機械牽拉對人支氣管上皮樣細胞氣道重塑相關因子表達的影響_《生物醫學工程學雜志》

作者：

余倩 ,  李敏超

重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科, 重慶 400010;

關鍵詞：

機械牽拉人支氣管上皮樣細胞轉化生長因子-β1 成纖維細胞生長因子-2

DOI：

10.7507/1001-5515.20160149

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

本文為了研究機械牽拉人支氣管上皮樣細胞（16HBE）對轉化生長因子-β1（TGF-β1）、成纖維細胞生長因子-2（FGF-2）表達的影響及其相關信號轉導機制。采用柔性基底加載裝置（FX-4000T）牽拉16HBE細胞，參數設置為拉伸幅度15%，頻率1 Hz，加載時間分別為：0.5 h、1 h、1.5 h、2 h。選擇TGF-β1、FGF-2和Ca²⁺表達較高的一組以經典瞬時感受器電位1（TRPC1）抑制劑SKF96365、蛋白激酶C（PKC）抑制劑HA-100干預。發現與空白對照組相比，4個時間段TGF-β1、FGF-2和Ca²⁺的表達均高于空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），在0.5 h時其增幅最大。對0.5 h機械牽拉組予以SKF96365、HA-100干預，其TGF-β1、FGF-2和Ca²⁺的表達均較0.5 h機械牽拉組降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。本文研究結果說明，機械牽拉16HBE細胞可導致氣道重塑相關因子表達增加，PKC、TRPC1、Ca²⁺可能參與了該信號通路。

引用本文： 余倩, 李敏超. 機械牽拉對人支氣管上皮樣細胞氣道重塑相關因子表達的影響. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(5): 923-930. doi: 10.7507/1001-5515.20160149 復制

引言

慢性氣道炎癥性疾病如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和支氣管哮喘等，因大量黏液分泌、纖維組織增生、支氣管平滑肌痙攣等，使小氣道內存在持續異常增高的壓力，導致反復損傷后修復，最終引起氣道重塑。研究表明，機械牽拉刺激會引起氣道重塑，導致肺功能下降，而炎癥細胞因子、轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)可能參與了該病理進程^[1-3]。轉化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)涉及上皮轉化、上皮下纖維化、氣道平滑肌重塑、微血管改變和黏液產生^[4-5]；成纖維細胞生長因子-2 (fibroblast growth factor-2, FGF-2)刺激成纖維細胞和肌成纖維細胞釋放膠原和蛋白多糖，二者是參與組織修復、誘導氣道增厚，進而導致氣道重塑的重要細胞因子^[6]。另一方面，人體有許多感受機械牽拉的效應細胞，可通過信號轉導將機械牽拉力轉變為生物信號^[7]，并且還存在一種瞬時感受器電位(transient receptor potential, TRP)通道廣泛分布在細胞膜及細胞器膜上，在機械牽拉的信號轉導過程中有重要意義。其中，經典瞬時感受器電位1(canonical transient receptor potential, TRPC1)是脊椎動物的重要張力敏感性離子通道^[8]，其激活依賴于蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的磷酸化作用^[9]。另有相關研究證實，機械牽拉作用于人氣道平滑肌細胞可引起Ca²⁺內流，并使其收縮、增殖和重塑^[10-11]。所以本課題組采用細胞柔性基底加載裝置(flexercell tension plus system，FX-4000T)使人支氣管上皮樣細胞(human bronchial epithelial cells, 16HBE)產生形變來模擬人體氣道感受氣道內高壓刺激的過程，探討PKC、TRPC1、Ca²⁺是否參與了該信號通路，從而導致TGF-β1、FGF-2細胞因子的表達增高，最終導致氣道重塑。本實驗為探明機械牽拉作用對16HBE細胞中氣道重塑相關因子表達的影響以及今后對相關信號通路的機制研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

細胞柔性基底加載裝置(FX-4000T，美國FlexCell公司)；人支氣管上皮樣細胞(16HBE)購自美國標準培養收集所；RPMI 1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體購自美國Abcam公司；小鼠抗人FGF-2單克隆抗體、HA-100(PKC抑制劑)購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、Fluo-3AM(Ca²⁺熒光探針)購自北京碧云天生物技術研究所；山羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司；TRNzol Universal總RNA提取試劑購自北京天根生化科技有限公司；高效率逆轉錄試劑盒ReverTra Ace-α-購自上海東洋紡生物科技有限公司；iTaq^TM universal SYBR^? Green Supermix購自美國BIO-RAD公司；聚氧乙烯聚氧丙烯F-127 (Pluronic F-127)購自北京泛博生物化學有限公司；SKF96365(TRPC1抑制劑)購自美國Sigma公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養與分組

16HBE細胞培養于25 cm²培養瓶并加入RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)于37 ℃、5%CO₂的培養箱中培養，每隔48 h換液，待細胞融合至70%~80%時傳代。實驗前，將細胞以5×10⁵個/孔的密度接種于包被I型膠原的硅膠6孔彈性膜培養板(美國FlexCell公司)上。將細胞分為以下各組：①空白對照組：細胞接種于包被I型膠原的6孔板上，各孔均含有2 mL RPMI1640培養基，實驗時與機械牽拉加載細胞置于同一細胞培養箱中，無機械牽拉刺激；②機械牽拉組：細胞接種于上述6孔板上，各孔均含有2 mL RPMI1640培養基，予以15%拉伸幅度，加載時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，加載頻率為1 Hz；③機械牽拉+SKF96365組：選擇機械牽拉組中TGF-β1、FGF-2和Ca²⁺相對表達較高的時間段組，在機械牽拉前予以1 μmol/L SKF96365干預處理；④機械牽拉+HA-100組：選擇機械牽拉組中TGF-β1、FGF-2和Ca²⁺相對表達較高的時間段組，在機械牽拉前予以35 mg/mL HA-100干預處理。

1.3 Western blot檢測各組TGF-β1、FGF-2蛋白的表達

用含1%苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay)裂解液(RIPA lysis buffer)提取各組細胞的蛋白，應用BCA (bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(enhanced BCA protein assay kit)測定各組蛋白濃度，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，將印跡轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，脫脂奶粉封閉，小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體(1:1 000)、小鼠抗人FGF-2單克隆抗體(1:500)、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1:1 000)4 ℃孵育過夜；洗膜后，山羊抗鼠IgG(1:3 000)，37 ℃孵育1 h。超敏電化學發光(electrochemiluminescence, ECL)試劑(BeyoECL Plus)發光顯影，掃描并保存。Western blot法檢測各組TGF-β1、FGF-2蛋白表達水平。用Quantity one分析軟件行光密度面積積分分析，以與對應內參GAPDH的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測各組TGF-β1、FGF-2 mRNA的表達

采用TRNzol Universal法分別提取各組細胞內總RNA，按高效率逆轉錄試劑盒ReverTra Ace-α-法逆轉錄合成相應cDNA。TGF-β1的上游引物為：5′-GCAACAATTCCTGGCGATAC-3′，TGF-β1的下游引物為：5′-CTAAGGCGAAAGCCCTCAA T-3′；FGF-2的上游引物為：5′-CAAGCGGCTGT ACTGCAAAA-3′，FGF-2的下游引物為：5′-TAGC TTGATGTGAGGGTCGC-3′；GAPDH的上游引物為：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，GAPDH的下游引物為：5′-AGGGGCCATCCACAGTC TTC-3′。PCR的反應體系為：iTaq^TM universal SYBR^? Green Supermix(2×) 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，cDNA 1.6 μL，H₂O 6.8 μL，共20 μL，每個樣本設置3個復孔。反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。采用2^-ΔΔCt法進行各組TGF-β1、FGF-2 mRNA表達的相對定量分析。

1.5 流式細胞術檢測各組細胞內鈣離子熒光強度

在1.2小節實驗分組的基礎上，增設1組陰性對照組，其相較于空白對照組，需負載與各實驗組等量的Fluo-3AM和Pluronic F-127。將除空白對照組外的各組細胞重懸于無Ca²⁺緩沖液中，加入終濃度為5 μmol/L的Fluo-3AM和終濃度為0.05%的Pluronic F-127，37 ℃避光孵育30 min，而后用無Ca²⁺緩沖液洗滌3次，離心5 min后，用無Ca²⁺緩沖液1 mL重懸。而空白對照組消化重懸于1 mL無Ca²⁺緩沖液中。以上各處理組，于流式細胞儀488 nm激發波長檢測。

1.6 統計學分析

采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間比較應用t檢驗，P < 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot分析各組蛋白表達差異

15%拉伸幅度，以1 Hz頻率加載，分別作用0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后TGF-β1蛋白相對表達量為(1.53±0.05、0.70±0.03、0.72±0.05、0.89±0.05)，均高于空白對照組(0.40±0.02)，差異均有統計學意義(P < 0.05)。上述4個時間點FGF-2蛋白相對表達量(1.65±0.08、0.70±0.07、0.75±0.03、0.98±0.03)，均高于空白對照組(0.58±0.05)，差異均有統計學意義(P < 0.05)，結果如圖 1所示。

圖1 不同加載時間TGF-β1、FGF-2蛋白的相對表達量

*與空白對照組相比，P < 0.05

Figure1. Relative expression of TGF-β1, FGF-2 proteins at different time after loading

*P < 0.05 vs. blank control group

圖選項

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《生物醫學工程學雜志》

機械牽拉對人支氣管上皮樣細胞氣道重塑相關因子表達的影響

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

引言

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.2 細胞培養與分組

1.3 Western blot檢測各組TGF-β1、FGF-2蛋白的表達

1.4 實時熒光定量PCR法檢測各組TGF-β1、FGF-2 mRNA的表達

1.5 流式細胞術檢測各組細胞內鈣離子熒光強度

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 Western blot分析各組蛋白表達差異

2.2 實時熒光定量PCR法檢測各組mRNA的表達差異

2.3 流式細胞術檢測各組胞內Ca2+熒光強度

3 討論

引言

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.2 細胞培養與分組

1.3 Western blot檢測各組TGF-β1、FGF-2蛋白的表達

1.4 實時熒光定量PCR法檢測各組TGF-β1、FGF-2 mRNA的表達

1.5 流式細胞術檢測各組細胞內鈣離子熒光強度

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 Western blot分析各組蛋白表達差異

2.2 實時熒光定量PCR法檢測各組mRNA的表達差異

2.3 流式細胞術檢測各組胞內Ca2+熒光強度

3 討論

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摘要全文圖表視頻參考文獻施引文獻補充材料

2.3 流式細胞術檢測各組胞內Ca²⁺熒光強度

2.3 流式細胞術檢測各組胞內Ca²⁺熒光強度