哮喘患者氣道黏液流變特性易發生變化引發氣道栓塞。Fe2O3 納米顆粒是一種可經氣道輸送的藥物載體，但其對氣道黏液流變特性的影響未見報道。本實驗用超聲波法分散 Fe2O3 納米顆粒，采用掃描電鏡、原子力顯微鏡和納米激光粒度及 zeta 電位分析儀對其分散結果進行表征；將分散后的 Fe2O3 納米顆粒加入到模擬哮喘氣道黏液中（終濃度分別為 0.03、0.3、0.4 mg/mL）。用旋轉流變儀進行流動曲線、屈服應力、大幅振蕩剪切檢測黏液流變學特性的變化。實驗結果顯示，Fe2O3 納米顆粒處理使模擬哮喘氣道黏液的零剪切粘度降低，且隨著剪切速率的增加，黏液的結纏速度降低；對照組模擬哮喘氣道黏液的屈服應力為 19.0 Pa，而經 Fe2O3 納米顆粒處理（0.03、0.3 和 0.4 mg/mL）的模擬哮喘黏液的屈服應力分別是為 17.0、0.99 和 0.7 Pa；經 Fe2O3 納米顆粒處理的模擬哮喘氣道黏液在大振幅掃描和低頻到高頻剪切震蕩掃描下，其粘彈性模量均出現了較明顯的變化。采用光學方法觀察氣道黏液結構的結果顯示，Fe2O3 納米顆粒破壞了黏液網狀結構。實驗結果表明，Fe2O3 納米顆粒會改變模擬哮喘氣道黏液的流變學特性，本研究的結果可為進一步開發基于 Fe2O3 納米顆粒的氣道黏液解黏劑奠定相應的理論基礎。
引用本文： 王佳麗, 羅明志, 劉志偉, 金陽, 梁帥, 劉磊, 姜興茂, 鄧林紅. Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的流變學性能影響 . 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(2): 193-199. doi: 10.7507/1001-5515.201608001 復制
引言
氣道黏液是一種異質性的凝膠樣材料，主要成分為黏蛋白和水，同時含有少量的細胞蛋白質（白蛋白、酶和免疫球蛋白）、DNA、脂質、離子和礦物鹽。其中，黏蛋白是一種可通過 O-連接方式大量修飾單體或寡聚體糖基的糖蛋白，從而賦予氣道黏液凝膠樣特性。
氣道黏液是氣道第一道防御屏障的重要組成部分[1]，在維持氣道濕化、協助氣道上皮細胞功能等方面起著重要作用[2]。氣道黏液作為物理屏障能將外來顆粒物（如病原體以及微納米顆粒等）通過有規律的纖毛擺動和咳嗽將其排出體外，同時允許特定的氣體、離子、營養物和蛋白質有選擇性地通過[3]，上述氣道黏液的保護和清除功能依賴于黏液合適的流變性能[4]。而哮喘患者氣道過度分泌高黏稠度的黏液，導致其流動性差，難以排出氣道，嚴重情況下在氣道中形成氣道黏液栓塞[3,5]。氣道黏液栓塞是哮喘常見的并發癥之一，可引起肺部不張，導致窒息、呼吸衰竭甚至猝死[6]。目前已有多種黏液溶解劑被用于治療黏液過度分泌的癥狀，例如哮喘、慢性阻塞性肺病等呼吸道疾病[7]。
近年來，納米顆粒被廣泛開發用于呼吸系統的藥物載體，但納米顆粒對呼吸系統健康的影響，尤其是不同納米顆粒與氣道黏液的相互作用及其機理還不清楚[8]。Fe2O3 納米顆粒是一種可經氣道輸送的藥物載體，但其對氣道黏液流變特性的影響未見報道。本研究主要探究 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液流變學特性的影響，分析 Fe2O3 納米顆粒與模擬哮喘氣道黏液之間的相互作用，為開發新型納米藥物載體系統奠定基礎，同時對了解哮喘患者的生理和病理過程具有重要意義。
1 材料和方法
1.1 試劑和儀器
黏蛋白 Mucin（Sigma-Aldrich 公司）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Roche 公司）；大豆卵磷脂、25% 戊二醛（國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、Fe2O3 納米顆粒（常州英中納米科技有限公司）；場發射掃描電鏡（SUPRA55，蔡司，德國）；原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）；納米激光粒度及 zeta 電位分析儀（ZEN3600，馬爾文，英國）；旋轉流變儀（kinexus pro，馬爾文，英國）；倒置光學顯微鏡（Axio Observer Z1，蔡司，德國）；垂直混合儀（HS-3，新芝，中國）；超聲波清洗器（KQ10-300DTD，子華，中國）。
1.2 模擬哮喘氣道黏液的配制
氣道黏液的組成成分是黏蛋白、DNA、脂類、離子、非黏蛋白類蛋白質、細胞、細胞碎片以及水。正常氣道黏液的組成是 93%～97% 的水和 3%～7% 的固體，在固體中，黏蛋白占主要組成部分，其中包括：1%～3% 黏蛋白、1% 蛋白質、1% 脂類和 0.7%～1.4% 礦物質[6]。模擬哮喘患者的氣道黏液含 6% 的黏蛋白、3% 的 BSA 以及 3% 的大豆卵磷脂，并加入 10% 的戊二醛溶液（交聯劑）。實驗前，將樣品保存在 4 ℃ 備用[9]。
1.3 Fe2O3 納米顆粒分散和表征
用純水配制 2 mg/mL 的 Fe2O3 懸浮液，超聲（300 w）處理 20 min 進行納米顆粒分散，將配制好的 Fe2O3 納米顆粒懸浮液置于 4 ℃ 冰箱內儲藏，實驗前再行超聲處理 10 min。
Fe2O3 粉體及其懸浮液的表征采用以下方式進行：① 將少量 Fe2O3 粉末放在樣品臺上濺射涂層后，用場發射掃面電鏡（SUPRA55，蔡司，德國）進行表面形貌觀察；② 采用納米激光粒度及 zeta 電位分析儀（ZEN3600，馬爾文，英國）來測量懸浮液的粒徑分布；③ 吸取 20 μL Fe2O3 懸浮液到云母片上，采用原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）以輕敲模式進行表面形貌表征。
1.4 采用Fe2O3 納米顆粒處理模擬哮喘氣道黏液
將分散后的 Fe2O3 納米顆粒懸浮液按照 0.03 mg/mL、0.3 mg/mL 和 0.4 mg/mL 的濃度加入模擬哮喘黏液中，以 10 mL 的體積分裝于 10 mL 的塑料離心管中，利用垂直混合儀（HS-3，新芝，中國）以 5 r/min（4 ℃）的速度將含有納米顆粒的模擬哮喘氣道黏液體系進行顛倒混合處理 12 h。實驗組為加入 Fe2O3 納米顆粒的模擬黏液，對照組為加入等體積不含 Fe2O3 納米顆粒的 PBS 溶液的模擬哮喘氣道黏液樣品，但均進行顛倒混合處理。
1.5 流變學測量
本研究采用帶有椎板（直徑 20 mm，錐角 4°）的旋轉流變儀（kinexus pro，馬爾文，英國）分析黏液的流變學特性。流變學測量分為穩態流變行為和動態流變行為測量。在穩定狀態下測量黏液的應變-應力關系和屈服應力及其觸變行為。在動態行為中測量黏液的應變掃描、頻率掃描。動態測量過程中，保持較小振幅是為了防止干擾黏液微觀結構的震蕩和固化過程。采用錐板體系檢測是因為它能提供均勻的剪切速率，且測試需要的樣本量較少（2 mL）。在測量之前，樣品在 25 ℃ 下平衡 300 s，所有實驗均在 25 ℃ 下進行。
1.6 黏液微觀結構
利用倒置光學顯微鏡（Axio Observer Z1，蔡司，德國）觀察黏液的微觀結構。先取少量黏液放置在載玻片上，然后用保鮮膜將其覆蓋壓勻，靜置 2 h 后進行結構觀察。拍攝時先在低倍鏡下（×10）找到黏液結構，隨后調高物鏡倍數（×40）再進行拍攝。
2 結果
2.1 Fe2O3 納米顆粒分散和表征結果
采用場發射掃描電鏡（SUPRA55，蔡司，德國）對制備的 Fe2O3 納米顆粒進行觀察，結果顯示，粉體為直徑 200 nm 的棒桿狀結構，如圖 1 所示，少量粉體直徑約 50 nm。納米激光粒度及 zeta 電位分析儀（ZEN3600，馬爾文，英國）檢測出的結果顯示，Fe2O3 顆粒的粒徑為 223.3 nm。
圖1
Fe2O3 粉體和分散顆粒的觀察結果
Figure1.
Observed characteristic results of Fe2O3 powder and dispersed particles
采用原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）測量分散后 Fe2O3 顆粒長度和高度。利用原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）自帶的數據分析軟件測量納米顆粒的尺寸，結果如圖 1 所示，用水分散后 Fe2O3 長度是（112.2±5.0）nm，高度是（7.6±0.8）nm。
2.2 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的流變學特性影響結果
如圖 2 所示是 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的穩態流變學影響曲線（流動曲線、屈服應力曲線、蠕變與回復曲線）。結果顯示將 Fe2O3 納米顆粒加入模擬氣道黏液后，模擬哮喘氣道黏液的各項流變學參數隨之變化。在流動曲線圖中，當剪切速率在 0.01～100 s–1 范圍時，黏液的粘度隨著剪切速率的增加而發生先增加后降低的變化。實驗結果顯示，在低剪切速率（ν<0.01 s–1）情況下，對照組和實驗組剪切粘度增大，為“剪切增稠”流變體。隨著剪切速率增大，對照組與實驗組表觀剪切粘度均降低，變為“剪切變稀”流變體。在低剪切速率（ν<0.1 s–1）時，黏液的粘度表現為零剪切粘度；如圖所示隨著 Fe2O3 納米顆粒的濃度的增加，模擬哮喘氣道黏液的零剪切粘度越來越小。在 0.1～10 s–1 剪切速率條件下，隨著剪切速率的增加，模擬黏液的粘度在急速下降，其主要原因可能是模擬哮喘氣道黏液結構隨著剪切速率的增加而被破壞；并且隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，實驗組的粘度下降速度小于對照組的下降速度；當剪切速率在 10～100 s–1 時，模擬哮喘氣道黏液的結構可能已經在高剪切下被破壞。通過流動曲線可以發現，Fe2O3 納米顆粒可以降低模擬哮喘氣道黏液的粘度，并且可以降低黏液在高剪切時的結纏速度。
圖2
納米顆粒對模擬黏液的穩態流變學掃描圖
Figure2.
Steady-state rheological scanning graph of simulated asthma airway mucus treated with Fe2O3 nanoparticles
屈服應力是指使樣品由固態到液態變化時的剪切應力。如圖 2 所示為加入不同濃度 Fe2O3 納米顆粒的模擬哮喘氣道黏液的屈服應力曲線，可以反映黏液粘度與剪切應力之間的關系。當剪切應力等于 19 Pa 時，模擬哮喘氣道黏液的最大粘度為 48.71 Pa·s；加入 0.03 mg/mL Fe2O3 納米顆粒后的模擬氣道黏液的最大粘度為 49 Pa·s，對應的剪切應力為 17 Pa；加入 0.3 mg/mL Fe2O3 納米顆粒后的模擬哮喘氣道黏液的最大粘度為 0.42 Pa·s，對應的剪切應力為 0.99 Pa；加入 0.4 mg/mL Fe2O3 納米顆粒后的模擬哮喘氣道黏液的最大粘度為 1.05 Pa·s，對應的剪切應力為 0.7 Pa。本實驗結果顯示對照組的屈服應力為 19 Pa，而加入不同濃度 Fe2O3 納米顆粒處理后實驗組（0.03 mg/mL、0.3 mg/mL 和 0.4 mg/mL）的屈服應力分別是 17 Pa、0.99 Pa 和 0.7 Pa。實驗結果顯示，隨著加入 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，模擬哮喘氣道黏液可以在較低的屈服應力下發生流動，實驗結果提示，Fe2O3 納米顆粒會影響模擬哮喘氣道黏液的結構并使之稀化，并且其結構隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加被破壞得更徹底。
如圖 2 所示，對照組和實驗組蠕變與回復曲線顯示經過 300 s 的變形處理后，如果撤銷 1 Pa 的應力，則隨著時間的推移，模擬哮喘氣道黏液都會發現回復現象，而隨著加入 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，其柔量也發生變化。實驗結果提示，在蠕變階段，隨著 Fe2O3 顆粒的濃度增加，實驗組的彈性響應的速度也在增加，粘性響應的速度則減少；在撤銷外力作用后，可以發現對照組能夠快速地恢復其粘彈性，但實驗組的粘彈性恢復速度則有所下降，并且隨著 Fe2O3 顆粒的濃度增加，其恢復速度逐漸降低。研究結果表明，加入不同濃度的納米顆粒后，模擬哮喘氣道黏液的內部結構被破壞，即破壞了黏液結構的再生，使其回復過程減慢，并隨著納米顆粒濃度的增加效應更加明顯。
如圖 3 所示，是 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的動態流變學影響曲線（包括低頻到高頻剪切震蕩掃描曲線、大振幅應變掃描曲線）。從低頻到高頻剪切震蕩掃描曲線可反映粘彈性模量與剪切頻率之間的關系。實驗結果顯示在 0.01～0.1 Hz 時，對照組的復合模量（G*）基本保持不變；在頻率為 0.1～10 Hz 時，對照組的復合模量（G*）緩慢地增加，且增加幅度不明顯；當頻率大于 10 Hz 時，對照組的復合模量（G*）急劇增加；實驗還顯示，隨著 Fe2O3 濃度的增加，在 0.01～10 Hz 時，實驗組的復合模量（G*）隨著 Fe2O3 濃度的增加而減小，表明實驗組的復合模量（G*）波動比較明顯，并且隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，模擬哮喘氣道黏液的結構被破壞得更徹底。
圖3
納米顆粒對模擬黏液的動態流變學掃描圖
Figure3.
Dynamic rheological scanning graph of simulated asthma airway mucus treated with Fe2O3 nanoparticles
大振幅應變掃描實驗結果如圖 3 所示，該結果反映出粘彈性模量與應變之間的關系。實驗結果顯示應變為 1%～10% 時，對照組組內的模擬黏液的復合模量（G*）基本保持不變；當應變小于 10% 時，實驗結果顯示出，隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，實驗組模擬黏液的復合模量（G*）隨著 Fe2O3 濃度的增加而減小；隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，實驗組線性黏彈性區域越來越小，說明加入 Fe2O3 納米顆粒后，模擬氣道黏液結構部被破壞；當應變大于 10% 后，對照組的復合模量（G*）開始下降，而加入 Fe2O3 顆粒后，實驗組復合模量（G*）則基本保持不變，提示模擬黏液的結構已被 Fe2O3 納米顆粒破壞。
2.3 加入 Fe2O3 納米顆粒后模擬黏液的微觀結構
利用倒置光學顯微鏡（Axio Observer Z1，蔡司，德國）觀察模擬哮喘氣道黏液的微觀結構發現，對照組模擬哮喘氣道黏液的微觀結構中有絲狀物質，并且形成了一定的網狀結構，如圖 4 所示。加入不同濃度的 Fe2O3 納米顆粒后，其結構發生明顯變化，表現為網狀結構的破壞，同時出現一定的團聚現象，并且隨著濃度的增加，其團聚的現象更加明顯。
圖4
Fe2O3 納米顆粒對模擬黏液微觀結構
Figure4.
Microstructure of simulated asthma airway mucus treated with Fe2O3 nanoparticles
3 分析與討論
氣道黏液是一種含有大量水凝膠樣糖蛋白的復雜流體[10]，在人體氣道潤滑以及防護功能方面發揮重要作用[10-11]。當氣道黏液的粘度過低，有可能在重力的作用下滑向肺泡；當黏液的粘度過大，會導致纖毛不能將黏液排出。在生理條件下，纖毛清除系統和打噴嚏對肺部黏液產生不同的剪切/應變率（咳嗽時可產生約 1 000 s–1 的高剪切速率），因此研究黏液流變學特性對理解其生理、病理作用以及開發新型藥物載體均具有重要意義[12-13]。目前，對正常人體氣道黏液的基本流變學特性研究表明，氣道黏液在宏觀水平表現為非牛頓流體，不同于固體或者液體；在微觀水平上又表現為液體樣流變特性[4]。我們采用大振幅振蕩剪切實驗檢測模擬哮喘氣道黏液的剛度隨應變的變化，結果顯示模擬哮喘氣道黏液表現出非線性粘彈性的復雜流體，低應變增加其剛度，高應變降低其剛度，這些實驗結果和Vasquez等[14]的實驗結果一致。當剪切速率在 10～100 s–1 時，模擬黏液表現出明顯的剪切變稀行為，這對咳嗽或者打噴嚏時促進氣道黏液外排具有重要意義。
納米顆粒被廣泛用于藥物載體的開發，而呼吸系統的特點適合納米顆粒的霧化吸入治療，因此為納米顆粒藥物載體的應用提供了方便，但納米顆粒尤其是 Fe2O3 納米顆粒與氣道黏液的相互作用尚有待開展深入研究[15-16]。但也有實驗表明帶正電荷的納米顆粒可以和黏液蛋白相互作用，形成納米顆粒-黏液蛋白復合體，從而增加了黏液的粘度，影響了黏液蛋白的水合作用和分散，導致黏液蛋白的聚集[17]。本實驗檢測了 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的粘度隨剪切速率的變化影響，實驗結果顯示 Fe2O3 納米顆粒沒有改變氣道黏液對剪切速率響應的基本趨勢，但降低了模擬哮喘氣道黏液的粘度。黏液的屈服應力可以反映粘度隨剪切應力變化的關系。實驗結果顯示 Fe2O3 納米顆粒降低了模擬哮喘氣道黏液的屈服應力，提示加入 Fe2O3 后，會使黏液稀化，使黏液更容易發生流動。大振幅掃描和震蕩掃描均可以反映粘彈性模量與應變以及剪切頻率之間的關系，實驗結果顯示 Fe2O3 納米顆粒降低了黏液的穩定性，提示其可能破壞了黏液的內部結構。
氣道黏液的微觀結構依賴于二硫鍵、靜電和疏水相互作用，其中的黏液蛋白（占比 80%）可以隨著環境條件的變化從而改變自組裝的程度，是影響黏液結構和流變學特性的主要因素。黏蛋白主要是交聯、捆綁和纏結著的黏蛋白纖維[8]。利用倒置光學顯微鏡觀察發現模擬黏液的微觀結構中有絲狀物質出現，并且形成了一定的網狀結構。納米顆粒與蛋白質相互作用會導致蛋白質分子的結構重組，破壞蛋白質原有的構象，從而影響蛋白質的功能。本實驗顯示加入不同濃度的 Fe2O3 后，黏液結構發生很大的變化，表現為網狀結構破壞，出現了一定的團聚現象，并且隨著濃度的增加團聚現象更加明顯，造成這個現象的原因可能是納米顆粒吸附到黏蛋白上產生一定的團聚，使得蛋白的網狀結構被破壞[18]。由于黏蛋白是影響流變學的主要因素，因此也與之前的流變實驗相吻合，Fe2O3 的加入破壞了黏液中黏蛋白的結構，導致其流變學參數均發生變化。結合微觀結構現象可以發現，Fe2O3 納米顆粒可以破壞黏液結構從而達到使黏液變稀的效果，如圖 5 所示。
圖5
Fe2O3 納米顆粒影響氣道黏液的示意圖
Figure5.
Schematic diagram of the effects of Fe2O3 nanoparticles on simulated airway mucus
通過以上研究結果，本研究表明 Fe2O3 納米顆粒可降低黏液粘度和粘彈性模量，使之稀化，并增加其對應力的響應。這些結果為深入理解納米 Fe2O3 對黏液流變學特性的影響及其臨床意義提供了科學依據，并可為探索相應的氣道黏液阻塞治療方法提供新思路。
引言
氣道黏液是一種異質性的凝膠樣材料，主要成分為黏蛋白和水，同時含有少量的細胞蛋白質（白蛋白、酶和免疫球蛋白）、DNA、脂質、離子和礦物鹽。其中，黏蛋白是一種可通過 O-連接方式大量修飾單體或寡聚體糖基的糖蛋白，從而賦予氣道黏液凝膠樣特性。
氣道黏液是氣道第一道防御屏障的重要組成部分[1]，在維持氣道濕化、協助氣道上皮細胞功能等方面起著重要作用[2]。氣道黏液作為物理屏障能將外來顆粒物（如病原體以及微納米顆粒等）通過有規律的纖毛擺動和咳嗽將其排出體外，同時允許特定的氣體、離子、營養物和蛋白質有選擇性地通過[3]，上述氣道黏液的保護和清除功能依賴于黏液合適的流變性能[4]。而哮喘患者氣道過度分泌高黏稠度的黏液，導致其流動性差，難以排出氣道，嚴重情況下在氣道中形成氣道黏液栓塞[3,5]。氣道黏液栓塞是哮喘常見的并發癥之一，可引起肺部不張，導致窒息、呼吸衰竭甚至猝死[6]。目前已有多種黏液溶解劑被用于治療黏液過度分泌的癥狀，例如哮喘、慢性阻塞性肺病等呼吸道疾病[7]。
近年來，納米顆粒被廣泛開發用于呼吸系統的藥物載體，但納米顆粒對呼吸系統健康的影響，尤其是不同納米顆粒與氣道黏液的相互作用及其機理還不清楚[8]。Fe2O3 納米顆粒是一種可經氣道輸送的藥物載體，但其對氣道黏液流變特性的影響未見報道。本研究主要探究 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液流變學特性的影響，分析 Fe2O3 納米顆粒與模擬哮喘氣道黏液之間的相互作用，為開發新型納米藥物載體系統奠定基礎，同時對了解哮喘患者的生理和病理過程具有重要意義。
1 材料和方法
1.1 試劑和儀器
黏蛋白 Mucin（Sigma-Aldrich 公司）；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Roche 公司）；大豆卵磷脂、25% 戊二醛（國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、Fe2O3 納米顆粒（常州英中納米科技有限公司）；場發射掃描電鏡（SUPRA55，蔡司，德國）；原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）；納米激光粒度及 zeta 電位分析儀（ZEN3600，馬爾文，英國）；旋轉流變儀（kinexus pro，馬爾文，英國）；倒置光學顯微鏡（Axio Observer Z1，蔡司，德國）；垂直混合儀（HS-3，新芝，中國）；超聲波清洗器（KQ10-300DTD，子華，中國）。
1.2 模擬哮喘氣道黏液的配制
氣道黏液的組成成分是黏蛋白、DNA、脂類、離子、非黏蛋白類蛋白質、細胞、細胞碎片以及水。正常氣道黏液的組成是 93%～97% 的水和 3%～7% 的固體，在固體中，黏蛋白占主要組成部分，其中包括：1%～3% 黏蛋白、1% 蛋白質、1% 脂類和 0.7%～1.4% 礦物質[6]。模擬哮喘患者的氣道黏液含 6% 的黏蛋白、3% 的 BSA 以及 3% 的大豆卵磷脂，并加入 10% 的戊二醛溶液（交聯劑）。實驗前，將樣品保存在 4 ℃ 備用[9]。
1.3 Fe2O3 納米顆粒分散和表征
用純水配制 2 mg/mL 的 Fe2O3 懸浮液，超聲（300 w）處理 20 min 進行納米顆粒分散，將配制好的 Fe2O3 納米顆粒懸浮液置于 4 ℃ 冰箱內儲藏，實驗前再行超聲處理 10 min。
Fe2O3 粉體及其懸浮液的表征采用以下方式進行：① 將少量 Fe2O3 粉末放在樣品臺上濺射涂層后，用場發射掃面電鏡（SUPRA55，蔡司，德國）進行表面形貌觀察；② 采用納米激光粒度及 zeta 電位分析儀（ZEN3600，馬爾文，英國）來測量懸浮液的粒徑分布；③ 吸取 20 μL Fe2O3 懸浮液到云母片上，采用原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）以輕敲模式進行表面形貌表征。
1.4 采用Fe2O3 納米顆粒處理模擬哮喘氣道黏液
將分散后的 Fe2O3 納米顆粒懸浮液按照 0.03 mg/mL、0.3 mg/mL 和 0.4 mg/mL 的濃度加入模擬哮喘黏液中，以 10 mL 的體積分裝于 10 mL 的塑料離心管中，利用垂直混合儀（HS-3，新芝，中國）以 5 r/min（4 ℃）的速度將含有納米顆粒的模擬哮喘氣道黏液體系進行顛倒混合處理 12 h。實驗組為加入 Fe2O3 納米顆粒的模擬黏液，對照組為加入等體積不含 Fe2O3 納米顆粒的 PBS 溶液的模擬哮喘氣道黏液樣品，但均進行顛倒混合處理。
1.5 流變學測量
本研究采用帶有椎板（直徑 20 mm，錐角 4°）的旋轉流變儀（kinexus pro，馬爾文，英國）分析黏液的流變學特性。流變學測量分為穩態流變行為和動態流變行為測量。在穩定狀態下測量黏液的應變-應力關系和屈服應力及其觸變行為。在動態行為中測量黏液的應變掃描、頻率掃描。動態測量過程中，保持較小振幅是為了防止干擾黏液微觀結構的震蕩和固化過程。采用錐板體系檢測是因為它能提供均勻的剪切速率，且測試需要的樣本量較少（2 mL）。在測量之前，樣品在 25 ℃ 下平衡 300 s，所有實驗均在 25 ℃ 下進行。
1.6 黏液微觀結構
利用倒置光學顯微鏡（Axio Observer Z1，蔡司，德國）觀察黏液的微觀結構。先取少量黏液放置在載玻片上，然后用保鮮膜將其覆蓋壓勻，靜置 2 h 后進行結構觀察。拍攝時先在低倍鏡下（×10）找到黏液結構，隨后調高物鏡倍數（×40）再進行拍攝。
2 結果
2.1 Fe2O3 納米顆粒分散和表征結果
采用場發射掃描電鏡（SUPRA55，蔡司，德國）對制備的 Fe2O3 納米顆粒進行觀察，結果顯示，粉體為直徑 200 nm 的棒桿狀結構，如圖 1 所示，少量粉體直徑約 50 nm。納米激光粒度及 zeta 電位分析儀（ZEN3600，馬爾文，英國）檢測出的結果顯示，Fe2O3 顆粒的粒徑為 223.3 nm。
圖1
Fe2O3 粉體和分散顆粒的觀察結果
Figure1.
Observed characteristic results of Fe2O3 powder and dispersed particles
采用原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）測量分散后 Fe2O3 顆粒長度和高度。利用原子力顯微鏡（NanoWizard 3，JPK，德國）自帶的數據分析軟件測量納米顆粒的尺寸，結果如圖 1 所示，用水分散后 Fe2O3 長度是（112.2±5.0）nm，高度是（7.6±0.8）nm。
2.2 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的流變學特性影響結果
如圖 2 所示是 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的穩態流變學影響曲線（流動曲線、屈服應力曲線、蠕變與回復曲線）。結果顯示將 Fe2O3 納米顆粒加入模擬氣道黏液后，模擬哮喘氣道黏液的各項流變學參數隨之變化。在流動曲線圖中，當剪切速率在 0.01～100 s–1 范圍時，黏液的粘度隨著剪切速率的增加而發生先增加后降低的變化。實驗結果顯示，在低剪切速率（ν<0.01 s–1）情況下，對照組和實驗組剪切粘度增大，為“剪切增稠”流變體。隨著剪切速率增大，對照組與實驗組表觀剪切粘度均降低，變為“剪切變稀”流變體。在低剪切速率（ν<0.1 s–1）時，黏液的粘度表現為零剪切粘度；如圖所示隨著 Fe2O3 納米顆粒的濃度的增加，模擬哮喘氣道黏液的零剪切粘度越來越小。在 0.1～10 s–1 剪切速率條件下，隨著剪切速率的增加，模擬黏液的粘度在急速下降，其主要原因可能是模擬哮喘氣道黏液結構隨著剪切速率的增加而被破壞；并且隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，實驗組的粘度下降速度小于對照組的下降速度；當剪切速率在 10～100 s–1 時，模擬哮喘氣道黏液的結構可能已經在高剪切下被破壞。通過流動曲線可以發現，Fe2O3 納米顆粒可以降低模擬哮喘氣道黏液的粘度，并且可以降低黏液在高剪切時的結纏速度。
圖2
納米顆粒對模擬黏液的穩態流變學掃描圖
Figure2.
Steady-state rheological scanning graph of simulated asthma airway mucus treated with Fe2O3 nanoparticles
屈服應力是指使樣品由固態到液態變化時的剪切應力。如圖 2 所示為加入不同濃度 Fe2O3 納米顆粒的模擬哮喘氣道黏液的屈服應力曲線，可以反映黏液粘度與剪切應力之間的關系。當剪切應力等于 19 Pa 時，模擬哮喘氣道黏液的最大粘度為 48.71 Pa·s；加入 0.03 mg/mL Fe2O3 納米顆粒后的模擬氣道黏液的最大粘度為 49 Pa·s，對應的剪切應力為 17 Pa；加入 0.3 mg/mL Fe2O3 納米顆粒后的模擬哮喘氣道黏液的最大粘度為 0.42 Pa·s，對應的剪切應力為 0.99 Pa；加入 0.4 mg/mL Fe2O3 納米顆粒后的模擬哮喘氣道黏液的最大粘度為 1.05 Pa·s，對應的剪切應力為 0.7 Pa。本實驗結果顯示對照組的屈服應力為 19 Pa，而加入不同濃度 Fe2O3 納米顆粒處理后實驗組（0.03 mg/mL、0.3 mg/mL 和 0.4 mg/mL）的屈服應力分別是 17 Pa、0.99 Pa 和 0.7 Pa。實驗結果顯示，隨著加入 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，模擬哮喘氣道黏液可以在較低的屈服應力下發生流動，實驗結果提示，Fe2O3 納米顆粒會影響模擬哮喘氣道黏液的結構并使之稀化，并且其結構隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加被破壞得更徹底。
如圖 2 所示，對照組和實驗組蠕變與回復曲線顯示經過 300 s 的變形處理后，如果撤銷 1 Pa 的應力，則隨著時間的推移，模擬哮喘氣道黏液都會發現回復現象，而隨著加入 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，其柔量也發生變化。實驗結果提示，在蠕變階段，隨著 Fe2O3 顆粒的濃度增加，實驗組的彈性響應的速度也在增加，粘性響應的速度則減少；在撤銷外力作用后，可以發現對照組能夠快速地恢復其粘彈性，但實驗組的粘彈性恢復速度則有所下降，并且隨著 Fe2O3 顆粒的濃度增加，其恢復速度逐漸降低。研究結果表明，加入不同濃度的納米顆粒后，模擬哮喘氣道黏液的內部結構被破壞，即破壞了黏液結構的再生，使其回復過程減慢，并隨著納米顆粒濃度的增加效應更加明顯。
如圖 3 所示，是 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的動態流變學影響曲線（包括低頻到高頻剪切震蕩掃描曲線、大振幅應變掃描曲線）。從低頻到高頻剪切震蕩掃描曲線可反映粘彈性模量與剪切頻率之間的關系。實驗結果顯示在 0.01～0.1 Hz 時，對照組的復合模量（G*）基本保持不變；在頻率為 0.1～10 Hz 時，對照組的復合模量（G*）緩慢地增加，且增加幅度不明顯；當頻率大于 10 Hz 時，對照組的復合模量（G*）急劇增加；實驗還顯示，隨著 Fe2O3 濃度的增加，在 0.01～10 Hz 時，實驗組的復合模量（G*）隨著 Fe2O3 濃度的增加而減小，表明實驗組的復合模量（G*）波動比較明顯，并且隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，模擬哮喘氣道黏液的結構被破壞得更徹底。
圖3
納米顆粒對模擬黏液的動態流變學掃描圖
Figure3.
Dynamic rheological scanning graph of simulated asthma airway mucus treated with Fe2O3 nanoparticles
大振幅應變掃描實驗結果如圖 3 所示，該結果反映出粘彈性模量與應變之間的關系。實驗結果顯示應變為 1%～10% 時，對照組組內的模擬黏液的復合模量（G*）基本保持不變；當應變小于 10% 時，實驗結果顯示出，隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，實驗組模擬黏液的復合模量（G*）隨著 Fe2O3 濃度的增加而減小；隨著 Fe2O3 納米顆粒濃度的增加，實驗組線性黏彈性區域越來越小，說明加入 Fe2O3 納米顆粒后，模擬氣道黏液結構部被破壞；當應變大于 10% 后，對照組的復合模量（G*）開始下降，而加入 Fe2O3 顆粒后，實驗組復合模量（G*）則基本保持不變，提示模擬黏液的結構已被 Fe2O3 納米顆粒破壞。
2.3 加入 Fe2O3 納米顆粒后模擬黏液的微觀結構
利用倒置光學顯微鏡（Axio Observer Z1，蔡司，德國）觀察模擬哮喘氣道黏液的微觀結構發現，對照組模擬哮喘氣道黏液的微觀結構中有絲狀物質，并且形成了一定的網狀結構，如圖 4 所示。加入不同濃度的 Fe2O3 納米顆粒后，其結構發生明顯變化，表現為網狀結構的破壞，同時出現一定的團聚現象，并且隨著濃度的增加，其團聚的現象更加明顯。
圖4
Fe2O3 納米顆粒對模擬黏液微觀結構
Figure4.
Microstructure of simulated asthma airway mucus treated with Fe2O3 nanoparticles
3 分析與討論
氣道黏液是一種含有大量水凝膠樣糖蛋白的復雜流體[10]，在人體氣道潤滑以及防護功能方面發揮重要作用[10-11]。當氣道黏液的粘度過低，有可能在重力的作用下滑向肺泡；當黏液的粘度過大，會導致纖毛不能將黏液排出。在生理條件下，纖毛清除系統和打噴嚏對肺部黏液產生不同的剪切/應變率（咳嗽時可產生約 1 000 s–1 的高剪切速率），因此研究黏液流變學特性對理解其生理、病理作用以及開發新型藥物載體均具有重要意義[12-13]。目前，對正常人體氣道黏液的基本流變學特性研究表明，氣道黏液在宏觀水平表現為非牛頓流體，不同于固體或者液體；在微觀水平上又表現為液體樣流變特性[4]。我們采用大振幅振蕩剪切實驗檢測模擬哮喘氣道黏液的剛度隨應變的變化，結果顯示模擬哮喘氣道黏液表現出非線性粘彈性的復雜流體，低應變增加其剛度，高應變降低其剛度，這些實驗結果和Vasquez等[14]的實驗結果一致。當剪切速率在 10～100 s–1 時，模擬黏液表現出明顯的剪切變稀行為，這對咳嗽或者打噴嚏時促進氣道黏液外排具有重要意義。
納米顆粒被廣泛用于藥物載體的開發，而呼吸系統的特點適合納米顆粒的霧化吸入治療，因此為納米顆粒藥物載體的應用提供了方便，但納米顆粒尤其是 Fe2O3 納米顆粒與氣道黏液的相互作用尚有待開展深入研究[15-16]。但也有實驗表明帶正電荷的納米顆粒可以和黏液蛋白相互作用，形成納米顆粒-黏液蛋白復合體，從而增加了黏液的粘度，影響了黏液蛋白的水合作用和分散，導致黏液蛋白的聚集[17]。本實驗檢測了 Fe2O3 納米顆粒對模擬哮喘氣道黏液的粘度隨剪切速率的變化影響，實驗結果顯示 Fe2O3 納米顆粒沒有改變氣道黏液對剪切速率響應的基本趨勢，但降低了模擬哮喘氣道黏液的粘度。黏液的屈服應力可以反映粘度隨剪切應力變化的關系。實驗結果顯示 Fe2O3 納米顆粒降低了模擬哮喘氣道黏液的屈服應力，提示加入 Fe2O3 后，會使黏液稀化，使黏液更容易發生流動。大振幅掃描和震蕩掃描均可以反映粘彈性模量與應變以及剪切頻率之間的關系，實驗結果顯示 Fe2O3 納米顆粒降低了黏液的穩定性，提示其可能破壞了黏液的內部結構。
氣道黏液的微觀結構依賴于二硫鍵、靜電和疏水相互作用，其中的黏液蛋白（占比 80%）可以隨著環境條件的變化從而改變自組裝的程度，是影響黏液結構和流變學特性的主要因素。黏蛋白主要是交聯、捆綁和纏結著的黏蛋白纖維[8]。利用倒置光學顯微鏡觀察發現模擬黏液的微觀結構中有絲狀物質出現，并且形成了一定的網狀結構。納米顆粒與蛋白質相互作用會導致蛋白質分子的結構重組，破壞蛋白質原有的構象，從而影響蛋白質的功能。本實驗顯示加入不同濃度的 Fe2O3 后，黏液結構發生很大的變化，表現為網狀結構破壞，出現了一定的團聚現象，并且隨著濃度的增加團聚現象更加明顯，造成這個現象的原因可能是納米顆粒吸附到黏蛋白上產生一定的團聚，使得蛋白的網狀結構被破壞[18]。由于黏蛋白是影響流變學的主要因素，因此也與之前的流變實驗相吻合，Fe2O3 的加入破壞了黏液中黏蛋白的結構，導致其流變學參數均發生變化。結合微觀結構現象可以發現，Fe2O3 納米顆粒可以破壞黏液結構從而達到使黏液變稀的效果，如圖 5 所示。
圖5
Fe2O3 納米顆粒影響氣道黏液的示意圖
Figure5.
Schematic diagram of the effects of Fe2O3 nanoparticles on simulated airway mucus
通過以上研究結果，本研究表明 Fe2O3 納米顆粒可降低黏液粘度和粘彈性模量，使之稀化，并增加其對應力的響應。這些結果為深入理解納米 Fe2O3 對黏液流變學特性的影響及其臨床意義提供了科學依據，并可為探索相應的氣道黏液阻塞治療方法提供新思路。
