間充質干細胞(MSCs)具有良好的成骨活性。隨著細胞和組織工程學的發展, 利用MSCs移植來治療骨損傷已成為新的治療模式。細胞質膜微囊(Caveolae)是細胞膜內陷形成的燒瓶狀質膜微區, 主要由膽固醇、鞘磷脂、蛋白質組成。小窩蛋白-1(Caveolin-1)是其主要的蛋白成分。Caveolae是細胞信號的整合器, 許多信號分子聚集在此與Caveolin-1結合, 調節細胞分化等生命活動。本文將簡要綜述Caveolae/Caveolin-1在MSCs成骨分化中的作用。
引用本文： 楊陽, 張綱. Caveolae/Caveolin-1在間充質干細胞成骨分化中的作用. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 821-824. doi: 10.7507/1001-5515.20160133 復制
引言
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潛能和活躍增殖能力，是骨組織工程的潛力種子細胞[1]。以往大量研究集中于添加外部刺激以優化MSCs成骨分化能力，近來MSCs的細胞膜成為關注熱點。細胞膜是細胞響應外界刺激的主要部位，上面分布有很多脂閥結構和細胞膜微區。細胞質膜微囊(Caveolae)是一種特殊的脂閥結構，是細胞表面的信息處理中心。小窩蛋白-1(Caveolin-1)作為其功能蛋白與各種信號分子相互作用，參與影響細胞增殖、分化等生命活動[2]。Caveolae結構缺失、Caveolin-1基因缺陷的MSCs表現出分化停滯在脂肪細胞或成骨細胞譜系。Caveolin-1基因敲除小鼠具有比野生型小鼠更多的骨量且從它們骨髓分離出的MSCs成骨分化能力更強[3]。Caveolin-1基因敲除MSCs不表達骨涎蛋白和形成鈣結節[4]。上述表明Caveolae/Caveolin-1參與調節了MSCs的成骨分化，研究其作用和作用機制對MSCs應用于臨床骨損傷修復十分重要。
1 Caveolae/Caveolin-1
Caveolae是細胞膜表面大小為50～100 nm的多樣化凹陷結構，周圍富有信號轉導涉及的大多數信號蛋白，是細胞的信號處理中心，主要承載抑制信號轉導的作用[5]。細胞受體和信號分子的相互作用是信號轉導的決定因素。Caveolae是一種調節細胞表面蛋白定位的特殊脂閥結構。其主要由膽固醇、鞘磷脂和蛋白質組成并具有特異性功能蛋白[6]。Caveolae為多種膜受體提供相互作用的場所。
Caveolin是Caveolae的特異性標志蛋白，分為Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3三種。Caveolin通過N端、C端膜結合域緊密結合于胞膜[7]，在終末分化的脂肪細胞、內皮細胞和成骨細胞等內含量豐富。Caveolin-1是組成Caveolae的主要蛋白，分子量為21～24 kD，由178個氨基酸組成，包括位于102～134殘基的中央高度保守的疏水區和兩側可變的N端、C端區域，前者插入細胞膜，后兩者游離于胞質。它有3個獨特的結構域：跨膜結構域、寡聚化結構域和腳手架結構域(Caveolin scaffolding domain, CSD)，其中CSD結構域序列在大多數能與之結合的蛋白質中表達。Caveolin-1通過CSD結構域固定各種信號分子的催化亞基使細胞處于穩態或抑制其參與由配體引導的信號轉導[8]。Caveolin-1作為受體通路的一部分在細胞增殖、分化、遷移中發揮著重要作用。
MSCs和成骨細胞表面都存在Caveolae且增殖較快的細胞表面Caveolae較少。細胞同時表達Caveolin-1和Caveolin-2，且表達Caveolin-1的量隨細胞分化而增加[9]。研究證實人MSCs中存在Caveolae和Caveolin-1[10]。該研究采用實時定量RT-PCR檢測了Caveolin-1的mRNA，采用免疫印跡和免疫熒光檢測了Caveolin-1蛋白。亞細胞分離結果表明Caveolin-1定位于Caveolae中，免疫熒光顯示Caveolin-1在細胞膜上呈點狀分布。超微結構觀察結果顯示成骨分化的MSCs表面可分離出類似Caveolae的膜結合囊泡。該研究還發現在MSCs亞細胞結構分離的底層也出現Caveolin-1，提示Caveolin-1還存在于MSCs的其他部位。已有研究證實Caveolin-1周期存在于細胞膜、內質網和高爾基體之間。
2 Caveolae/Caveolin-1參與MSCs成骨分化的信號轉導
MSCs具有自我更新和多向分化潛能。在膜內成骨和軟骨內成骨中，MSCs分化為成骨細胞的同時分泌胞外基質，隨著胞外基質的鈣化，成骨細胞被包埋在骨質中成為骨細胞[11]。
MSCs向成骨細胞分化是個復雜的過程，涉及多種信號通路包括促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、Notch、Smad通路等。近幾年研究得較為深入的是MAPK和Notch通路[12]。
目前在真核細胞中己確定有4條MAPK信號轉導通路：細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、P38和ERK5通路。近年研究表明ERK、P38和JNK通路參與了成骨分化的信號轉導[13]。這些通路中多數信號分子位于Caveolae附近，通過與Caveolin-1相互作用被招募到Caveolae。Caveolae是MSCs成骨分化信號復合體的集中站。信號分子的聚集使刺激信號在Caveolae內受到整合，影響信號通路下游分子在細胞內的信號傳遞，進一步影響MSCs成骨分化。研究表明哺乳動物和人類骨和軟骨細胞內都含有Caveolae和Caveolin[14]。Caveolae內存在豐富的Caveolin-1和信號蛋白如β-catenin，其被認為是參與骨骼改建的重要信號分子。Caveolin-1參與募集并改變信號分子。這些信號分子在Caveolae內與Caveolin-1的CSD結構域結合形成復合體使其攜帶的信號被抑制、放大甚至終止[15]。Caveolin-1表達量的改變也可以改變細胞信號，例如當Caveolin-1沉默時MAPK信號增強，當Caveolin-1過表達時信號抑制[16]。綜上所述，Caveolae/Caveolin-1在成骨分化信號轉導中起著重要作用。
3 Caveolae/Caveolin-1對MSCs成骨分化的影響
Caveolae/Caveolin-1與MSCs成骨分化緊密相關。兩者既相互統一，又有其特殊性。Caveolae為Caveolin-1參與調節成骨分化信號轉導提供場所；Caveolin-1是組成Caveolae不可或缺的部分。Caveolae也是大分子物質內吞的場所[17]。Caveolae/Caveolin-1從以下三個方面調節MSCs的成骨分化：①調節膽固醇含量；②參與大分子信號蛋白內吞；③通過Caveolin-1與信號分子相互作用調控成骨分化相關信號通路[18]。
3.1 Caveolae通過調節膽固醇含量調控MSCs成骨分化
Caveolae是細胞膽固醇含量的感受器，介導膽固醇的內流和外流。Caveolae內膽固醇含量的變化可改變Caveolae相關信號復合物的成分從而調節細胞內的信號轉導。例如耗竭MSCs胞膜膽固醇可以降低Caveolae內ERKs的復蘇，抑制MAPK1信號上調，阻止信號從細胞表面向胞核傳遞從而影響成骨分化[19]。Caveolae內膽固醇含量變化還可以抑制表皮生長因子參與的Caveolae內的信號轉導和應激活化信號在ERK通路中的轉導[20]。
3.2 Caveolae通過調節大分子蛋白內吞作用調控MSCs成骨分化
Caveolae參與大分子蛋白內吞和胞飲過程。大分子蛋白與細胞表面受體結合通過Caveolae收縮進入細胞的過程稱為受體介導的胞吞作用。Caveolae是細胞膜表面攝取蛋白質的特化部位，其細胞質面可形成質膜微囊小泡，包被與細胞膜表面受體結合的大分子蛋白[21]。成骨分化相關G蛋白偶聯受體、蛋白激酶C、一氧化氮合酶等位于Caveolae附近的細胞膜上。當細胞受到成骨分化信號刺激，上述信號分子和受體結合刺激多核糖體合成分泌蛋白并進入管腔運輸，形成轉運小泡與高爾基體膜融合轉化成扁平膜囊泡，完成分泌蛋白的修飾。扁平膜囊泡脫落到達細胞特定部位，完成信號分子的轉導[22]。
3.3 Caveolae的特異功能蛋白Caveolin-1對MSCs成骨分化的調控
Caveolin-1在MSCs成骨分化前后表達量明顯增加提示Caveolin-1對分化可能有約束作用。轉染Caveolin-1 siRNA的MSCs經成骨誘導培養顯示出增強的分化能力，堿性磷酸酶活性也升高。基因敲除Caveolin-1小鼠具有更粗大的骨骼表形，與抑制Caveolin-1表達的MSCs具有更強的成骨分化能力的結論相一致[23]。
細胞學研究表明：Caveolin-1基因缺失增加MSCs向成骨細胞分化。沉默Caveolin-1基因可以增強成骨細胞表型特征的表達。沉默后骨原細胞更傾向于向成骨表型的轉化。由此提示Caveolin-1可能是成骨細胞分化的標志，其低表達可能是成骨細胞前體細胞和骨原細胞轉化的基本特性。用慢病毒干擾野生型小鼠基質細胞Caveolin-1的表達，經成骨誘導其堿性磷酸酶活性增強，與成骨分化緊密相關的基因Osterix和Runx2的RNA表達增加，鈣化結節數增加[24]。
Caveolin-1參與調節MSCs向成骨細胞分化的具體機制還不明確。Caveolin-1缺失的小鼠具有增加的干細胞群和過度活化的β-catenin信號分子。由此推斷一種可能機制是Caveolin-1招募β-Catenin蛋白到Caveolae，β-Catenin易位轉入細胞核內，通過經典Wnt信號通路誘導MSCs分化的過程被Caveolin-1抑制[25]。
Caveolin-1缺失的情況下骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)促成骨分化的作用增強了。Caveolae內存在BMP受體，Caveolin-1可能通過與BMP受體作用抑制BMP對MSCs促成骨分化的作用[26]。另外，Caveolin-1可與BMP-6和血管內皮生長因子受體結合抑制信號分子的傳導，導致Osterix等轉錄因子的核易位減少，細胞成骨分化能力減弱[27]。
P38蛋白參與MSCs成骨分化與其引導的骨形成過程是公認的。P38磷酸化是干細胞成骨分化重要的一步。Caveolin-1還可能通過MARK通路影響P38磷酸化介導MSCs的分化過程[28]。血管內皮生長因子和BMP-6交互作用，可上調并激活P38絲裂原活化蛋白激酶，抑制蛋白激酶B活化，同時磷酸化同源蛋白Smads1/5/8促進MSCs成骨分化[28]。
綜上所述，MSCs是骨修復組織工程的重要細胞來源，在再生醫學中具有廣闊的應用前景。Caveolae/Caveolin-1在MSCs成骨分化中起著重要的調節作用但具體機制還不清楚。如何優化MSCs成骨分化能力并應用于臨床骨損傷修復還有待研究。
引言
間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化潛能和活躍增殖能力，是骨組織工程的潛力種子細胞[1]。以往大量研究集中于添加外部刺激以優化MSCs成骨分化能力，近來MSCs的細胞膜成為關注熱點。細胞膜是細胞響應外界刺激的主要部位，上面分布有很多脂閥結構和細胞膜微區。細胞質膜微囊(Caveolae)是一種特殊的脂閥結構，是細胞表面的信息處理中心。小窩蛋白-1(Caveolin-1)作為其功能蛋白與各種信號分子相互作用，參與影響細胞增殖、分化等生命活動[2]。Caveolae結構缺失、Caveolin-1基因缺陷的MSCs表現出分化停滯在脂肪細胞或成骨細胞譜系。Caveolin-1基因敲除小鼠具有比野生型小鼠更多的骨量且從它們骨髓分離出的MSCs成骨分化能力更強[3]。Caveolin-1基因敲除MSCs不表達骨涎蛋白和形成鈣結節[4]。上述表明Caveolae/Caveolin-1參與調節了MSCs的成骨分化，研究其作用和作用機制對MSCs應用于臨床骨損傷修復十分重要。
1 Caveolae/Caveolin-1
Caveolae是細胞膜表面大小為50～100 nm的多樣化凹陷結構，周圍富有信號轉導涉及的大多數信號蛋白，是細胞的信號處理中心，主要承載抑制信號轉導的作用[5]。細胞受體和信號分子的相互作用是信號轉導的決定因素。Caveolae是一種調節細胞表面蛋白定位的特殊脂閥結構。其主要由膽固醇、鞘磷脂和蛋白質組成并具有特異性功能蛋白[6]。Caveolae為多種膜受體提供相互作用的場所。
Caveolin是Caveolae的特異性標志蛋白，分為Caveolin-1、Caveolin-2、Caveolin-3三種。Caveolin通過N端、C端膜結合域緊密結合于胞膜[7]，在終末分化的脂肪細胞、內皮細胞和成骨細胞等內含量豐富。Caveolin-1是組成Caveolae的主要蛋白，分子量為21～24 kD，由178個氨基酸組成，包括位于102～134殘基的中央高度保守的疏水區和兩側可變的N端、C端區域，前者插入細胞膜，后兩者游離于胞質。它有3個獨特的結構域：跨膜結構域、寡聚化結構域和腳手架結構域(Caveolin scaffolding domain, CSD)，其中CSD結構域序列在大多數能與之結合的蛋白質中表達。Caveolin-1通過CSD結構域固定各種信號分子的催化亞基使細胞處于穩態或抑制其參與由配體引導的信號轉導[8]。Caveolin-1作為受體通路的一部分在細胞增殖、分化、遷移中發揮著重要作用。
MSCs和成骨細胞表面都存在Caveolae且增殖較快的細胞表面Caveolae較少。細胞同時表達Caveolin-1和Caveolin-2，且表達Caveolin-1的量隨細胞分化而增加[9]。研究證實人MSCs中存在Caveolae和Caveolin-1[10]。該研究采用實時定量RT-PCR檢測了Caveolin-1的mRNA，采用免疫印跡和免疫熒光檢測了Caveolin-1蛋白。亞細胞分離結果表明Caveolin-1定位于Caveolae中，免疫熒光顯示Caveolin-1在細胞膜上呈點狀分布。超微結構觀察結果顯示成骨分化的MSCs表面可分離出類似Caveolae的膜結合囊泡。該研究還發現在MSCs亞細胞結構分離的底層也出現Caveolin-1，提示Caveolin-1還存在于MSCs的其他部位。已有研究證實Caveolin-1周期存在于細胞膜、內質網和高爾基體之間。
2 Caveolae/Caveolin-1參與MSCs成骨分化的信號轉導
MSCs具有自我更新和多向分化潛能。在膜內成骨和軟骨內成骨中，MSCs分化為成骨細胞的同時分泌胞外基質，隨著胞外基質的鈣化，成骨細胞被包埋在骨質中成為骨細胞[11]。
MSCs向成骨細胞分化是個復雜的過程，涉及多種信號通路包括促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、Notch、Smad通路等。近幾年研究得較為深入的是MAPK和Notch通路[12]。
目前在真核細胞中己確定有4條MAPK信號轉導通路：細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、P38和ERK5通路。近年研究表明ERK、P38和JNK通路參與了成骨分化的信號轉導[13]。這些通路中多數信號分子位于Caveolae附近，通過與Caveolin-1相互作用被招募到Caveolae。Caveolae是MSCs成骨分化信號復合體的集中站。信號分子的聚集使刺激信號在Caveolae內受到整合，影響信號通路下游分子在細胞內的信號傳遞，進一步影響MSCs成骨分化。研究表明哺乳動物和人類骨和軟骨細胞內都含有Caveolae和Caveolin[14]。Caveolae內存在豐富的Caveolin-1和信號蛋白如β-catenin，其被認為是參與骨骼改建的重要信號分子。Caveolin-1參與募集并改變信號分子。這些信號分子在Caveolae內與Caveolin-1的CSD結構域結合形成復合體使其攜帶的信號被抑制、放大甚至終止[15]。Caveolin-1表達量的改變也可以改變細胞信號，例如當Caveolin-1沉默時MAPK信號增強，當Caveolin-1過表達時信號抑制[16]。綜上所述，Caveolae/Caveolin-1在成骨分化信號轉導中起著重要作用。
3 Caveolae/Caveolin-1對MSCs成骨分化的影響
Caveolae/Caveolin-1與MSCs成骨分化緊密相關。兩者既相互統一，又有其特殊性。Caveolae為Caveolin-1參與調節成骨分化信號轉導提供場所；Caveolin-1是組成Caveolae不可或缺的部分。Caveolae也是大分子物質內吞的場所[17]。Caveolae/Caveolin-1從以下三個方面調節MSCs的成骨分化：①調節膽固醇含量；②參與大分子信號蛋白內吞；③通過Caveolin-1與信號分子相互作用調控成骨分化相關信號通路[18]。
3.1 Caveolae通過調節膽固醇含量調控MSCs成骨分化
Caveolae是細胞膽固醇含量的感受器，介導膽固醇的內流和外流。Caveolae內膽固醇含量的變化可改變Caveolae相關信號復合物的成分從而調節細胞內的信號轉導。例如耗竭MSCs胞膜膽固醇可以降低Caveolae內ERKs的復蘇，抑制MAPK1信號上調，阻止信號從細胞表面向胞核傳遞從而影響成骨分化[19]。Caveolae內膽固醇含量變化還可以抑制表皮生長因子參與的Caveolae內的信號轉導和應激活化信號在ERK通路中的轉導[20]。
3.2 Caveolae通過調節大分子蛋白內吞作用調控MSCs成骨分化
Caveolae參與大分子蛋白內吞和胞飲過程。大分子蛋白與細胞表面受體結合通過Caveolae收縮進入細胞的過程稱為受體介導的胞吞作用。Caveolae是細胞膜表面攝取蛋白質的特化部位，其細胞質面可形成質膜微囊小泡，包被與細胞膜表面受體結合的大分子蛋白[21]。成骨分化相關G蛋白偶聯受體、蛋白激酶C、一氧化氮合酶等位于Caveolae附近的細胞膜上。當細胞受到成骨分化信號刺激，上述信號分子和受體結合刺激多核糖體合成分泌蛋白并進入管腔運輸，形成轉運小泡與高爾基體膜融合轉化成扁平膜囊泡，完成分泌蛋白的修飾。扁平膜囊泡脫落到達細胞特定部位，完成信號分子的轉導[22]。
3.3 Caveolae的特異功能蛋白Caveolin-1對MSCs成骨分化的調控
Caveolin-1在MSCs成骨分化前后表達量明顯增加提示Caveolin-1對分化可能有約束作用。轉染Caveolin-1 siRNA的MSCs經成骨誘導培養顯示出增強的分化能力，堿性磷酸酶活性也升高。基因敲除Caveolin-1小鼠具有更粗大的骨骼表形，與抑制Caveolin-1表達的MSCs具有更強的成骨分化能力的結論相一致[23]。
細胞學研究表明：Caveolin-1基因缺失增加MSCs向成骨細胞分化。沉默Caveolin-1基因可以增強成骨細胞表型特征的表達。沉默后骨原細胞更傾向于向成骨表型的轉化。由此提示Caveolin-1可能是成骨細胞分化的標志，其低表達可能是成骨細胞前體細胞和骨原細胞轉化的基本特性。用慢病毒干擾野生型小鼠基質細胞Caveolin-1的表達，經成骨誘導其堿性磷酸酶活性增強，與成骨分化緊密相關的基因Osterix和Runx2的RNA表達增加，鈣化結節數增加[24]。
Caveolin-1參與調節MSCs向成骨細胞分化的具體機制還不明確。Caveolin-1缺失的小鼠具有增加的干細胞群和過度活化的β-catenin信號分子。由此推斷一種可能機制是Caveolin-1招募β-Catenin蛋白到Caveolae，β-Catenin易位轉入細胞核內，通過經典Wnt信號通路誘導MSCs分化的過程被Caveolin-1抑制[25]。
Caveolin-1缺失的情況下骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)促成骨分化的作用增強了。Caveolae內存在BMP受體，Caveolin-1可能通過與BMP受體作用抑制BMP對MSCs促成骨分化的作用[26]。另外，Caveolin-1可與BMP-6和血管內皮生長因子受體結合抑制信號分子的傳導，導致Osterix等轉錄因子的核易位減少，細胞成骨分化能力減弱[27]。
P38蛋白參與MSCs成骨分化與其引導的骨形成過程是公認的。P38磷酸化是干細胞成骨分化重要的一步。Caveolin-1還可能通過MARK通路影響P38磷酸化介導MSCs的分化過程[28]。血管內皮生長因子和BMP-6交互作用，可上調并激活P38絲裂原活化蛋白激酶，抑制蛋白激酶B活化，同時磷酸化同源蛋白Smads1/5/8促進MSCs成骨分化[28]。
綜上所述，MSCs是骨修復組織工程的重要細胞來源，在再生醫學中具有廣闊的應用前景。Caveolae/Caveolin-1在MSCs成骨分化中起著重要的調節作用但具體機制還不清楚。如何優化MSCs成骨分化能力并應用于臨床骨損傷修復還有待研究。