者釋放速率接近。EPA組釋放曲線最低，168 h后肝素剩余量最多(35.4%)；LBL組與MPA組曲線接近，168 h后肝素剩余量均為15%左右。
圖2
不同時間點支架材料的肝素累計釋放百分比
Figure2.
Heparin relative release percent of scaffolds in different time points
2.4 凝血指標
實驗組材料TT、PT、APTT值與對照組相比均有顯著增加(P＜0.05)，其中EPA組材料TT、PT、APTT值均超過設備測量值上限，如圖 3所示。結果表明，EPA組材料具有更好的抗凝性能。
圖3
各組材料的凝血指標
與對照組相比, *
Compared with the control group, *
2.5 復鈣時間
復鈣時間測定是在已除去Ca2+的血漿中重新加入Ca2+，測定血液出現凝固的時間即復鈣時間，其意義在于檢測內源凝血系統[13]。一般來講，復鈣時間越長，抗凝血性能越好。經測定實驗組材料的復鈣時間分別為：LBL組(236.1±15.5)s，MPA組(214±21.6)s，EPA組(312±28.5)s。三個實驗組材料復鈣時間均顯著長于對照組[(108.5±10.3)s](P＜0.001)，約為對照組材料復鈣時間的2倍，其中EPA組復鈣時間最長。
3 討論
去細胞化材料中含有大量暴露的膠原蛋白纖維，而膠原纖維暴露是血栓發生過程中的主要事件[14]。凝血過程包含一系列酶原的激活，最終將無活性的凝血酶原轉化為有活性的凝血酶，將可溶性的纖維蛋白轉化為不溶性的纖維蛋白從而引起血液凝固。而抗凝血酶Ⅲ是天然的抗血栓劑，是凝血過程的絲氨酸蛋白酶的抑制劑，并被認為是凝血酶的“自殺型”抑制劑[15]。肝素是帶負電的線形多聚糖，由兩個重復的雙糖單位(L-艾杜糖酸D-葡糖胺和D型乙酰葡糖胺)構成[16]。由于肝素獨特的結構，它可以與抗凝血酶Ⅲ形成復合物，從而結合活化的凝血因子，起到消除這些凝血因子的作用[17]。同大多數絲氨蛋白酶與抑制劑的反應相比，抗凝血酶Ⅲ與凝血酶的反應速度較慢，但在肝素存在的情況下，反應速度可增加幾千倍，能有效地抑制凝血過程，因此肝素被廣泛用作抗凝藥物[17]。在去細胞化材料表面進行肝素修飾，成為解決材料血液相容性問題的一種常用措施。
本文中，實驗組材料TB染色均為陽性，而對照組材料為陰性。EPA組的TB染色最深，而且藍色區域并非局限于細胞外基質(extracellular matrix, ECM)邊緣，而是深入ECM內部。MPA組和EPA組材料中的肝素共價結合于ECM[14]，而LBL組材料中肝素靠靜電吸引結合于ECM上[5]，前一種方式結合力更強，肝素結合較為牢固，釋放較為緩慢。進一步比較EPA組與MPA組材料，EPA組材料解聚后的肝素分子量更小[7]，更容易深入ECM內部，因而釋放更加緩慢。本組結果顯示EPA組材料的血液相容性獲得了最為顯著和穩定的改善。
在TT、PT和APTT測試過程中，去細胞化材料首先與富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)中纖維蛋白原等血漿蛋白接觸，此時材料表面吸附的血漿蛋白數量和牢固程度將直接影響隨后血液—材料間的相互作用，對測量結果產生影響。在EPA組材料中，肝素分子呈纖毛狀末端共價固定在ECM表面[7]，這樣纖維蛋白原首先吸附在了纖毛狀的肝素分子上，而非ECM表面，纖毛的擺動性使吸附上的纖維蛋白原很容易在后續的洗滌過程中被洗脫掉。因此，EPA組材料的TT、PT和APTT測量值都超出了機器檢測上限，同時，復鈣時間也最長，在體外實驗中表現出了優異的抗凝血性能。
在本研究中，我們探討了三種溫和反應條件下對去細胞化材料的肝素修飾方式。與對照組相比，實驗組材料的血液相容性均獲得了顯著改善，特別是EPA組材料的血液相容性各項指標都明顯優于其他兩種修飾方法。通過肝素化修飾改善可植入去細胞化材料的血液相容性，是一項重大的技術改進，具有廣闊的應用前景。當然，目前研究尚處于體外研究階段，該技術的安全性和有效性還有待體內實驗的進一步檢驗。
