本文為實現多點神經環路、核團功能的在體調控, 研發了可植入光遺傳學神經刺激光極。首先, 使用了柔性電路板工藝制作光極的基底, 將微型發光二極管焊接于基底之上后使用真空氣相鍍膜技術制作光極的覆蓋膜。然后使用光功率計等設備對光極進行性能測試, 結合動物實驗實現光極的驗證。最終制作完成的光極尺寸為500 μm×150 μm(寬度×基底厚度); 將其置于生理鹽水14 d后仍可正常發光; 最大發光功率為9.31 mW, 有效光照面積達到3.03 mm2; 在體實驗中檢測到了光刺激誘發的小鼠皮層響應, 并成功調控了小鼠的次級運動皮層。本文研制的光極具有光照面積大、植入方便、可長期植入等特點, 為核團功能調控等研究提供了新的光遺傳學工具。
引用本文： 岳森, 袁明軍, 張云鵬, 王璽淵, 王守巖. 可植入光遺傳學神經刺激光極研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(2): 337-342, 367. doi: 10.7507/1001-5515.20160057 復制
引言
光遺傳學是指通過基因工程技術使特定神經元細胞表達編碼了光敏蛋白的外源生物基因，該光敏蛋白對光敏感且可以實現對神經元細胞刺激或者抑制性調控，從而通過光來開啟或者關閉相關神經環路[1-2]，是神經科學領域的巨大突破，并被Nature Methods評選為2010年年度方法[3]。
自2007年第一次成功實現利用光來控制自由狀態下小鼠運動以來[4]，光遺傳學實驗大多采用以激光作為光源的光極[5-12]。最早的植入式光極由光纖和光纖套管組成[4-5]，光纖直接與激光器相連，光纖套管不僅起到固定光纖的作用，還可以用于藥物注射。但是，此光極的光纖在實驗過程中需要反復植入，會對腦組織造成較大損傷。隨后出現了一種改進光極，由一根短光纖嵌入金屬管制作而成[6]，可實現一次性較長時間的植入，但該光極需要通過光纖轉接頭與激光器連接，這樣不僅降低了光傳輸效率，還增加了動物背負負荷。隨著制造工藝的進步，尤其是微電子機械系統(micro-electromechanical systems, MEMS)技術的發展與應用，出現了一系列將光纖與電記錄觸點相結合的光極[7-9]，此類光極不僅具有與光纖接近的微小尺寸，還可以記錄光纖照射區域內的神經電活動信號。近年來，發光二極管(light emitting diode, LED)技術在神經工程領域的應用進一步擴展了光極的種類[13-15]。Kim等[13]制作了一種多參數LED光極，集成了溫度傳感器與光電傳感器，并實現了小鼠的無線調控。但該光極過于柔軟，需要通過額外的管道結構才能植入生物體內。Kwon等[14]在LED表面制作錐狀的光纖形成光極，此方法雖然增加了光極的作用深度，但同時降低了光的傳輸效率，且工藝較為復雜。Cao等[15]使用了柔性電路板工藝制作了一種具有單個LED刺激點、三個電記錄點的光極，該光極所用LED尺寸較大，且封裝材料使用了生物兼容性較差的聚二甲硅氧烷。因此比較而言，激光光源的光極具有功率較大，較窄光譜帶寬，光照方向性好等優點，但在需要進行大面積光照的核團功能研究或者需要小動物能夠自由移動的行為學研究中[11-12, 16-17]，以LED作為光源的光極則表現出較大優勢。
本文以微LED作為光源，應用高精度柔性電路板加工技術、真空氣相鍍膜技術以及微焊接工藝，研制了一種具有神經刺激功能的光極，與低負荷刺激器結合，實現了小動物麻醉和自由活動兩種狀態下的神經調控。本文光極與光纖光極相比具有光照面積更大、植入更為方便的特點，與相近的LED光極相比具有更好的生物兼容性，能夠實現長期植入。
1 光極的設計與制作
1.1 目標與方案
光源：目前廣泛用于實現刺激神經的光敏感通道蛋白對光源波長的要求范圍為(470±20)μm[7]，對光功率密度要求為大于1 mW/mm2[5]。Cree公司的DA3547型號微LED的波長為460 μm，官方數據手冊顯示最大發光功率可達76 mW，LED表面光功率密度遠大于1 mW/mm2，可較好地滿足光源要求。
材料：具有較好生物兼容性的材料才能保證光極的可長期植入。本文光極使用聚酰亞胺(polyimide, PI)作為光極的基底材料，并且使用聚對二甲苯(parylene)作為光極的覆蓋膜材料。聚酰亞胺和聚對二甲苯都具有穩定的化學性能[18-19]，尤其是聚對二甲苯，不僅絕緣性能優秀，還具有很好的生物兼容性。
結構：如圖 1所示。由于光極需要通過連接器與刺激器相連，綜合考慮連接的穩定性與光極的結構強度，將光極的尾部設計成了四個焊盤結構。光極尖端呈梯形形狀，有利于插入生物組織并降低對生物組織的損壞。光極以聚酰亞胺作為基底材料，微LED的正負兩極通過銅箔形成的導線連接到光極的尾部焊盤。光極的可植入部分(圖中AB段)四周表面黏附一層1 μm厚的透明聚對二甲苯覆蓋膜。
圖1
光極設計示意圖
Figure1.
Design of the optrode
尺寸和硬度：為減小對腦組織的損傷，結合小鼠的腦圖譜，確定光極的寬度不應超過500 μm。光極應具有一定彈性，過于柔軟會影響植入的精度，過于堅硬則容易在植入過程造成較大組織損傷。本文光極通過使用不同厚度的材料模擬植入過程，最終確定光極基底厚度為150 μm。光極的尺寸如圖 2所示，其中導線寬度為50 μm，微LED尺寸為350 μm×470 μm×155 μm(Cree DA3547)。
圖2
光極尺寸示意圖
Figure2.
Dimension of the optrode
1.2 制作
光極的制作主要使用柔性電路板工藝和真空氣相鍍膜技術。制作工藝流程如圖 3所示。基底材料選用聚酰亞胺。如圖 3(a)所示裁剪出一塊厚為150 μm、長寬都為100 mm的聚酰亞胺基板，使用異丙醇進行清洗后在100℃下熱烘30 min。如圖 3(b)所示在聚酰亞胺基板上涂一層13 μm厚的環氧樹脂膠，然后再貼合一層18 μm厚的銅箔。如圖 3(c)所示利用加熱滾輪加壓的方式在銅箔表面貼合一層25 μm厚的負性光致抗蝕劑(主要成分為季戊四醇三丙烯酸酯)。而如圖 3(d)所示是一個光化學圖形轉移過程，按照設計好的線路(導線和焊盤)進行紫外線曝光。曝光區域是光極的導線和焊盤位置。曝光之后用顯影液(主要成分為碳酸鈉)將未曝光區域去除。剩下的光致抗蝕劑(已發生光聚合反應)在銅箔表面形成了光極的導線和焊盤圖形。圖 3(e)則為利用刻蝕液(主要成分為雙氧水和鹽酸)將裸露的銅箔去除。圖 3(f)利用強堿溶液(主要成分為氫氧化鈉)將光致抗蝕劑去除，讓線路完全露出，并對線路進行化學鎳金表面處理，在銅的表面形成厚約3 μm的鎳，然后在鎳的表面形成0.08 μm厚的金。這樣可以防止銅被氧化或者腐蝕，并且利于之后的焊接(微LED焊接)和接觸(光極尾部焊盤與連接器的接觸)。表面處理之后，利用激光切割技術圍繞線路和焊盤將基板切割成如圖 2所示的形狀。
圖3
光極制作工藝流程圖
(a)裁剪基材；(b)貼合銅箔；(c)涂覆負性光致抗蝕劑；(d)圖形轉移；(e)刻蝕；(f)剝離抗蝕劑；(g)焊接微LED；(h)真空氣相鍍膜
Figure3. Fabrication flow chart of the optrode(a) cut the substrate; (b) paste the copper foil; (c) coat the negative photoresist; (d) pattern transfer process; (e) etch the unexposed copper foil; (f) peel off the residual photoresist; (g) solder the LED; (h) fabricate the parylene coating layer
如圖 3(g)所示，微LED焊接過程為：使用針尖蘸取少量無鉛低溫錫膏(DAIKIN HANDA，DA-309Bi，熔點138℃)黏附在LED焊盤上，然后將微LED正負極對準LED焊盤的正負極放置在LED焊盤表面，使用鑷子輕壓LED使錫膏粘住LED，然后將光極轉移至預熱臺加熱區域，考慮到錫膏與預熱臺不是直接接觸并且為了提高焊接質量，將預熱臺溫度設定為230℃。在預熱臺加熱區放置2 s后移至預熱臺的室溫區域冷卻。之后再用數字萬用表(型號Fluke F18B，美國)的LED測試檔測試焊接后的LED能否發光，發光則表面LED焊接成功。如圖 3(h)所示使用真空氣相鍍膜系統(型號Specialty coating systems PDS2010，美國)在光極的可植入部分鍍上一層1 μm厚的聚對二甲苯。
2 光極的性能測試與功能驗證
2.1 性能測試
主要對光極的絕緣性能、發光功率進行了測試。
2.1.1 絕緣測試
采用對比實驗方案來確定光極的絕緣性能。首先配置濃度為0.9%的氯化鈉溶液100 mL，然后取三個未鍍聚對二甲苯的光極(三個光極編號為a、b、c)和三個鍍有聚對二甲苯的光極(三個光極編號為A、B、C)，再使用數字萬用表(型號FLUKE 18B)對不同條件下(置于干燥空氣中、浸入氯化鈉溶液中、浸入氯化鈉溶液一定時間后取出等狀態)的光極進行LED導通測試。實驗記錄如表 1所示。表中“-”表示不導通。
表1
光極絕緣性能測試結果記錄表(單位：V)
Table1.
Insulation performance test results of the optrode (unit: V)
2.1.2 光功率測試
將光極連接到直流電源分析儀(型號Agilent N6705B，美國)，使用光功率計(型號THORLABS PM100D，美國)對光極的發光功率進行測試。分別測試三個光極的光功率-電流曲線，取光功率的平均值，得到如圖 4所示的光功率-電流關系圖。光功率-電流關系近似為指數曲線關系，驅動電流25 mA時的光功率為9.31 mW。本研究組自主研發的無線刺激器的供電電流范圍為2～8 mA，建立指數模型并進行擬合，可計算出光極連接無線刺激器時光功率范圍為1.2～3.9 mW。
圖4
光極發光功率與驅動電流關系圖
Figure4.
Optical output power versus current in measurement
2.1.3 刺激范圍模擬測量
假設光極周圍生物組織各向同性并使用球冠模型模擬微LED光源，建立如圖 5所示的光極在生物體內平面散射模型[5]。結合微LED尺寸(350 μm×470 μm×155 μm)和發散角(126°)，將球冠的高設定為155 μm，球半徑為275 μm。球冠模型光源功率取值為1 mW。引發光遺傳學現象的光功率密度需要大于1 mW/mm2，所以由圖 5可以看出在光源總功率為1 mW的情況下，光極的有效作用范圍為100 μm(與微LED表面的距離)，通過球冠面積計算公式計算出最大有效作用面的面積為0.49 mm2(球冠的球面面積)。隨著光功率的提高，光極的有效作用范圍不斷擴大。當光極工作在發光功率3.9 mW時，有效作用范圍約為250 μm，最大有效作用面的面積達到0.98 mm2。而在相同范圍內，以直徑200 μm、發散角32°的光纖為例[5]，其最大有效作用面的面積只有0.096 mm2(平面面積)。
圖5
光通過腦組織功率密度變化模擬圖
Figure5.
Simulation results of light intensity distribution as light propagates through the brain tissue
2.2 小鼠麻醉狀態下的功能驗證
使用激光光纖對本文設計制作的光極進行了對比實驗以驗證本文光極的神經刺激功能。實驗體為整個腦皮層表達了Channelrhodopsin-2(ChR2)的麻醉狀態下的轉基因小鼠。將光極植入麻醉狀態下的小鼠的腦皮層并連接無線刺激器，同時在小鼠腦皮層另一處植入信號采集微電極(直徑為30 μm的銅絲)。使用多通道生理信號采集系統(型號Cerebus，美國)進行信號記錄。之后再將光極換成激光光纖進行刺激與信號采集，得到另一組信號數據。共進行了兩種模式的刺激，分別為1 Hz頻率、10 ms刺激時長和20 Hz頻率、10 ms刺激時長，實驗結果如圖 6所示。由圖可以看出，光極成功引發表達了ChR2的小鼠腦皮層的興奮。在1 Hz頻率下，誘發信號形狀一致，說明光極與激光具有相同的刺激效果。在20 Hz頻率下，光極刺激同樣可以誘發相似神經活動。
圖6
激光刺激和光極刺激下所采集到的信號對比圖
Figure6.
Comparison of the recording signal resulting from laser stimulation and optrode stimulation
2.3 小鼠自由移動狀態下的功能驗證
使用Thy1-ChR2-EYFP(Thymocyte antigen1-Channelrhodopsin2-Enhanced yellow fluorescent protein)轉基因小鼠進行了在體實驗驗證。將光極植入小鼠次級運動皮層，使用自主研發的無線刺激器驅動光極，刺激器通過自制背包固定在小鼠背部。術后5天在小鼠處于自由活動狀態下進行刺激實驗，如圖 7所示。圖 7左小鼠處于靜止狀態，此時光刺激沒有開啟。圖 7右是光刺激開啟之后的小鼠狀態，小鼠明顯由靜止進入運動狀態。實驗結果表明本文光極在小鼠自由移動狀態下能夠成功實現神經刺激功能。
圖7
自由移動狀態下小鼠實驗記錄圖
Figure7.
Freely-moving mouce with an optrode implanted
3 結論
本文設計并制作了一種具有神經刺激功能的光遺傳學光極。光極尺寸為500 μm×150 μm(寬度×基底厚度)，置于生理鹽水14 d后仍可正常發光，最大發光功率為9.31 mW，有效光照面積達到3.03 mm2，在體實驗成功驗證了本文光極的神經刺激作用。本文光極與光纖光極[5-12]相比具有光照面積更大、植入更為方便的特點，與相近的LED光極[13-15]相比具有更好的生物兼容性，能夠實現長期植入，為需要刺激較大核團區域的核團功能研究、要求實驗體活動范圍較大的行為學研究提供了較好的實驗解決方案。此外，本文光極的解決方案還具有工藝簡單、制作周期短、成本低廉等特點，容易實現大批量生產，對神經科學的研究具有積極意義。
引言
光遺傳學是指通過基因工程技術使特定神經元細胞表達編碼了光敏蛋白的外源生物基因，該光敏蛋白對光敏感且可以實現對神經元細胞刺激或者抑制性調控，從而通過光來開啟或者關閉相關神經環路[1-2]，是神經科學領域的巨大突破，并被Nature Methods評選為2010年年度方法[3]。
自2007年第一次成功實現利用光來控制自由狀態下小鼠運動以來[4]，光遺傳學實驗大多采用以激光作為光源的光極[5-12]。最早的植入式光極由光纖和光纖套管組成[4-5]，光纖直接與激光器相連，光纖套管不僅起到固定光纖的作用，還可以用于藥物注射。但是，此光極的光纖在實驗過程中需要反復植入，會對腦組織造成較大損傷。隨后出現了一種改進光極，由一根短光纖嵌入金屬管制作而成[6]，可實現一次性較長時間的植入，但該光極需要通過光纖轉接頭與激光器連接，這樣不僅降低了光傳輸效率，還增加了動物背負負荷。隨著制造工藝的進步，尤其是微電子機械系統(micro-electromechanical systems, MEMS)技術的發展與應用，出現了一系列將光纖與電記錄觸點相結合的光極[7-9]，此類光極不僅具有與光纖接近的微小尺寸，還可以記錄光纖照射區域內的神經電活動信號。近年來，發光二極管(light emitting diode, LED)技術在神經工程領域的應用進一步擴展了光極的種類[13-15]。Kim等[13]制作了一種多參數LED光極，集成了溫度傳感器與光電傳感器，并實現了小鼠的無線調控。但該光極過于柔軟，需要通過額外的管道結構才能植入生物體內。Kwon等[14]在LED表面制作錐狀的光纖形成光極，此方法雖然增加了光極的作用深度，但同時降低了光的傳輸效率，且工藝較為復雜。Cao等[15]使用了柔性電路板工藝制作了一種具有單個LED刺激點、三個電記錄點的光極，該光極所用LED尺寸較大，且封裝材料使用了生物兼容性較差的聚二甲硅氧烷。因此比較而言，激光光源的光極具有功率較大，較窄光譜帶寬，光照方向性好等優點，但在需要進行大面積光照的核團功能研究或者需要小動物能夠自由移動的行為學研究中[11-12, 16-17]，以LED作為光源的光極則表現出較大優勢。
本文以微LED作為光源，應用高精度柔性電路板加工技術、真空氣相鍍膜技術以及微焊接工藝，研制了一種具有神經刺激功能的光極，與低負荷刺激器結合，實現了小動物麻醉和自由活動兩種狀態下的神經調控。本文光極與光纖光極相比具有光照面積更大、植入更為方便的特點，與相近的LED光極相比具有更好的生物兼容性，能夠實現長期植入。
1 光極的設計與制作
1.1 目標與方案
光源：目前廣泛用于實現刺激神經的光敏感通道蛋白對光源波長的要求范圍為(470±20)μm[7]，對光功率密度要求為大于1 mW/mm2[5]。Cree公司的DA3547型號微LED的波長為460 μm，官方數據手冊顯示最大發光功率可達76 mW，LED表面光功率密度遠大于1 mW/mm2，可較好地滿足光源要求。
材料：具有較好生物兼容性的材料才能保證光極的可長期植入。本文光極使用聚酰亞胺(polyimide, PI)作為光極的基底材料，并且使用聚對二甲苯(parylene)作為光極的覆蓋膜材料。聚酰亞胺和聚對二甲苯都具有穩定的化學性能[18-19]，尤其是聚對二甲苯，不僅絕緣性能優秀，還具有很好的生物兼容性。
結構：如圖 1所示。由于光極需要通過連接器與刺激器相連，綜合考慮連接的穩定性與光極的結構強度，將光極的尾部設計成了四個焊盤結構。光極尖端呈梯形形狀，有利于插入生物組織并降低對生物組織的損壞。光極以聚酰亞胺作為基底材料，微LED的正負兩極通過銅箔形成的導線連接到光極的尾部焊盤。光極的可植入部分(圖中AB段)四周表面黏附一層1 μm厚的透明聚對二甲苯覆蓋膜。
圖1
光極設計示意圖
Figure1.
Design of the optrode
尺寸和硬度：為減小對腦組織的損傷，結合小鼠的腦圖譜，確定光極的寬度不應超過500 μm。光極應具有一定彈性，過于柔軟會影響植入的精度，過于堅硬則容易在植入過程造成較大組織損傷。本文光極通過使用不同厚度的材料模擬植入過程，最終確定光極基底厚度為150 μm。光極的尺寸如圖 2所示，其中導線寬度為50 μm，微LED尺寸為350 μm×470 μm×155 μm(Cree DA3547)。
圖2
光極尺寸示意圖
Figure2.
Dimension of the optrode
1.2 制作
光極的制作主要使用柔性電路板工藝和真空氣相鍍膜技術。制作工藝流程如圖 3所示。基底材料選用聚酰亞胺。如圖 3(a)所示裁剪出一塊厚為150 μm、長寬都為100 mm的聚酰亞胺基板，使用異丙醇進行清洗后在100℃下熱烘30 min。如圖 3(b)所示在聚酰亞胺基板上涂一層13 μm厚的環氧樹脂膠，然后再貼合一層18 μm厚的銅箔。如圖 3(c)所示利用加熱滾輪加壓的方式在銅箔表面貼合一層25 μm厚的負性光致抗蝕劑(主要成分為季戊四醇三丙烯酸酯)。而如圖 3(d)所示是一個光化學圖形轉移過程，按照設計好的線路(導線和焊盤)進行紫外線曝光。曝光區域是光極的導線和焊盤位置。曝光之后用顯影液(主要成分為碳酸鈉)將未曝光區域去除。剩下的光致抗蝕劑(已發生光聚合反應)在銅箔表面形成了光極的導線和焊盤圖形。圖 3(e)則為利用刻蝕液(主要成分為雙氧水和鹽酸)將裸露的銅箔去除。圖 3(f)利用強堿溶液(主要成分為氫氧化鈉)將光致抗蝕劑去除，讓線路完全露出，并對線路進行化學鎳金表面處理，在銅的表面形成厚約3 μm的鎳，然后在鎳的表面形成0.08 μm厚的金。這樣可以防止銅被氧化或者腐蝕，并且利于之后的焊接(微LED焊接)和接觸(光極尾部焊盤與連接器的接觸)。表面處理之后，利用激光切割技術圍繞線路和焊盤將基板切割成如圖 2所示的形狀。
圖3
光極制作工藝流程圖
(a)裁剪基材；(b)貼合銅箔；(c)涂覆負性光致抗蝕劑；(d)圖形轉移；(e)刻蝕；(f)剝離抗蝕劑；(g)焊接微LED；(h)真空氣相鍍膜
Figure3. Fabrication flow chart of the optrode(a) cut the substrate; (b) paste the copper foil; (c) coat the negative photoresist; (d) pattern transfer process; (e) etch the unexposed copper foil; (f) peel off the residual photoresist; (g) solder the LED; (h) fabricate the parylene coating layer
如圖 3(g)所示，微LED焊接過程為：使用針尖蘸取少量無鉛低溫錫膏(DAIKIN HANDA，DA-309Bi，熔點138℃)黏附在LED焊盤上，然后將微LED正負極對準LED焊盤的正負極放置在LED焊盤表面，使用鑷子輕壓LED使錫膏粘住LED，然后將光極轉移至預熱臺加熱區域，考慮到錫膏與預熱臺不是直接接觸并且為了提高焊接質量，將預熱臺溫度設定為230℃。在預熱臺加熱區放置2 s后移至預熱臺的室溫區域冷卻。之后再用數字萬用表(型號Fluke F18B，美國)的LED測試檔測試焊接后的LED能否發光，發光則表面LED焊接成功。如圖 3(h)所示使用真空氣相鍍膜系統(型號Specialty coating systems PDS2010，美國)在光極的可植入部分鍍上一層1 μm厚的聚對二甲苯。
2 光極的性能測試與功能驗證
2.1 性能測試
主要對光極的絕緣性能、發光功率進行了測試。
2.1.1 絕緣測試
采用對比實驗方案來確定光極的絕緣性能。首先配置濃度為0.9%的氯化鈉溶液100 mL，然后取三個未鍍聚對二甲苯的光極(三個光極編號為a、b、c)和三個鍍有聚對二甲苯的光極(三個光極編號為A、B、C)，再使用數字萬用表(型號FLUKE 18B)對不同條件下(置于干燥空氣中、浸入氯化鈉溶液中、浸入氯化鈉溶液一定時間后取出等狀態)的光極進行LED導通測試。實驗記錄如表 1所示。表中“-”表示不導通。
表1
光極絕緣性能測試結果記錄表(單位：V)
Table1.
Insulation performance test results of the optrode (unit: V)
2.1.2 光功率測試
將光極連接到直流電源分析儀(型號Agilent N6705B，美國)，使用光功率計(型號THORLABS PM100D，美國)對光極的發光功率進行測試。分別測試三個光極的光功率-電流曲線，取光功率的平均值，得到如圖 4所示的光功率-電流關系圖。光功率-電流關系近似為指數曲線關系，驅動電流25 mA時的光功率為9.31 mW。本研究組自主研發的無線刺激器的供電電流范圍為2～8 mA，建立指數模型并進行擬合，可計算出光極連接無線刺激器時光功率范圍為1.2～3.9 mW。
圖4
光極發光功率與驅動電流關系圖
Figure4.
Optical output power versus current in measurement
2.1.3 刺激范圍模擬測量
假設光極周圍生物組織各向同性并使用球冠模型模擬微LED光源，建立如圖 5所示的光極在生物體內平面散射模型[5]。結合微LED尺寸(350 μm×470 μm×155 μm)和發散角(126°)，將球冠的高設定為155 μm，球半徑為275 μm。球冠模型光源功率取值為1 mW。引發光遺傳學現象的光功率密度需要大于1 mW/mm2，所以由圖 5可以看出在光源總功率為1 mW的情況下，光極的有效作用范圍為100 μm(與微LED表面的距離)，通過球冠面積計算公式計算出最大有效作用面的面積為0.49 mm2(球冠的球面面積)。隨著光功率的提高，光極的有效作用范圍不斷擴大。當光極工作在發光功率3.9 mW時，有效作用范圍約為250 μm，最大有效作用面的面積達到0.98 mm2。而在相同范圍內，以直徑200 μm、發散角32°的光纖為例[5]，其最大有效作用面的面積只有0.096 mm2(平面面積)。
圖5
光通過腦組織功率密度變化模擬圖
Figure5.
Simulation results of light intensity distribution as light propagates through the brain tissue
2.2 小鼠麻醉狀態下的功能驗證
使用激光光纖對本文設計制作的光極進行了對比實驗以驗證本文光極的神經刺激功能。實驗體為整個腦皮層表達了Channelrhodopsin-2(ChR2)的麻醉狀態下的轉基因小鼠。將光極植入麻醉狀態下的小鼠的腦皮層并連接無線刺激器，同時在小鼠腦皮層另一處植入信號采集微電極(直徑為30 μm的銅絲)。使用多通道生理信號采集系統(型號Cerebus，美國)進行信號記錄。之后再將光極換成激光光纖進行刺激與信號采集，得到另一組信號數據。共進行了兩種模式的刺激，分別為1 Hz頻率、10 ms刺激時長和20 Hz頻率、10 ms刺激時長，實驗結果如圖 6所示。由圖可以看出，光極成功引發表達了ChR2的小鼠腦皮層的興奮。在1 Hz頻率下，誘發信號形狀一致，說明光極與激光具有相同的刺激效果。在20 Hz頻率下，光極刺激同樣可以誘發相似神經活動。
圖6
激光刺激和光極刺激下所采集到的信號對比圖
Figure6.
Comparison of the recording signal resulting from laser stimulation and optrode stimulation
2.3 小鼠自由移動狀態下的功能驗證
使用Thy1-ChR2-EYFP(Thymocyte antigen1-Channelrhodopsin2-Enhanced yellow fluorescent protein)轉基因小鼠進行了在體實驗驗證。將光極植入小鼠次級運動皮層，使用自主研發的無線刺激器驅動光極，刺激器通過自制背包固定在小鼠背部。術后5天在小鼠處于自由活動狀態下進行刺激實驗，如圖 7所示。圖 7左小鼠處于靜止狀態，此時光刺激沒有開啟。圖 7右是光刺激開啟之后的小鼠狀態，小鼠明顯由靜止進入運動狀態。實驗結果表明本文光極在小鼠自由移動狀態下能夠成功實現神經刺激功能。
圖7
自由移動狀態下小鼠實驗記錄圖
Figure7.
Freely-moving mouce with an optrode implanted
3 結論
本文設計并制作了一種具有神經刺激功能的光遺傳學光極。光極尺寸為500 μm×150 μm(寬度×基底厚度)，置于生理鹽水14 d后仍可正常發光，最大發光功率為9.31 mW，有效光照面積達到3.03 mm2，在體實驗成功驗證了本文光極的神經刺激作用。本文光極與光纖光極[5-12]相比具有光照面積更大、植入更為方便的特點，與相近的LED光極[13-15]相比具有更好的生物兼容性，能夠實現長期植入，為需要刺激較大核團區域的核團功能研究、要求實驗體活動范圍較大的行為學研究提供了較好的實驗解決方案。此外，本文光極的解決方案還具有工藝簡單、制作周期短、成本低廉等特點，容易實現大批量生產，對神經科學的研究具有積極意義。
