氟[18F]標記黃連素衍生物（氟[18F]HX-01）是一種潛在的正電子發射計算機斷層顯像（PET）腫瘤顯像劑，而能量狀態不同、無放射性的標準對照品（氟[19F]HX-01）的物理性質及化學性質與其完全相同。本文通過研究氟[19F]HX-01 在體外人肝癌細胞和人正常細胞中有無選擇性分布的現象，從而為進一步完成活體內氟[18F]HX-01 肝癌 PET 顯像奠定基礎。本文利用小檗紅堿和 3-氟丙醇在堿催化作用下，一步反應制備氟[19F]HX-01；課題組選取人正常肝細胞（HL-7702）與人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）為實驗細胞材料，于熒光顯微鏡下觀察[19F]HX-01 在細胞內的定位；用細胞增殖活性檢測試劑盒（CCK-8）測定氟[19F]HX-01 對上述細胞的增殖抑制作用及其對細胞的毒性作用。本文研究結果顯示：① 氟[19F]HX-01 與人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 的結合能力明顯高于人正常肝細胞 HL-7702；② 氟[19F]HX-01 對 HepG2、SMMC-7721 以及 HL-7702 的細胞增殖抑制作用具有劑量依賴效應；③ 氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞 HL-7702 的毒性作用較 SMMC-7721、HepG2 更低。上述體外研究結果表明：氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）較人正常肝細胞（HL-7702）具有更高選擇性和更高毒性。以此為基礎，放射性對照品氟[18F]HX-01 有望進一步開發成為潛在肝癌 PET 顯像分子探針。
引用本文： 張彤, 吳小艾, 蔡華偉, 梁夢, 范成中. 黃連素衍生物（氟[19F]HX-01）體外靶向肝癌的初步研究 . 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(2): 253-259. doi: 10.7507/1001-5515.201604025 復制
引言
黃連在中醫的應用已逾 2000 年[1]，復方黃連制劑至今仍然是我國普遍應用的傳統中藥。1959 年，Hano[2]報道了黃連素具有抗腫瘤活性，從此激發了人們研究黃連和黃連素治療癌癥的濃厚興趣。大量黃連素及其衍生物在體外細胞抗癌研究的證據表明：黃連素可抑制多種癌細胞增殖和遷移，誘導癌細胞凋亡，對多種癌細胞具有細胞毒性——即廣譜抗癌活性[3-8]。
課題組前期用正電子核素18F 成功標記黃連素衍生物（氟[18F]HX-01），經靜脈注射進入荷載了兔肝鱗癌細胞株（VX2）肌肉腫瘤模型的兔子體內，利用氟[18F]HX-01 分子中18F 釋放正電子湮沒產生的 γ 光子對，用正電子發射計算機斷層顯像（positron emission tomography，PET）設備探測 γ 光子對并生成圖像，完成了兔 VX2 肌肉腫瘤模型 PET 顯像，獲得腫瘤高對比度影像[9-10]。
近年的系列研究發現：黃連素及其衍生物可選擇性誘導人肝癌細胞死亡，但對人的正常肝細胞無細胞毒性，表明黃連素及其衍生物具有肝癌靶向細胞毒性，有可能成為有前途的多功能抗肝癌藥物[11]。課題組擬進一步探討氟[18F]HX-01 應用于人肝癌 PET 顯像的可行性。
由于無放射性標準對照品氟[19F]HX-01 與氟[18F]HX-01 物理性質及化學性質完全相同，僅能量狀態不同，不能釋放正電子湮沒產生的 γ 光子對，但氟[19F]HX-01 分子核團具有自發熒光，因此，本項目擬研究氟[19F]HX-01 在體外人肝癌細胞和人正常細胞中有無選擇性分布的現象，為進一步完成活體內氟[18F]HX-01 肝癌 PET 顯像奠定基礎。課題組首先合成了非放射性標準品氟[19F]HX-01；用熒光顯微鏡觀察[19F]HX-01 在人正常肝細胞（HL-7702）與人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）內的定位分布；再用細胞增殖活性檢測試劑盒（CCK-8法）測定氟[19F]HX-01 對正常肝細胞（HL-7702）與人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）的增殖抑制作用及其對細胞的毒性作用。最終擬通過探討氟[19F]HX-01 在人肝癌細胞中有無選擇性分布這一結果，為進一步完成活體內氟[18F]HX-01 肝癌 PET 顯像積累資料。
1 材料
1.1 細胞株
人肝癌細胞株 HepG2、SMMC-7721 及人正常肝細胞 HL-7702 購自美國模式菌種收藏所（Ameri-can type culture collection，ATCC）。
1.2 試劑
RPMI 1640 培養液、DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶（HycLone，美國）；小牛血清（四季青生物公司，中國）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（GIBCO，美國）；細胞增殖活性檢測試劑盒（CCK-8）（七海復泰生物科技有限公司，中國）；小檗紅堿（薩恩化學技術有限公司，中國）；碳酸銫（Sigma，美國）。
1.3 儀器
熒光顯微鏡（Olympus 公司 micropublisher 3.3RTV，日本）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；高速離心機（日立公司 TGL-16G-A，日本）；CO2 培養箱（三洋 SANYO MCO-175，日本）；酶聯免疫檢測儀（南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司，中國）。
2 方法
2.1 細胞培養
將人肝癌細胞株（SMMC-7721、HepG2）、人正常肝細胞株（HL-7702）接入 25 cm2 培養瓶，SMMC-7721 細胞與 HL-7702 細胞培養于含 10% 小牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素的 RPMI 1640 完全培養液中。HepG2 培養于含 10% 小牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素的 DMEM 高糖完全培養液中。均置于 37 ℃、5% 二氧化碳培養箱中孵育，每日用倒置顯微鏡觀察細胞形態及生長情況，2～3 d 換 1 次培養液。HL-7702 細胞 3～4 d 傳代 1 次，SMMC-7721 細胞及 HepG2 細胞 2～3 d 傳代一次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。
2.2 氟[19F]HX-01 的合成及鑒定
將小檗紅堿（357 mg，1 mmol）與 3′-氟對甲苯磺酸丙酯（即對甲苯磺酰基保護的三氟丙醇）（232 mg，1 mmol）溶于 10 mL 乙腈，攪拌下加入碳酸銫（325 mg，1 mmol），80℃ 下反應 6 h，薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢測。反應完全后，將此反應液用二氯甲烷萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后柱層析分離，得到產品氟[19F]HX-01。
將得到的產品氟[19F]HX-01 經核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）和質譜（mass spectrum，MS）檢測，進行結構鑒定。
2.3 細胞攝取與定位
細胞 HepG2、SMMC-7721 及 HL-7702 傳至第 6 代，用 0.25% 胰酶消化，收集處于對數生長期的細胞，并調整單細胞懸液的細胞密度為 1×104 個/cm2，接種于 96 孔培養板，每孔 100 μL。37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度下培養 24 h，待細胞貼壁后，吸棄孔內相應培養液，加入含不同濃度的氟[19F]HX-01（25、50、100 μmol/L）的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（含 0.5% 小牛血清），每孔 100 μL，每個濃度 3 個復孔，同時設細胞對照組（僅加入 PBS 和細胞，不添加氟[19F]HX-01）和空白對照組（僅加入 PBS，不含細胞和氟[19F]HX-01），37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度下作用 1 h 后，吸棄孔內液體，PBS 沖洗 3 次后，利用氟[19F]HX-01 分子結構核的自發熒光，于熒光顯微鏡 488 nm 激發波長下觀察細胞對氟[19F]HX-01 的攝取及其在細胞內的定位分布。
2.4 CCK-8 法測定對細胞增殖抑制作用以及毒性作用
將 SMMC-7721、HepG2 及 HL-7702 細胞傳至第 5 代，并經胰酶消化，并吹打成均勻懸液，以 5×104 個/mL 的濃度接種于 96 孔板，每孔 100 μL 培養液。37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度下培養 24 h，待細胞貼壁后，吸棄孔內液體，按不同濃度（0、25、50、100 μmol/L）將氟[19F]HX-01 加入細胞孔內，每個濃度組設 12 個復孔，并且對應不同的氟[19F]HX-01 濃度組分別另取 3 個孔加入 0.5% DMSO 作為 DMSO 對照組（因 DMSO 對細胞具有毒性作用，故設立此組排除 DMSO 對細胞存活率的干擾），每孔均含 100 μL 培養基。另外向 3 個空孔中僅加入培養基作為空白對照組（control check，CK）。分別在 0、24、48、72 h 時取每個藥物濃度組對應的 3 個復孔和 DMSO 組進行 CCK-8 檢測。小心吸去待檢測孔內的培養基，每次測量前重新加入含 6 μL CCK-8 試劑的 100 μL 無血清培養基，37 ℃、5% 的二氧化碳培養箱內孵育 4 h，4 h 后，使用酶標儀檢測各孔中 450 nm 下的光吸收值（optical density，OD）。根據 OD450 計算細胞存活率，存活率=（該濃度時間點組 OD450–空白對照組平均 OD450）/（0 μmol/L 細胞對照組 0 h OD450–空白對照組平均 OD450）×100%。實驗重復 3 次，結果取平均值。
細胞毒性實驗中 3 種細胞培養、接種及測量方法，與細胞增殖抑制實驗處理相同，區別在于：① 每孔接種細胞數為 1×105 個/mL。② 以不同濃度（0、5、10、20，50、100 μmol/L）氟[19F]HX-01 作用 48 h 后進行 CCK-8 法檢測。③ 3 種細胞每組濃度設 3 個復孔。④ 孵育細胞所用培養基僅含 0.5% 小牛血清，目的是在保證細胞營養補給的情況下，利于測量氟[19F]HX-01 對細胞的毒性作用。
對于細胞增殖抑制實驗，比較的是同種細胞在不同氟[19F]HX-01 濃度、同一作用時間點的細胞存活率；對于細胞毒性實驗，比較的是不同細胞在同一氟[19F]HX-01 濃度及作用時間點的細胞存活率。
2.5 統計方法
統計數據均以均數±標準差表示，采用 SPSS 17.0 統計分析軟件進行單因素方差分析比較細胞的存活率，當P<0.05 時，認為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 [19F]HX-01 的合成及鑒定
3.1.1 [19F]HX-01 的合成 利用對甲基苯磺酰基保護的三氟丙醇與小檗紅堿在碳酸銫的催化下反應，即可制備[19F]HX-01，如圖 1 所示。該合成方法簡便，便于分離，共得到產品氟[19F]HX-01 166 mg，產率 40%。
圖1
氟[19F]HX-01 的合成線路圖
Figure1.
Synthesis chart of fluoro[19F]HX-01
3.1.21H NMR 圖譜 氟[19F]HX-01的1H NMR 表征數據如下：1H（400 MHz，DMSO-d6） δ 9.79（s，1 H），8.95（s，1 H），8.21（d，J=9.1 Hz，1 H），8.00（d，J=9.1 Hz，1 H），7.80（s，1 H），7.10（s，1 H），6.18（s，2 H），4.95（t，J=6.3 Hz，2 H），4.80（t，J=5.9 Hz，1 H），4.68（t，J=5.9 Hz，1 H），4.41（t，J=6.4 Hz，2 H），4.06（s，3 H），3.21（t，J=6.3 Hz，2 H），2.28（ddt，J=25.8，12.4，6.2 Hz，3 H），如圖 2 所示。
圖2
氟[19F]HX-01 的1H NMR 圖譜
Figure2.
1H NMR spectrum of fluoro[19F]HX-01
3.1.3 質譜 電噴霧電離-質譜（electrospray ionization-mass spectrum，ESI-MS）（m/z）結果顯示為：382.1 [M]+，如圖 3 所示，即鑒定結果測定氟[19F]HX-01 的質譜的分子離子峰為 382.1，與其化學結構式計算理論值一致，說明所得產物為目標化合物氟[19F]HX-01。
圖3
氟[19F]HX-01 的質譜圖
Figure3.
Mass spectrum of fluoro[19F]HX-01
3.2 氟[19F]HX-01 在細胞內定位分布特性
利用氟[19F]HX-01 分子結構核的自發熒光，于 488 nm 激發波長，用熒光顯微鏡觀察人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 和人正常肝細胞 HL-7702 攝取氟[19F]HX-01 及其在細胞內的定位分布特性。如圖 4 所示，氟[19F]HX-01 在人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 和人正常肝細胞 HL-7702 內顯示不同的細胞內熒光信號分布特征。以低濃度 25 μmol/L 氟[19F]HX-01 孵育 1 h，氟[19F]HX-01 首先聚集在 HepG2、SMMC-7721 細胞線粒體內，而 HL-7702 細胞內幾乎看不見熒光信號；當濃度調整為 50 μmol/L 孵育 1 h，HepG2、SMMC-7721 線粒體內的熒光信號明顯增強，而 HL-7702 仍然未見明顯熒光信號；當濃度升高到 100 μmol/L 孵育 1 h 時，氟[19F]HX-01 對 HepG2、SMMC-7721 的線粒體膜和核膜顯示出很強的穿透能力和破壞性影響，并可進入細胞核內，而正常肝細胞 HL-7702 內僅隱約可見微弱的熒光信號。以上研究結果顯示：氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 較人正常肝細胞 HL-7702 具有更高的選擇性，而且氟[19F]HX-01 首先在人肝癌細胞線粒體內聚集，隨著藥物濃度的增高，氟[19F]HX-01 逐漸往細胞核聚集；而即使在較高氟[19F]HX-01 濃度下（100 μmol/L），人正常肝細胞 HL-7702 內僅見微弱的熒光信號。
圖4
不同濃度下三種細胞熒光圖像（×40）
Figure4.
Fluorescence images of three types of cells in different concentrations (×40)
3.3 氟[19F]HX-01 對細胞的增殖抑制及毒性作用
如圖 5 所示，氟[19F]HX-01 在對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG-2 以及人正常肝細胞 HL-7702 三種細胞的增殖抑制上具有劑量依賴效應。各給藥組的細胞存活率均明顯降低，且隨著氟[19F]HX-01 濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率下降更明顯。三種細胞在相同的藥物作用時間點，隨著氟[19F]HX-01 濃度的增加，細胞增殖抑制率均隨之增加；同一濃度，隨著氟[19F]HX-01 作用時間的延長，細胞增殖抑制率亦增加，P<0.05，差異有統計學意義。
圖5
氟[19F]HX-01 對三種細胞增殖抑制圖
Figure5.
Inhibition of fluoro[19F]HX-01 to proliferation of three type cells
而針對氟[19F]HX-01 對三種細胞的毒性作用，如圖 6 所示，在低濃度藥物（5、10 μmol/L）用藥 48 h 時，氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞 HL-7702 無明顯毒性作用，對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 表現為輕度毒性，且對 HepG2 細胞作用更加明顯，P<0.05，差異有統計學意義。隨著藥物濃度的增加，氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 具有明顯毒性作用，對人正常肝細胞 HL-7702 亦逐漸表現出毒性作用。細胞毒性實驗結果表明，氟[19F]HX-01 在低濃度時，對人正常肝細胞無明顯毒性，對人肝癌細胞具有輕度毒性作用，且對 HepG2 細胞毒性作用更強。在高濃度時，氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞及人肝癌細胞均表現出毒性作用，但對人肝癌細胞毒性作用更加明顯，P<0.05，差異有統計學意義。
圖6
氟[19F]HX-01 對三種細胞的毒性作用
Figure6.
Cellular cytotoxicity of fluoro[19F]HX-01 to three types of cells
4 討論
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康，并導致死亡的主要原因。其療效取決于建立在早期診斷、準確分期及早期監測治療反應基礎上作出的合理選擇手術、化療、放療、生物治療或聯合治療方案的有效決策。
18F-2-氟-2脫氧-D-葡萄糖（fluorine-18 fluoro-deoxyglucose，18F-FDG）PET 腫瘤顯像，已在腫瘤的早期診斷、分期、監測治療反應等方面發揮重要作用。然而，18F-FDG 不是腫瘤特異性顯像劑，炎癥、感染性病變均可高攝取18F-FDG，從而導致假陽性。高分化腺癌，如前列腺癌、肝癌等攝取18F-FDG 低或不攝取，則可導致假陰性。18F-FDG PET 腫瘤顯像診斷的假陽性和假陰性問題是臨床腫瘤診斷及鑒別診斷中亟待解決的世界性難題[12]，進一步開發新型 PET 腫瘤靶向分子顯像藥物，對解決目前18F-FDG PET 腫瘤顯像存在的難題具有重要價值。
越來越多黃連素及其衍生物體外抗癌研究表明黃連素及其衍生物具有廣譜抗癌活性[3-8]、多功能抗肝癌靶向性[11]和安全性[13-14]，可能成為有前途的抗癌藥物。黃連素及其衍生物分子結構中有親脂性的季氨氮基團，致其可穿過細胞膜進入細胞。它還可電離為+1 價的陽離子，這可能是其在腫瘤細胞跨膜電位差（Δψm）驅動力作用下，選擇性聚集在腫瘤細胞線粒體內的結構基礎[15]。
課題組前期用正電子核素18F 標記黃連素衍生物（放射性氟[18F]HX-01），完成了兔 VX2 肌肉腫瘤模型PET顯像，獲得了腫瘤的高對比度影像[9-10]。
結合近年的系列研究發現：黃連素及其衍生物可選擇性誘導人肝癌細胞死亡，但對人的正常肝細胞沒有細胞毒性，表明黃連素及其衍生物具有肝癌靶向細胞毒性，有可能成為有前途的多功能抗肝癌藥物[11]。因此，我們設想氟[18F]HX-01 在生物活體內可能具有肝癌靶向性。
本研究根據氟[19F]HX-01 自發熒光特性，首先采用熒光顯微鏡觀察氟[19F]HX-01 在人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 及人正常肝細胞 HL-7702 中的定位。發現氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 較正常肝細胞 HL-7702 具有更高的選擇性，而且氟[19F]HX-01 首先在人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 線粒體內聚集，這與 Serafim 等[16]研究證明黃連素在低濃度時（12.5～50 μmol/L）聚集在腫瘤細胞線粒體，而在高濃度時（>50 μmol/L）黃連素逐漸聚集在細胞核中相符。另外黃連素衍生物靶向腫瘤細胞可能涉及多靶點、多通路，具有多功能腫瘤靶向性。因此本文通過 CCK-8 法測定氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞株 SMMC-7721、HepG2 和人正常肝細胞 HL-7702 的增殖抑制及毒性作用，表明氟[19F]HX-01 在對 3 種細胞的增殖抑制上具有劑量依賴效應；另外本文研究結果表明，氟[19F]HX-01 在低藥物濃度時，對人正常肝細胞 HL-7702 無明顯毒性作用，對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 表現為輕度毒性；在高濃度時，氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞及人肝癌細胞均表現出毒性作用，但對人肝癌細胞毒性作用更加明顯。這與早期報道相符合：黃連素在低濃度時主要表現出細胞抑制作用而不表現細胞毒性作用[16]；在多項臨床試驗藥物濃度作用下，黃連素不具有細胞毒性作用[17-18]。
綜上所述，本研究合成新型氟化衍生物氟[19F]HX-01，將其用于比較人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 與人正常肝細胞 HL-7702 的攝取差異、其在細胞內定位分布特性以及不同濃度氟[19F]HX-01 對肝癌細胞及正常肝細胞的增殖及毒性作用，驗證了氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞（SMMC-7721、HepG2）具有更高的選擇性而對人正常肝細胞（HL-7702）毒性低。本實驗作為體外研究結果可為后續進一步開展放射性氟[18F]HX-01 肝癌腫瘤模型動物 PET 顯像奠定基礎。課題組將開展最終目標為篩選、開發一類有完全自主知識產權的 PET 正電子多功能惡性腫瘤靶向性放射性新藥的研究，這將對建立新型有效的肝癌 PET 分子顯像方法、監測惡性腫瘤進展、早期評價抗腫瘤藥物治療療效具有獨特意義；對促進解決目前18F-FDG PET 臨床腫瘤顯像面臨的世界性難題，具有一定的科學意義及應用價值。
引言
黃連在中醫的應用已逾 2000 年[1]，復方黃連制劑至今仍然是我國普遍應用的傳統中藥。1959 年，Hano[2]報道了黃連素具有抗腫瘤活性，從此激發了人們研究黃連和黃連素治療癌癥的濃厚興趣。大量黃連素及其衍生物在體外細胞抗癌研究的證據表明：黃連素可抑制多種癌細胞增殖和遷移，誘導癌細胞凋亡，對多種癌細胞具有細胞毒性——即廣譜抗癌活性[3-8]。
課題組前期用正電子核素18F 成功標記黃連素衍生物（氟[18F]HX-01），經靜脈注射進入荷載了兔肝鱗癌細胞株（VX2）肌肉腫瘤模型的兔子體內，利用氟[18F]HX-01 分子中18F 釋放正電子湮沒產生的 γ 光子對，用正電子發射計算機斷層顯像（positron emission tomography，PET）設備探測 γ 光子對并生成圖像，完成了兔 VX2 肌肉腫瘤模型 PET 顯像，獲得腫瘤高對比度影像[9-10]。
近年的系列研究發現：黃連素及其衍生物可選擇性誘導人肝癌細胞死亡，但對人的正常肝細胞無細胞毒性，表明黃連素及其衍生物具有肝癌靶向細胞毒性，有可能成為有前途的多功能抗肝癌藥物[11]。課題組擬進一步探討氟[18F]HX-01 應用于人肝癌 PET 顯像的可行性。
由于無放射性標準對照品氟[19F]HX-01 與氟[18F]HX-01 物理性質及化學性質完全相同，僅能量狀態不同，不能釋放正電子湮沒產生的 γ 光子對，但氟[19F]HX-01 分子核團具有自發熒光，因此，本項目擬研究氟[19F]HX-01 在體外人肝癌細胞和人正常細胞中有無選擇性分布的現象，為進一步完成活體內氟[18F]HX-01 肝癌 PET 顯像奠定基礎。課題組首先合成了非放射性標準品氟[19F]HX-01；用熒光顯微鏡觀察[19F]HX-01 在人正常肝細胞（HL-7702）與人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）內的定位分布；再用細胞增殖活性檢測試劑盒（CCK-8法）測定氟[19F]HX-01 對正常肝細胞（HL-7702）與人肝癌細胞（HepG2、SMMC-7721）的增殖抑制作用及其對細胞的毒性作用。最終擬通過探討氟[19F]HX-01 在人肝癌細胞中有無選擇性分布這一結果，為進一步完成活體內氟[18F]HX-01 肝癌 PET 顯像積累資料。
1 材料
1.1 細胞株
人肝癌細胞株 HepG2、SMMC-7721 及人正常肝細胞 HL-7702 購自美國模式菌種收藏所（Ameri-can type culture collection，ATCC）。
1.2 試劑
RPMI 1640 培養液、DMEM 高糖培養基、胰蛋白酶（HycLone，美國）；小牛血清（四季青生物公司，中國）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（GIBCO，美國）；細胞增殖活性檢測試劑盒（CCK-8）（七海復泰生物科技有限公司，中國）；小檗紅堿（薩恩化學技術有限公司，中國）；碳酸銫（Sigma，美國）。
1.3 儀器
熒光顯微鏡（Olympus 公司 micropublisher 3.3RTV，日本）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；高速離心機（日立公司 TGL-16G-A，日本）；CO2 培養箱（三洋 SANYO MCO-175，日本）；酶聯免疫檢測儀（南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司，中國）。
2 方法
2.1 細胞培養
將人肝癌細胞株（SMMC-7721、HepG2）、人正常肝細胞株（HL-7702）接入 25 cm2 培養瓶，SMMC-7721 細胞與 HL-7702 細胞培養于含 10% 小牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素的 RPMI 1640 完全培養液中。HepG2 培養于含 10% 小牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 鏈霉素的 DMEM 高糖完全培養液中。均置于 37 ℃、5% 二氧化碳培養箱中孵育，每日用倒置顯微鏡觀察細胞形態及生長情況，2～3 d 換 1 次培養液。HL-7702 細胞 3～4 d 傳代 1 次，SMMC-7721 細胞及 HepG2 細胞 2～3 d 傳代一次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。
2.2 氟[19F]HX-01 的合成及鑒定
將小檗紅堿（357 mg，1 mmol）與 3′-氟對甲苯磺酸丙酯（即對甲苯磺酰基保護的三氟丙醇）（232 mg，1 mmol）溶于 10 mL 乙腈，攪拌下加入碳酸銫（325 mg，1 mmol），80℃ 下反應 6 h，薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢測。反應完全后，將此反應液用二氯甲烷萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，減壓旋干后柱層析分離，得到產品氟[19F]HX-01。
將得到的產品氟[19F]HX-01 經核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）和質譜（mass spectrum，MS）檢測，進行結構鑒定。
2.3 細胞攝取與定位
細胞 HepG2、SMMC-7721 及 HL-7702 傳至第 6 代，用 0.25% 胰酶消化，收集處于對數生長期的細胞，并調整單細胞懸液的細胞密度為 1×104 個/cm2，接種于 96 孔培養板，每孔 100 μL。37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度下培養 24 h，待細胞貼壁后，吸棄孔內相應培養液，加入含不同濃度的氟[19F]HX-01（25、50、100 μmol/L）的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（含 0.5% 小牛血清），每孔 100 μL，每個濃度 3 個復孔，同時設細胞對照組（僅加入 PBS 和細胞，不添加氟[19F]HX-01）和空白對照組（僅加入 PBS，不含細胞和氟[19F]HX-01），37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度下作用 1 h 后，吸棄孔內液體，PBS 沖洗 3 次后，利用氟[19F]HX-01 分子結構核的自發熒光，于熒光顯微鏡 488 nm 激發波長下觀察細胞對氟[19F]HX-01 的攝取及其在細胞內的定位分布。
2.4 CCK-8 法測定對細胞增殖抑制作用以及毒性作用
將 SMMC-7721、HepG2 及 HL-7702 細胞傳至第 5 代，并經胰酶消化，并吹打成均勻懸液，以 5×104 個/mL 的濃度接種于 96 孔板，每孔 100 μL 培養液。37 ℃、5% 二氧化碳飽和濕度下培養 24 h，待細胞貼壁后，吸棄孔內液體，按不同濃度（0、25、50、100 μmol/L）將氟[19F]HX-01 加入細胞孔內，每個濃度組設 12 個復孔，并且對應不同的氟[19F]HX-01 濃度組分別另取 3 個孔加入 0.5% DMSO 作為 DMSO 對照組（因 DMSO 對細胞具有毒性作用，故設立此組排除 DMSO 對細胞存活率的干擾），每孔均含 100 μL 培養基。另外向 3 個空孔中僅加入培養基作為空白對照組（control check，CK）。分別在 0、24、48、72 h 時取每個藥物濃度組對應的 3 個復孔和 DMSO 組進行 CCK-8 檢測。小心吸去待檢測孔內的培養基，每次測量前重新加入含 6 μL CCK-8 試劑的 100 μL 無血清培養基，37 ℃、5% 的二氧化碳培養箱內孵育 4 h，4 h 后，使用酶標儀檢測各孔中 450 nm 下的光吸收值（optical density，OD）。根據 OD450 計算細胞存活率，存活率=（該濃度時間點組 OD450–空白對照組平均 OD450）/（0 μmol/L 細胞對照組 0 h OD450–空白對照組平均 OD450）×100%。實驗重復 3 次，結果取平均值。
細胞毒性實驗中 3 種細胞培養、接種及測量方法，與細胞增殖抑制實驗處理相同，區別在于：① 每孔接種細胞數為 1×105 個/mL。② 以不同濃度（0、5、10、20，50、100 μmol/L）氟[19F]HX-01 作用 48 h 后進行 CCK-8 法檢測。③ 3 種細胞每組濃度設 3 個復孔。④ 孵育細胞所用培養基僅含 0.5% 小牛血清，目的是在保證細胞營養補給的情況下，利于測量氟[19F]HX-01 對細胞的毒性作用。
對于細胞增殖抑制實驗，比較的是同種細胞在不同氟[19F]HX-01 濃度、同一作用時間點的細胞存活率；對于細胞毒性實驗，比較的是不同細胞在同一氟[19F]HX-01 濃度及作用時間點的細胞存活率。
2.5 統計方法
統計數據均以均數±標準差表示，采用 SPSS 17.0 統計分析軟件進行單因素方差分析比較細胞的存活率，當P<0.05 時，認為差異具有統計學意義。
3 結果
3.1 [19F]HX-01 的合成及鑒定
3.1.1 [19F]HX-01 的合成 利用對甲基苯磺酰基保護的三氟丙醇與小檗紅堿在碳酸銫的催化下反應，即可制備[19F]HX-01，如圖 1 所示。該合成方法簡便，便于分離，共得到產品氟[19F]HX-01 166 mg，產率 40%。
圖1
氟[19F]HX-01 的合成線路圖
Figure1.
Synthesis chart of fluoro[19F]HX-01
3.1.21H NMR 圖譜 氟[19F]HX-01的1H NMR 表征數據如下：1H（400 MHz，DMSO-d6） δ 9.79（s，1 H），8.95（s，1 H），8.21（d，J=9.1 Hz，1 H），8.00（d，J=9.1 Hz，1 H），7.80（s，1 H），7.10（s，1 H），6.18（s，2 H），4.95（t，J=6.3 Hz，2 H），4.80（t，J=5.9 Hz，1 H），4.68（t，J=5.9 Hz，1 H），4.41（t，J=6.4 Hz，2 H），4.06（s，3 H），3.21（t，J=6.3 Hz，2 H），2.28（ddt，J=25.8，12.4，6.2 Hz，3 H），如圖 2 所示。
圖2
氟[19F]HX-01 的1H NMR 圖譜
Figure2.
1H NMR spectrum of fluoro[19F]HX-01
3.1.3 質譜 電噴霧電離-質譜（electrospray ionization-mass spectrum，ESI-MS）（m/z）結果顯示為：382.1 [M]+，如圖 3 所示，即鑒定結果測定氟[19F]HX-01 的質譜的分子離子峰為 382.1，與其化學結構式計算理論值一致，說明所得產物為目標化合物氟[19F]HX-01。
圖3
氟[19F]HX-01 的質譜圖
Figure3.
Mass spectrum of fluoro[19F]HX-01
3.2 氟[19F]HX-01 在細胞內定位分布特性
利用氟[19F]HX-01 分子結構核的自發熒光，于 488 nm 激發波長，用熒光顯微鏡觀察人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 和人正常肝細胞 HL-7702 攝取氟[19F]HX-01 及其在細胞內的定位分布特性。如圖 4 所示，氟[19F]HX-01 在人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 和人正常肝細胞 HL-7702 內顯示不同的細胞內熒光信號分布特征。以低濃度 25 μmol/L 氟[19F]HX-01 孵育 1 h，氟[19F]HX-01 首先聚集在 HepG2、SMMC-7721 細胞線粒體內，而 HL-7702 細胞內幾乎看不見熒光信號；當濃度調整為 50 μmol/L 孵育 1 h，HepG2、SMMC-7721 線粒體內的熒光信號明顯增強，而 HL-7702 仍然未見明顯熒光信號；當濃度升高到 100 μmol/L 孵育 1 h 時，氟[19F]HX-01 對 HepG2、SMMC-7721 的線粒體膜和核膜顯示出很強的穿透能力和破壞性影響，并可進入細胞核內，而正常肝細胞 HL-7702 內僅隱約可見微弱的熒光信號。以上研究結果顯示：氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 較人正常肝細胞 HL-7702 具有更高的選擇性，而且氟[19F]HX-01 首先在人肝癌細胞線粒體內聚集，隨著藥物濃度的增高，氟[19F]HX-01 逐漸往細胞核聚集；而即使在較高氟[19F]HX-01 濃度下（100 μmol/L），人正常肝細胞 HL-7702 內僅見微弱的熒光信號。
圖4
不同濃度下三種細胞熒光圖像（×40）
Figure4.
Fluorescence images of three types of cells in different concentrations (×40)
3.3 氟[19F]HX-01 對細胞的增殖抑制及毒性作用
如圖 5 所示，氟[19F]HX-01 在對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG-2 以及人正常肝細胞 HL-7702 三種細胞的增殖抑制上具有劑量依賴效應。各給藥組的細胞存活率均明顯降低，且隨著氟[19F]HX-01 濃度的增加和作用時間的延長，細胞存活率下降更明顯。三種細胞在相同的藥物作用時間點，隨著氟[19F]HX-01 濃度的增加，細胞增殖抑制率均隨之增加；同一濃度，隨著氟[19F]HX-01 作用時間的延長，細胞增殖抑制率亦增加，P<0.05，差異有統計學意義。
圖5
氟[19F]HX-01 對三種細胞增殖抑制圖
Figure5.
Inhibition of fluoro[19F]HX-01 to proliferation of three type cells
而針對氟[19F]HX-01 對三種細胞的毒性作用，如圖 6 所示，在低濃度藥物（5、10 μmol/L）用藥 48 h 時，氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞 HL-7702 無明顯毒性作用，對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 表現為輕度毒性，且對 HepG2 細胞作用更加明顯，P<0.05，差異有統計學意義。隨著藥物濃度的增加，氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 具有明顯毒性作用，對人正常肝細胞 HL-7702 亦逐漸表現出毒性作用。細胞毒性實驗結果表明，氟[19F]HX-01 在低濃度時，對人正常肝細胞無明顯毒性，對人肝癌細胞具有輕度毒性作用，且對 HepG2 細胞毒性作用更強。在高濃度時，氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞及人肝癌細胞均表現出毒性作用，但對人肝癌細胞毒性作用更加明顯，P<0.05，差異有統計學意義。
圖6
氟[19F]HX-01 對三種細胞的毒性作用
Figure6.
Cellular cytotoxicity of fluoro[19F]HX-01 to three types of cells
4 討論
惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康，并導致死亡的主要原因。其療效取決于建立在早期診斷、準確分期及早期監測治療反應基礎上作出的合理選擇手術、化療、放療、生物治療或聯合治療方案的有效決策。
18F-2-氟-2脫氧-D-葡萄糖（fluorine-18 fluoro-deoxyglucose，18F-FDG）PET 腫瘤顯像，已在腫瘤的早期診斷、分期、監測治療反應等方面發揮重要作用。然而，18F-FDG 不是腫瘤特異性顯像劑，炎癥、感染性病變均可高攝取18F-FDG，從而導致假陽性。高分化腺癌，如前列腺癌、肝癌等攝取18F-FDG 低或不攝取，則可導致假陰性。18F-FDG PET 腫瘤顯像診斷的假陽性和假陰性問題是臨床腫瘤診斷及鑒別診斷中亟待解決的世界性難題[12]，進一步開發新型 PET 腫瘤靶向分子顯像藥物，對解決目前18F-FDG PET 腫瘤顯像存在的難題具有重要價值。
越來越多黃連素及其衍生物體外抗癌研究表明黃連素及其衍生物具有廣譜抗癌活性[3-8]、多功能抗肝癌靶向性[11]和安全性[13-14]，可能成為有前途的抗癌藥物。黃連素及其衍生物分子結構中有親脂性的季氨氮基團，致其可穿過細胞膜進入細胞。它還可電離為+1 價的陽離子，這可能是其在腫瘤細胞跨膜電位差（Δψm）驅動力作用下，選擇性聚集在腫瘤細胞線粒體內的結構基礎[15]。
課題組前期用正電子核素18F 標記黃連素衍生物（放射性氟[18F]HX-01），完成了兔 VX2 肌肉腫瘤模型PET顯像，獲得了腫瘤的高對比度影像[9-10]。
結合近年的系列研究發現：黃連素及其衍生物可選擇性誘導人肝癌細胞死亡，但對人的正常肝細胞沒有細胞毒性，表明黃連素及其衍生物具有肝癌靶向細胞毒性，有可能成為有前途的多功能抗肝癌藥物[11]。因此，我們設想氟[18F]HX-01 在生物活體內可能具有肝癌靶向性。
本研究根據氟[19F]HX-01 自發熒光特性，首先采用熒光顯微鏡觀察氟[19F]HX-01 在人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 及人正常肝細胞 HL-7702 中的定位。發現氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞 HepG2、SMMC-7721 較正常肝細胞 HL-7702 具有更高的選擇性，而且氟[19F]HX-01 首先在人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 線粒體內聚集，這與 Serafim 等[16]研究證明黃連素在低濃度時（12.5～50 μmol/L）聚集在腫瘤細胞線粒體，而在高濃度時（>50 μmol/L）黃連素逐漸聚集在細胞核中相符。另外黃連素衍生物靶向腫瘤細胞可能涉及多靶點、多通路，具有多功能腫瘤靶向性。因此本文通過 CCK-8 法測定氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞株 SMMC-7721、HepG2 和人正常肝細胞 HL-7702 的增殖抑制及毒性作用，表明氟[19F]HX-01 在對 3 種細胞的增殖抑制上具有劑量依賴效應；另外本文研究結果表明，氟[19F]HX-01 在低藥物濃度時，對人正常肝細胞 HL-7702 無明顯毒性作用，對人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 表現為輕度毒性；在高濃度時，氟[19F]HX-01 對人正常肝細胞及人肝癌細胞均表現出毒性作用，但對人肝癌細胞毒性作用更加明顯。這與早期報道相符合：黃連素在低濃度時主要表現出細胞抑制作用而不表現細胞毒性作用[16]；在多項臨床試驗藥物濃度作用下，黃連素不具有細胞毒性作用[17-18]。
綜上所述，本研究合成新型氟化衍生物氟[19F]HX-01，將其用于比較人肝癌細胞 SMMC-7721、HepG2 與人正常肝細胞 HL-7702 的攝取差異、其在細胞內定位分布特性以及不同濃度氟[19F]HX-01 對肝癌細胞及正常肝細胞的增殖及毒性作用，驗證了氟[19F]HX-01 對人肝癌細胞（SMMC-7721、HepG2）具有更高的選擇性而對人正常肝細胞（HL-7702）毒性低。本實驗作為體外研究結果可為后續進一步開展放射性氟[18F]HX-01 肝癌腫瘤模型動物 PET 顯像奠定基礎。課題組將開展最終目標為篩選、開發一類有完全自主知識產權的 PET 正電子多功能惡性腫瘤靶向性放射性新藥的研究，這將對建立新型有效的肝癌 PET 分子顯像方法、監測惡性腫瘤進展、早期評價抗腫瘤藥物治療療效具有獨特意義；對促進解決目前18F-FDG PET 臨床腫瘤顯像面臨的世界性難題，具有一定的科學意義及應用價值。
