本研究目的是探討大鼠肺缺血再灌注損傷對瞬時受體電位香草酸亞型 1（TRPV1）在肺和腦干表達的影響。將 16 只 SD 大鼠隨機分為假手術組（S組）和缺血再灌注組（IR組）。于缺血前、再灌注 0.5 h 及再灌注 4 h 抽取動脈血進行血氣分析，觀察動脈血氧分壓（PaO2）及肺泡動脈氧分壓差（A-aDO2）的變化。實驗結束時取左肺下葉測量氧化應激指標丙二醛（MDA）、炎癥反應指標髓過氧化物酶活性（MPO）、神經肽降鈣素基因相關肽（CGRP）和 P 物質（SP）。取左肺上葉和腦干檢測 TRPV1 的基因和蛋白的表達。與 S 組相比，再灌注 0.5 h 和 4 h 時，IR 組 PaO2 明顯降低（P<0.05），A-aDO2 明顯升高 （P<0.05）；IR 組肺組織勻漿 MPO 活力及 MDA 含量均明顯增高（P<0.05）；缺血再灌注使得 CGRP 含量明顯增加（P<0.05），而兩組間 SP 含量未見明顯差異。IR 組 TRPV1 mRNA 及蛋白在肺組織中表達明顯上調（P<0.05），而在腦干中的表達與 S 組比較無明顯差異。本研究提示肺缺血再灌注損傷使 TRPV1 在肺組織中表達增加，CGRP 釋放增加。
引用本文： 王文健, 成燕, 王儒蓉. 大鼠肺缺血再灌注損傷對瞬時受體電位香草酸亞型 1 在肺和腦干表達的影響. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(1): 87-91. doi: 10.7507/1001-5515.201601042 復制
引言
瞬時受體電位香草酸亞型 1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是一種非選擇性的陽離子通道，廣泛分布在全身各系統傳遞傷害性刺激的初級感覺神經末梢及神經元、背根神經節、脊髓、大腦等。在呼吸系統中，TRPV1 主要表達在辣椒素敏感的感覺神經末梢及神經元[1]。在腦干，TRPV1 主要分布在神經肽及谷氨酸陽性的內臟傳入神經末梢上，該類神經末梢主要集中在孤束核（nucleus tractus solitarii，NTS）[2]。TRPV1 可被炎性介質、熱刺激（＞42℃）等傷害性刺激激活，引起多種神經肽[如降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）和 P 物質（substance P，SP）]和興奮性氨基酸釋放，發揮相應的生物學效應[1]。
有大量研究發現，激活辣椒素敏感的感覺神經末梢上的 TRPV1 會引起 CGRP 和 SP 釋放，從而減輕心肌[3]、腎[4]、肝[5]、肺[6-7]等器官缺血再灌注損傷。而 TRPV1 基因敲除小鼠心肌缺血再灌注后，心功能恢復明顯弱于野生型小鼠[8]。這些研究中僅觀察了神經肽 CGRP 和 SP 含量的變化，卻忽視了 TRPV1 在缺血再灌注損傷局部器官及生命調節中樞表達的變化。因此，本實驗的主要目的是觀察大鼠肺缺血再灌注損傷時，肺和呼吸中樞 TRPV1 表達的變化情況。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性 SD 大鼠 16 只，體重 250~320 g，由四川省動物中心提供；MDA 試劑盒、MPO 試劑盒、大鼠 P 物質酶聯免疫分析試劑盒、大鼠降鈣素基因相關肽酶聯免疫分析試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。RNAiso plus、PCR Master Mix Kit 和 RevertAid TM FirstStrand cDNA Synthesis Kit 購于成都寶科生物科技有限公司。TRPV1 及 β-ACTIN 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，兔抗 TRPV1 抗體購于中國香港 Abcam 公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組及模型的建立 16 只 SD 大鼠隨機分為假手術組（S 組）和缺血再灌注組（IR組），每組 8 只。用戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉，氣管切開后以潮氣量 6～8 mL/kg、呼吸頻率 50～60 次 /min 進行機械通氣，吸入氧濃度為 40%。分離右側股動脈和股靜脈并穿刺置管。動脈置管進行生命體征的監測以及動脈血液標本的抽取，靜脈置管用于輸注含戊巴比妥鈉及維庫溴銨的生理鹽水，進行補液并維持合適的麻醉深度。參照 Eppinger 法建立肺缺血再灌注模型，在左側胸骨旁切斷肋骨開胸，分離左側肺門，在其下方穿 1 根“0” 號縫線，待生命體征穩定后，經右股靜脈注入肝素 250 U/kg，5 min 后，結扎左側肺門（左肺無通氣、顏色由粉紅色變為暗紅色作為缺血成功標準）。重新設置呼吸參數（潮氣量 5～7 mL/kg、呼吸頻率 70～75 次 /分）。右肺單肺通氣 1 h 后松開左肺結扎線，將呼吸參數恢復至缺血前，雙肺通氣 4 h。S 組只分離左側肺門而不結扎，機械通氣 5 h。實驗期間用濕紗布遮蓋切口防止水分過度丟失。術中應用照明燈保暖。
1.2.2 檢測指標 （1）動脈血氣分析：于肺門結扎前、再灌注 0.5 h、再灌注 4 h 三個時點分別抽取約 0.3 mL 動脈血進行血氣分析。觀察動脈氧分壓（PaO2）及肺泡動脈氧分壓差（A-aDO2）的情況。根據以下公式計算 A-aDO2：A-aDO2=吸入氧濃度×（Patm —47）—（動脈二氧化碳分壓/0.8）—動脈氧分壓，其中 Patm 為大氣壓，其值為 760 mm Hg，本實驗中吸入氧濃度為 40%。
（2）氧化應激與炎癥反應指標的檢測：實驗結束后取左肺下葉組織保存于 —80 ℃ 冰箱內，待所有實驗結束后進行批量檢測。肺組織勻漿后根據 MDA、MPO 試劑盒說明書進行檢測，運用 ELISA 法檢測肺組織中 CGRP 及 SP 的含量。
（3）肺和腦干中 TRPV1 mRNA 相對表達量的檢測：實驗結束后取左肺上葉肺組織和腦干立即保存于 —80 ℃ 冰箱。待所有實驗結束后，按照 RNAiso Plus 說明書提取總 RNA。取 2 μL 測量總 RNA 濃度，觀察 OD260/OD280 比值，比值在 1.8~2.2 時，認為 RNA 中蛋白或者其他有機物的污染是可以允許的。采用 qRT-PCR 法測量 TRPV1 mRNA 的表達量。按照試劑使用說明書，以 RNA 為模板，逆轉錄合成 cDNA 第一鏈，再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應體系為 25 μL。以 β-actin 作為內參，引物序列為：正義鏈：GAAGATCAAGATCATTGCTCCT；反義鏈：TACTCCTGCTTGCTGA TCCA；探針：CTGTCCACCTTCCAGCAGA。反應條件為：95℃，2 min 變性；熱循環參數：95℃，15 s，54℃，20 s，72℃，40 s。反應 40 個循環。TRPV1 引物序列：正義鏈：GAGCAAGAACA TCTGGAAG；反義鏈：GTGTTCCAGGTAGTC CAGTT；探針：CCCACCTGCAGCAGCTTGCC。反應條件：95℃，2 min 變性；熱循環參數：95℃，15 s，52℃，20 s，72℃，40 s。反應 40 個循環。讀取臨界循環數（Ct），進行數據分析。用比較閾值法計算目的基因的相對拷貝量 2–??Ct。計算公式：??Ct=[Ct（c目的基因）—Ct（c 內參）]— [Ct（n 目的基因）—Ct（n 內參）]；c 指 IR 組，n 指 S 組。
（4）肺和腦干中 TRPV1 蛋白的測定：根據蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織和腦干蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取 20 μL 蛋白上樣量，先進行 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳，后 PVDF 膜電轉、5% 脫脂奶封閉，浸入兔抗 TRPV1（1∶250）4 ℃ 過夜，清洗后轉入辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG（1∶5 000）中室溫搖床 2 h，ECL 顯影，曝光。IPP 分析軟件進行灰度分析，用目的蛋白與 GAPDH 內參蛋白灰度比值（relative optical density，ROD）表示此目的蛋白的相對含量。
1.3 統計學方法
使用 SPSS17.0 統計軟件進行統計分析。所有實驗數據均檢驗其方差齊性，正態分布的資料以均數 ± 標準差表示。CGRP、SP、MPO、MDA、TRPV1 mRNA 及蛋白相對表達量組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，PaO2、A-aDO2 采用重復測量方差分析，組間兩兩比較采用 Post Hoc 檢驗中的Bonferroni 方法。P<0.05 認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血氣分析
如 表 1 所示，兩組基礎 PaO2差異無統計學意義（P>0.05），肺缺血再灌注 0.5 h 和再灌注 4 h 時，IR 組 PaO2 較 S 組明顯下降（P<0.05）。組內比較，S 組內三個時點間 PaO2 差異均無統計學意義（P>0.05）；IR組再灌注 0.5 h 時 PaO2 較基礎值明顯下降（P<0.05），再灌注 4 h 時與基礎值及再灌注 0.5 h 時差異無統計學意義（P>0.05）。
表1
兩組三個時點 PaO2 的比較（mm Hg，n=8）
Table1.
Comparison of PaO2 at three time points between the two groups (mm Hg, n=8)
如表 2 所示，兩組基礎 A-aDO2 無明顯差異（P>0.05），肺缺血再灌注 0.5 h 和 4 h 時，A-aDO2 在 IR 組較 S 組明顯升高（P<0.05）。S 組內三個時點 A-aDO2 兩兩比較均無明顯差異（P>0.05）；IR 組內，與基礎 A-aDO2 相比，再灌注 0.5 h 及再灌注 4 h 時 A-aDO2 均明顯升高（P<0.05），而再灌注 0.5 h 與再灌注 4 h 之間的 A-aDO2 差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
兩組三個時點 A-aDO2 的比較（mm Hg，n=8）
Table2.
Comparison of A-aDO2 at three time points between the two groups (mm Hg, n=8)
2.2 氧化應激、炎癥反應指標及神經肽類物質的檢測
如表 3 所示，IR 組 MDA 含量較 S 組明顯增加（P<0.05）；IR 組炎癥反應指標 MPO 活力較 S 組增加了 32%（P<0.05）； IR 組中 CGRP 含量較 S 組增加了 26%（P<0.05），SP 含量雖然從數值上看有所增加，但兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。
表3
兩組肺組織中氧化應激、炎癥反應指標及神經肽含量的比較（n=8）
Table3.
Comparisons of oxidative stress, inflammatory response and neuropeptides between the two groups (n=8)
2.3 TRPV1 mRNA 在肺和腦干中的相對表達量
與 S 組相比，IR 組 TRPV1 mRNA 相對表達量在肺組織中明顯增加，IR 組是 S 組的 2.43 倍（P<0.05）；而在腦干中，IR 組 TRPV1 mRNA 相對表達量在數值上較 S 組有增大的趨勢，但兩組差異無統計學意義（P>0.05）（如圖 1 所示）。
圖1
兩組 TRPV1 mRNA 相對表達量在肺和腦干的比較（n=8） *P<0.05 vs. S 組
Figure1.
Comparison of TRPV1 mRNA relative expressions in lung and brainstem between the two groups (n=8) *P<0.05 vs. Sham group
2.4 TRPV1 蛋白在肺和腦干中的相對表達量
與 S 組相比，IR 組 TRPV1 蛋白相對表達量在肺組織中明顯增加（P<0.05）；而在腦干中兩組蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）（如圖 2 所示）。
圖2
兩組 TRPV1 蛋白相對表達量在肺和腦干的比較（n=8） *P<0.05 vs. S 組
Figure2.
Comparison of TRPV1 protein relative expressions in lung and brainstem between the two groups (n=8) *P<0.05 vs. Sham group
3 討論
本實驗從肺功能、氧化應激、炎癥反應三個方面證實模型建立成功。如表 1 和 2 所示，兩組基礎 PaO2 及 A-aDO2 無明顯差異，而再灌注 0.5 h 和再灌注 4 h 后，IR 組 PaO2 明顯降低，A-aDO2 則明顯升高。這說明缺血再灌注損傷了肺換氣及彌散功能。其次，檢測 MDA 的量可間接反映細胞損傷的程度。本實驗 IR 組 MDA 較 S 組含量升高（見表 3），說明 IR 組細胞損傷更嚴重。再次，MPO 活性可以反映組織內中性粒細胞積聚。本實驗的研究結果顯示（見表 3），IR 組中 MPO 活性明顯高于 S 組。表明炎癥反應參與了肺缺血再灌注損傷過程。本研究結果與我們實驗小組[6-7]先前的研究結果一致。
本研究發現，大鼠肺缺血再灌注損傷時，肺 TRPV1 從基因和蛋白水平上均表達上調（見圖 1、圖 2）。與本研究結果相似，Tohda 等 [9] 研究表明在大鼠后爪皮下注射角叉菜膠引起炎癥反應，TRPV1 mRNA 經雙向軸突轉運至感覺神經末梢，在神經末梢合成 TRPV1 增加，提高了 TRPV1 對辣椒素及炎癥刺激的敏感性。此外，我們的研究還發現，肺缺血再灌注后 TRPV1 在腦干的表達并無明顯增加。既往研究表明，微量注射辣椒素于呼吸中樞 NTS 可激活在 NTS 神經末梢上的 TRPV1，引起劑量依賴性的呼吸頻率減慢，給予 TRPV1、NK-2R 和 NK-3R 拮抗劑（辣椒平、SR48968 和 SR142801）可減輕辣椒素引起的呼吸頻率減慢，而只給予辣椒平對呼吸活動沒有影響 [10]。因此，TRPV1 在中樞水平對呼吸活動的調節是有限的。與我們研究結果相似的是，丁曉慧等[11]的研究顯示，大鼠心肌缺血再灌注組 TRPV1 mRNA 在腦干的表達與假手術組比較差異無統計學意義。因此，肺的缺血再灌注損傷可以通過上調肺的 TRPV1 來參與其病理生理過程。
肺缺血再灌注損傷時，IR 組肺組織中 CGRP 含量較 S 組明顯增加，而 SP 含量雖從數值上有所增加，但差異無統計學意義（見表 3）。我們研究小組既往的研究發現，小劑量辣椒素（50 μg/kg）可以激活 TRPV1，引起 CGRP 釋放增加，減輕兔氧化應激、炎癥反應，改善缺血再灌注損傷肺功能，而給予 TRPV1 拮抗劑辣椒平則保護作用消失 [7]。TRPV1 基因敲除小鼠在心臟缺血再灌注后，其心功能恢復明顯弱于野生型小鼠 [8]。大鼠遠端肢體缺血后處理通過激活 TRPV1 引起 CGRP 及 SP 表達增加，減輕心臟缺血再灌注損傷 [12]。TRPV1 通過增加 CGRP 及 SP 的釋放減輕玻璃體內注射門冬氨酸引起的視網膜神經節細胞損傷[13]。大鼠肝缺血再灌注損傷模型中，給予辣椒素及 CGRP 減輕肝炎癥反應和氧化應激，給予拮抗劑辣椒平及 CGRP837 可加重肝缺血再灌注損傷 [5]。這些研究表明，缺血前外源性激活 TRPV1 或給予 CGRP 可以減輕器官的缺血再灌注損傷，而在缺血前敲除 TRPV1 或者耗竭 CGRP，缺血后器官功能恢復會明顯受損。Zheng 等[14]研究表明 TRPV1 表達上調及 CGRP 釋放增加可減輕患有糖尿病大鼠心臟的缺血再灌注損傷。由此，我們推測，肺缺血再灌注損傷時，局部產生的炎性介質等激活辣椒素敏感的感覺神經末梢的 TRPV1，一方面引起神經肽類物質 CGRP 釋放減輕炎癥反應，另一方面通過增加自身表達參與肺缺血再灌注損傷的病理生理過程。
本實驗也存在一些不足之處。首先，本實驗檢測大鼠整個腦干 TRPV1 變化，沒有精確定位到延髓呼吸中樞，未測呼吸中樞神經肽含量。下一步實驗擬通過腦干切片結合免疫組化等實驗方法，觀察呼吸中樞 NTS TRPV1 的變化。其次，我們沒有設立外源性給予 CGRP 或 SP 的對照組觀察肺和腦干中 TRPV1 基因及蛋白的變化，進一步實驗應設立對照組研究神經肽對 TRPV1 的影響，對 TRPV1 在缺血再灌注損傷中的作用機制進行探索。
引言
瞬時受體電位香草酸亞型 1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是一種非選擇性的陽離子通道，廣泛分布在全身各系統傳遞傷害性刺激的初級感覺神經末梢及神經元、背根神經節、脊髓、大腦等。在呼吸系統中，TRPV1 主要表達在辣椒素敏感的感覺神經末梢及神經元[1]。在腦干，TRPV1 主要分布在神經肽及谷氨酸陽性的內臟傳入神經末梢上，該類神經末梢主要集中在孤束核（nucleus tractus solitarii，NTS）[2]。TRPV1 可被炎性介質、熱刺激（＞42℃）等傷害性刺激激活，引起多種神經肽[如降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）和 P 物質（substance P，SP）]和興奮性氨基酸釋放，發揮相應的生物學效應[1]。
有大量研究發現，激活辣椒素敏感的感覺神經末梢上的 TRPV1 會引起 CGRP 和 SP 釋放，從而減輕心肌[3]、腎[4]、肝[5]、肺[6-7]等器官缺血再灌注損傷。而 TRPV1 基因敲除小鼠心肌缺血再灌注后，心功能恢復明顯弱于野生型小鼠[8]。這些研究中僅觀察了神經肽 CGRP 和 SP 含量的變化，卻忽視了 TRPV1 在缺血再灌注損傷局部器官及生命調節中樞表達的變化。因此，本實驗的主要目的是觀察大鼠肺缺血再灌注損傷時，肺和呼吸中樞 TRPV1 表達的變化情況。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性 SD 大鼠 16 只，體重 250~320 g，由四川省動物中心提供；MDA 試劑盒、MPO 試劑盒、大鼠 P 物質酶聯免疫分析試劑盒、大鼠降鈣素基因相關肽酶聯免疫分析試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。RNAiso plus、PCR Master Mix Kit 和 RevertAid TM FirstStrand cDNA Synthesis Kit 購于成都寶科生物科技有限公司。TRPV1 及 β-ACTIN 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，兔抗 TRPV1 抗體購于中國香港 Abcam 公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組及模型的建立 16 只 SD 大鼠隨機分為假手術組（S 組）和缺血再灌注組（IR組），每組 8 只。用戊巴比妥鈉（60 mg/kg）腹腔注射麻醉，氣管切開后以潮氣量 6～8 mL/kg、呼吸頻率 50～60 次 /min 進行機械通氣，吸入氧濃度為 40%。分離右側股動脈和股靜脈并穿刺置管。動脈置管進行生命體征的監測以及動脈血液標本的抽取，靜脈置管用于輸注含戊巴比妥鈉及維庫溴銨的生理鹽水，進行補液并維持合適的麻醉深度。參照 Eppinger 法建立肺缺血再灌注模型，在左側胸骨旁切斷肋骨開胸，分離左側肺門，在其下方穿 1 根“0” 號縫線，待生命體征穩定后，經右股靜脈注入肝素 250 U/kg，5 min 后，結扎左側肺門（左肺無通氣、顏色由粉紅色變為暗紅色作為缺血成功標準）。重新設置呼吸參數（潮氣量 5～7 mL/kg、呼吸頻率 70～75 次 /分）。右肺單肺通氣 1 h 后松開左肺結扎線，將呼吸參數恢復至缺血前，雙肺通氣 4 h。S 組只分離左側肺門而不結扎，機械通氣 5 h。實驗期間用濕紗布遮蓋切口防止水分過度丟失。術中應用照明燈保暖。
1.2.2 檢測指標 （1）動脈血氣分析：于肺門結扎前、再灌注 0.5 h、再灌注 4 h 三個時點分別抽取約 0.3 mL 動脈血進行血氣分析。觀察動脈氧分壓（PaO2）及肺泡動脈氧分壓差（A-aDO2）的情況。根據以下公式計算 A-aDO2：A-aDO2=吸入氧濃度×（Patm —47）—（動脈二氧化碳分壓/0.8）—動脈氧分壓，其中 Patm 為大氣壓，其值為 760 mm Hg，本實驗中吸入氧濃度為 40%。
（2）氧化應激與炎癥反應指標的檢測：實驗結束后取左肺下葉組織保存于 —80 ℃ 冰箱內，待所有實驗結束后進行批量檢測。肺組織勻漿后根據 MDA、MPO 試劑盒說明書進行檢測，運用 ELISA 法檢測肺組織中 CGRP 及 SP 的含量。
（3）肺和腦干中 TRPV1 mRNA 相對表達量的檢測：實驗結束后取左肺上葉肺組織和腦干立即保存于 —80 ℃ 冰箱。待所有實驗結束后，按照 RNAiso Plus 說明書提取總 RNA。取 2 μL 測量總 RNA 濃度，觀察 OD260/OD280 比值，比值在 1.8~2.2 時，認為 RNA 中蛋白或者其他有機物的污染是可以允許的。采用 qRT-PCR 法測量 TRPV1 mRNA 的表達量。按照試劑使用說明書，以 RNA 為模板，逆轉錄合成 cDNA 第一鏈，再以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反應體系為 25 μL。以 β-actin 作為內參，引物序列為：正義鏈：GAAGATCAAGATCATTGCTCCT；反義鏈：TACTCCTGCTTGCTGA TCCA；探針：CTGTCCACCTTCCAGCAGA。反應條件為：95℃，2 min 變性；熱循環參數：95℃，15 s，54℃，20 s，72℃，40 s。反應 40 個循環。TRPV1 引物序列：正義鏈：GAGCAAGAACA TCTGGAAG；反義鏈：GTGTTCCAGGTAGTC CAGTT；探針：CCCACCTGCAGCAGCTTGCC。反應條件：95℃，2 min 變性；熱循環參數：95℃，15 s，52℃，20 s，72℃，40 s。反應 40 個循環。讀取臨界循環數（Ct），進行數據分析。用比較閾值法計算目的基因的相對拷貝量 2–??Ct。計算公式：??Ct=[Ct（c目的基因）—Ct（c 內參）]— [Ct（n 目的基因）—Ct（n 內參）]；c 指 IR 組，n 指 S 組。
（4）肺和腦干中 TRPV1 蛋白的測定：根據蛋白提取試劑盒說明書提取肺組織和腦干蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取 20 μL 蛋白上樣量，先進行 SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電泳，后 PVDF 膜電轉、5% 脫脂奶封閉，浸入兔抗 TRPV1（1∶250）4 ℃ 過夜，清洗后轉入辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG（1∶5 000）中室溫搖床 2 h，ECL 顯影，曝光。IPP 分析軟件進行灰度分析，用目的蛋白與 GAPDH 內參蛋白灰度比值（relative optical density，ROD）表示此目的蛋白的相對含量。
1.3 統計學方法
使用 SPSS17.0 統計軟件進行統計分析。所有實驗數據均檢驗其方差齊性，正態分布的資料以均數 ± 標準差表示。CGRP、SP、MPO、MDA、TRPV1 mRNA 及蛋白相對表達量組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，PaO2、A-aDO2 采用重復測量方差分析，組間兩兩比較采用 Post Hoc 檢驗中的Bonferroni 方法。P<0.05 認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血氣分析
如 表 1 所示，兩組基礎 PaO2差異無統計學意義（P>0.05），肺缺血再灌注 0.5 h 和再灌注 4 h 時，IR 組 PaO2 較 S 組明顯下降（P<0.05）。組內比較，S 組內三個時點間 PaO2 差異均無統計學意義（P>0.05）；IR組再灌注 0.5 h 時 PaO2 較基礎值明顯下降（P<0.05），再灌注 4 h 時與基礎值及再灌注 0.5 h 時差異無統計學意義（P>0.05）。
表1
兩組三個時點 PaO2 的比較（mm Hg，n=8）
Table1.
Comparison of PaO2 at three time points between the two groups (mm Hg, n=8)
如表 2 所示，兩組基礎 A-aDO2 無明顯差異（P>0.05），肺缺血再灌注 0.5 h 和 4 h 時，A-aDO2 在 IR 組較 S 組明顯升高（P<0.05）。S 組內三個時點 A-aDO2 兩兩比較均無明顯差異（P>0.05）；IR 組內，與基礎 A-aDO2 相比，再灌注 0.5 h 及再灌注 4 h 時 A-aDO2 均明顯升高（P<0.05），而再灌注 0.5 h 與再灌注 4 h 之間的 A-aDO2 差異無統計學意義（P>0.05）。
表2
兩組三個時點 A-aDO2 的比較（mm Hg，n=8）
Table2.
Comparison of A-aDO2 at three time points between the two groups (mm Hg, n=8)
2.2 氧化應激、炎癥反應指標及神經肽類物質的檢測
如表 3 所示，IR 組 MDA 含量較 S 組明顯增加（P<0.05）；IR 組炎癥反應指標 MPO 活力較 S 組增加了 32%（P<0.05）； IR 組中 CGRP 含量較 S 組增加了 26%（P<0.05），SP 含量雖然從數值上看有所增加，但兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。
表3
兩組肺組織中氧化應激、炎癥反應指標及神經肽含量的比較（n=8）
Table3.
Comparisons of oxidative stress, inflammatory response and neuropeptides between the two groups (n=8)
2.3 TRPV1 mRNA 在肺和腦干中的相對表達量
與 S 組相比，IR 組 TRPV1 mRNA 相對表達量在肺組織中明顯增加，IR 組是 S 組的 2.43 倍（P<0.05）；而在腦干中，IR 組 TRPV1 mRNA 相對表達量在數值上較 S 組有增大的趨勢，但兩組差異無統計學意義（P>0.05）（如圖 1 所示）。
圖1
兩組 TRPV1 mRNA 相對表達量在肺和腦干的比較（n=8） *P<0.05 vs. S 組
Figure1.
Comparison of TRPV1 mRNA relative expressions in lung and brainstem between the two groups (n=8) *P<0.05 vs. Sham group
2.4 TRPV1 蛋白在肺和腦干中的相對表達量
與 S 組相比，IR 組 TRPV1 蛋白相對表達量在肺組織中明顯增加（P<0.05）；而在腦干中兩組蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）（如圖 2 所示）。
圖2
兩組 TRPV1 蛋白相對表達量在肺和腦干的比較（n=8） *P<0.05 vs. S 組
Figure2.
Comparison of TRPV1 protein relative expressions in lung and brainstem between the two groups (n=8) *P<0.05 vs. Sham group
3 討論
本實驗從肺功能、氧化應激、炎癥反應三個方面證實模型建立成功。如表 1 和 2 所示，兩組基礎 PaO2 及 A-aDO2 無明顯差異，而再灌注 0.5 h 和再灌注 4 h 后，IR 組 PaO2 明顯降低，A-aDO2 則明顯升高。這說明缺血再灌注損傷了肺換氣及彌散功能。其次，檢測 MDA 的量可間接反映細胞損傷的程度。本實驗 IR 組 MDA 較 S 組含量升高（見表 3），說明 IR 組細胞損傷更嚴重。再次，MPO 活性可以反映組織內中性粒細胞積聚。本實驗的研究結果顯示（見表 3），IR 組中 MPO 活性明顯高于 S 組。表明炎癥反應參與了肺缺血再灌注損傷過程。本研究結果與我們實驗小組[6-7]先前的研究結果一致。
本研究發現，大鼠肺缺血再灌注損傷時，肺 TRPV1 從基因和蛋白水平上均表達上調（見圖 1、圖 2）。與本研究結果相似，Tohda 等 [9] 研究表明在大鼠后爪皮下注射角叉菜膠引起炎癥反應，TRPV1 mRNA 經雙向軸突轉運至感覺神經末梢，在神經末梢合成 TRPV1 增加，提高了 TRPV1 對辣椒素及炎癥刺激的敏感性。此外，我們的研究還發現，肺缺血再灌注后 TRPV1 在腦干的表達并無明顯增加。既往研究表明，微量注射辣椒素于呼吸中樞 NTS 可激活在 NTS 神經末梢上的 TRPV1，引起劑量依賴性的呼吸頻率減慢，給予 TRPV1、NK-2R 和 NK-3R 拮抗劑（辣椒平、SR48968 和 SR142801）可減輕辣椒素引起的呼吸頻率減慢，而只給予辣椒平對呼吸活動沒有影響 [10]。因此，TRPV1 在中樞水平對呼吸活動的調節是有限的。與我們研究結果相似的是，丁曉慧等[11]的研究顯示，大鼠心肌缺血再灌注組 TRPV1 mRNA 在腦干的表達與假手術組比較差異無統計學意義。因此，肺的缺血再灌注損傷可以通過上調肺的 TRPV1 來參與其病理生理過程。
肺缺血再灌注損傷時，IR 組肺組織中 CGRP 含量較 S 組明顯增加，而 SP 含量雖從數值上有所增加，但差異無統計學意義（見表 3）。我們研究小組既往的研究發現，小劑量辣椒素（50 μg/kg）可以激活 TRPV1，引起 CGRP 釋放增加，減輕兔氧化應激、炎癥反應，改善缺血再灌注損傷肺功能，而給予 TRPV1 拮抗劑辣椒平則保護作用消失 [7]。TRPV1 基因敲除小鼠在心臟缺血再灌注后，其心功能恢復明顯弱于野生型小鼠 [8]。大鼠遠端肢體缺血后處理通過激活 TRPV1 引起 CGRP 及 SP 表達增加，減輕心臟缺血再灌注損傷 [12]。TRPV1 通過增加 CGRP 及 SP 的釋放減輕玻璃體內注射門冬氨酸引起的視網膜神經節細胞損傷[13]。大鼠肝缺血再灌注損傷模型中，給予辣椒素及 CGRP 減輕肝炎癥反應和氧化應激，給予拮抗劑辣椒平及 CGRP837 可加重肝缺血再灌注損傷 [5]。這些研究表明，缺血前外源性激活 TRPV1 或給予 CGRP 可以減輕器官的缺血再灌注損傷，而在缺血前敲除 TRPV1 或者耗竭 CGRP，缺血后器官功能恢復會明顯受損。Zheng 等[14]研究表明 TRPV1 表達上調及 CGRP 釋放增加可減輕患有糖尿病大鼠心臟的缺血再灌注損傷。由此，我們推測，肺缺血再灌注損傷時，局部產生的炎性介質等激活辣椒素敏感的感覺神經末梢的 TRPV1，一方面引起神經肽類物質 CGRP 釋放減輕炎癥反應，另一方面通過增加自身表達參與肺缺血再灌注損傷的病理生理過程。
本實驗也存在一些不足之處。首先，本實驗檢測大鼠整個腦干 TRPV1 變化，沒有精確定位到延髓呼吸中樞，未測呼吸中樞神經肽含量。下一步實驗擬通過腦干切片結合免疫組化等實驗方法，觀察呼吸中樞 NTS TRPV1 的變化。其次，我們沒有設立外源性給予 CGRP 或 SP 的對照組觀察肺和腦干中 TRPV1 基因及蛋白的變化，進一步實驗應設立對照組研究神經肽對 TRPV1 的影響，對 TRPV1 在缺血再灌注損傷中的作用機制進行探索。
