血小板是無核的血液效應細胞，在凝血、止血和血栓形成等方面發揮了重要的作用，但血小板極易受外源性刺激而活化，進而損害血小板天然的生物活性，影響其生物學功能，因此血小板生物活性成為血管類疾病領域研究的熱點之一。本文研究了超聲參數（超聲聲強和作用時間）對血小板生物活性的影響，探究了超聲能量對血小板的形貌、聚集能力、微粒釋放［P 選擇素（CD62P）的表達量和微粒個數］等方面的作用。結果表明，在超聲頻率為 1 MHz、作用 60 s 時間條件下，當聲強為 0.25 W/cm2時，血小板的形貌、聚集能力以及微粒釋放均未被影響；當超聲聲強大于 0.25 W/cm2時，除血小板的聚集能力被影響外，血小板偽足的產生、形態的改變以及微粒釋放的增加等效應亦被發現，且這些效應隨著超聲聲強的進一步增加而加劇。在超聲頻率為 1 MHz、聲強為 0.25 W/cm2條件下，60 s 的超聲時間對血小板的生物活性不會產生影響；但當超聲時間大于 60 s 時，血小板的形貌、聚集能力及微粒的釋放會被影響，血小板的 α 顆粒分泌 CD62P 和總蛋白成分不會被影響。因此，超聲參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 時，超聲能量對血小板的生物活性沒有影響。該研究結果對超聲能量參與介導血小板相關疾病的治療具有重要的意義。
引用本文： 劉桃桃, 楊芳. 超聲影響血小板生物活性的研究. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(4): 709-715. doi: 10.7507/1001-5515.202005036 復制
引言
目前，血管類疾病仍然是威脅全世界人類健康的主要疾病之一。心腦血管疾病，如心梗、腦卒中等屬于臨床常見病與多發病，對患者的生活質量、健康等均造成了不良危害，已成為人類死亡的主要病因之一[1-2]。該類疾病主要表現為血液高凝狀態，即血液粘稠度高、流動速度慢，極易形成血栓而阻塞血管通路，導致局部血壓升高，進而影響血管的內膜結構，導致血管破裂、出血，并產生相應心腦血管的癥狀[3]。
在心腦血管疾病中，血小板是參與發病機制的重要因素[4]。血小板來源于骨髓成熟的巨核細胞，作為血液的主要成分之一，不僅在維持血管血液正常循環方面發揮作用[5-6]，而且在凝血、傷口愈合、炎癥反應等生理和病理過程中具有極其重要的作用[7-8]。2017 年，Tomaiuolo 等[9]提出血小板在止血過程中，可能會引發血栓的形成。2019 年，van der Meijden 等[10]對血小板在止血及血栓形成等過程中發揮作用的機制進行了深入探討。因此，血小板既是創傷后出血的保護機制，又是誘發心腦血管疾病的主要原因[11]。血小板這些功能的實現與其活化的狀態緊密相關，局部血小板的活化以及血小板的過度反應是心血管疾病發生的重要原因[12]，血小板活性或聚集性亦與心血管危害事件的預后密切關聯。因此，探究包括物理因素、化學因素和生物因素等對血小板生物活性的影響對心血管疾病有重要的臨床預測及監測價值[13]。
超聲波既可以用于人體疾病的診斷，又可以作為一種物理性能量形式用于疾病的治療。例如，超聲引導下經皮血管成形術治療血透患者動靜脈內瘺狹窄，既可以實時引導又能減少醫患放射線暴露[14-15]；血管內超聲是臨床上冠心病介入治療的重要輔助檢測方式，并且能夠反映血管內腔的變化以及管腔橫斷面結構、血管壁厚度、形態、斑塊成分等[16-17]；術中超聲可快速實時定位病變，判斷病變邊界，避免不必要的出血及損傷[18-20]；超聲引導關節腔注射富血小板血漿可有效改善輕、中度膝骨關節炎患者的疼痛，提高了患者的生存質量[21]。此外，超聲能量還能夠通過聲動力療法治療動脈粥樣硬化等血管疾病[22-23]，在不損傷細胞本身生物活性的情況下，通過瞬時增強細胞膜的通透性，使外來小分子物質進入細胞，進而標記細胞，進行細胞成像的應用研究[24]。
鑒于超聲在血管等疾病的臨床實踐和醫學研究中應用的普遍性，研究超聲對血小板生物活性的影響具有十分重要的意義。2012 年，Stief 等[25]研究了不同超聲頻率對人血液凝固程度的影響；2018 年，Jin 等[26]報道了超聲干預血小板原位合成金納米顆粒；2019 年，Liu 等[27]探究了超聲作用對裝載金納米顆粒的血小板生物活性的影響。雖然這些研究在一定程度上探究了超聲能量對血小板的影響，但是所研究的血小板生物學功能不夠全面，血小板生物活性的檢測指標單一，超聲能量的設計亦不夠系統，故需進一步系統研究超聲能量參數對血小板生物活性的影響。
本論文針對血小板生物活性的變化，通過不同超聲聲強、作用時間對血小板進行干預，探究了超聲作用對血小板的形貌、聚集能力、數量及蛋白成分等方面的影響，并通過異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）熒光標記的鼠抗人 CD62P 抗體靶向活化血小板表面的 CD62P 分子，進一步探究了血小板的生物活性變化。
1 材料和方法
1.1 材料
實驗所用的新鮮濃縮血小板（1.0 × 109～1.3 ×109個血小板/mL），由江蘇省血液中心提供。FITC Mouse anti-Human CD62P（FITC 鼠抗人 CD62P 抗體）購自美國 BD 公司。人凝血酶購自美國 Sigma 公司。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、RIPA 裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）和考馬斯亮藍染色液均購自碧云天生物科技有限公司（海門，中國）。
1.2 方法
1.2.1 血小板的處理
首先，將儲存在酸性枸櫞酸鹽葡萄糖（acid citrate dextrose，ACD）中的血小板 600 g 離心 5 min 使血小板沉淀，棄去上清，收集血小板；然后，用 0.9% NaCl 等體積重懸血小板，再吸取樣品 10 μL 置 100 mL 電解液（0.9% NaCl 作為電解液）中，用粒徑分析儀（Multisizer4e，美國）20 μm 規格的小孔管（所測粒徑范圍為 0.4～12 μm；小孔管清洗需先用無水乙醇浸泡，再用純水清洗）從電解液中吸取 50 μL 樣品，進行測量并分析記錄粒徑范圍在 1～8 μm（血小板的直徑范圍）的血小板濃度（儀器可自動計算得出），最后用 0.9% NaCl 將血小板稀釋至濃度約為 7.08×108個血小板/mL。
1.2.2 超聲能量參數的調控
取處理后的血小板懸浮液 1 mL 置于 24 孔板（每孔 1 mL）中，然后進行如下超聲能量的處理：① 對不同孔中的相同試樣施以超聲脈沖重復頻率為 100 Hz，占空比為 20%，聲強分別為 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2的脈沖超聲波（1 MHz，60 s，DM-200B，深圳市德邁科技有限公司，中國），超聲處理后的血小板樣品分別記作 PLTs-US1、PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5；② 對不同孔中的相同試樣分別施以超聲時間為 60、90、120、150 s 的脈沖超聲波（1 MHz，0.25 W/cm2）。超聲處理后的血小板樣品分別記作 PLTs-US1-60s 或 PLTs-US1、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s。
1.2.3 血小板數量測定
由于血小板活化后釋放的微粒（粒徑范圍在 30 nm～1 μm）小于靜息血小板平均尺寸（2.0～5.0 μm），所以用粒徑分析儀（貝克曼 Multisizer4e，美國）20 μm 規格的小孔管測定超聲作用前后靜息血小板的數量，以此來分析判斷超聲對血小板活性的影響，具體方法如下：① 將初始濃度相同的血小板（約為 7.08×108個血小板/mL）分別施加不同的超聲條件（如 1.2.2 小節所述），并以沒有施加超聲刺激的血小板懸浮液作為空白對照組（PLTs）；② 分別吸取 10 μL 上述施加和未施加超聲波的血小板懸浮液，用粒徑分析儀對平均尺寸為 2.0～5.0 μm 的靜息血小板個數及其與樣品中總微粒個數的比值進行測定并分析。
1.2.4 血小板的形態學觀察
由于血小板在活化的過程中還會形成許多肌動蛋白聚合驅動的膜突起，突起改變了血小板的形態特征，因此用場發射掃描電子顯微鏡（SEM，Ultra Plus，德國）在加速電壓 1.00 kV 下觀察施加超聲波前后血小板的形態，樣品處理具體方法如下：① 將施加和未施加超聲波的血小板懸浮液 600 g 離心 5 min 后，棄上清，等體積加入 2.5% 的戊二醛溶液；② 將樣品放入恒溫混勻儀中，于 250 r/min、22 ℃ 條件下固定 30 min；③ 將固定完畢后的樣品 600 g 離心 5 min，加純水重復洗滌 3 次；④ 稀釋樣品使其濃度是原來的 20%，取其中 5 μL 滴硅片至自然干燥，然后，用 SEM 研究血小板的形貌。
為保證 SEM 表征結果的準確性和有效性，在滴加樣品之前，需先對硅片進行如下處理：① 用硅片刀將大塊的硅片切割成 0.5 cm×0.5 cm 大小；② 按濃硫酸和過氧化氫水溶液體積比為 3∶1 配制皮爾哈洗液，將其倒入盛有硅片的燒杯中，加熱煮沸，在此過程中，為徹底清洗硅片以及防止局部溫度過高而導致液體濺出，在煮沸的整個過程中（約 2 h）需每隔 0.5 h 攪拌一次，每次攪拌 5 min 左右（此加熱煮沸過程需在通風櫥中進行）；③ 將燒杯中的皮爾哈洗液回收到實驗室指定的廢液桶后，先用自來水沖洗燒杯中的硅片 5 遍，再用超純水沖洗 5 遍；④ 向燒杯中重新倒入超純水使其硅片浸泡其中，并將燒杯放入超聲波清洗儀中超聲清洗 15 min 后，如此重復 3 次；⑤ 再次除去水，然后用無水乙醇進行超聲重復清洗 3 次，最后將硅片置于裝有無水乙醇的廣口瓶中，密封保存；⑥ 使用前，取出硅片用氮氣將其吹干。
1.2.5 血小板聚集能力的測定
使用酶標儀分光光度法評估血小板的聚集，每個樣品重復測定 3 次（n = 3）。首先，將濃度為 1 IU/mL 的 500 μL 人凝血酶分別加入 1.2.2 小節中超聲處理后的血小板中；然后，在多功能酶標儀讀數器（Tecan Infinite 200PRO，中國）上，每隔 120 s 記錄一次 650 nm 波長處的血小板吸光度值，同時，基于濁度的降低觀察血小板的聚集情況。
1.2.6 血小板蛋白含量的測定
首先，將 1.2.2 小節中超聲處理后的血小板 600 g 離心 5 min，去除上清；然后，向樣品中分別加入 1 mL RIPA 裂解液，用移液器吹打數下至細胞完全裂解。然后通過如下兩種方法對裂解的蛋白質進行測定：① 各取 2 μL 裂解后的樣品，使用超微量核酸蛋白檢測儀（Nano-300，中國）的紫外測量功能對樣品進行全譜（200～800 nm）測定，分析各個樣品紫外吸收峰的特征；② 將裂解后的樣品與完全溶解的 5×上樣緩沖液（含有少量 DTT）按照 4∶1 的比例混勻后，沸水浴加熱 5 min，以充分變性樣品中的蛋白，經離心去除雜質后，各取 20 μL 用 SDS-PAGE（DYY-12，中國）檢測血小板蛋白條帶。
1.2.7 流式細胞儀測定
由于血小板活化后，其內的 α 顆粒與質膜或開放管道系統融合，使 CD62P 在細胞膜上的表達顯著增加，所以 CD62P 被認為是反映血小板活化的“金標準”，是血小板活化程度及血栓形成的特異性標志物。鑒于此，本文通過流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國）分析血小板膜表面 CD62P 的變化來判斷超聲作用對血小板活化程度的影響，具體方法如下：以相同濃度的無超聲作用和熒光抗體連接的血小板溶液作為空白對照，將施加和未施加超聲的樣品各取 1 mL 分別與 20 μL FITC 鼠抗人 CD62P 抗體于 22 ℃、250 r/min、避光條件下在恒溫混勻儀中共孵育 30 min，然后離心（600 g）洗滌 5 min，重復上述離心洗滌操作 2 次，以去除游離的 FITC 鼠抗人 CD62P 抗體，將各個待測樣品用 0.9% NaCl 稀釋至約 1×106個細胞/mL 后，使用流式細胞儀測試熒光強度（每個樣品所測細胞至少 10 000 個），所得實驗數據用 FlowJo 7.6 分析。
1.2.8 統計學分析
所有結果均由三次獨立實驗（n = 3）表示。此外，使用 Microsoft Excel 分析數值數據，并使用單向方差分析測試確定統計學意義。檢驗水準為 0.05。
2 結果與討論
2.1 血小板形貌觀察結果
圖1 是超聲作用前后血小板的場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖像，天然血小板（PLTs）的 SEM 圖像顯示：大多數的血小板呈圓球形，單個分布，無偽足；超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間為 60 s 時（PLTs-US1），血小板的 SEM 圖像與天然血小板相似，當超聲聲強大于 0.25 W/cm2時（PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5），血小板則大部分呈現聚集分布，出現偽足或呈現扁狀等不規則形貌，說明大多數的血小板已被激活；而當超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間為 90 s 時（PLTs-US1-90s），相比天然的血小板和超聲時間為 60 s 的血小板樣品，激活的血小板數量增多，并且隨著超聲時間的增加（PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s），血小板的激活程度也逐漸加劇。因此，本研究提示超聲參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 的超聲能量對血小板的形貌沒有太大的影響。
圖1
超聲作用前后血小板的 SEM 圖像
Figure1.
SEM images of platelets before and after ultrasound
2.2 超聲作用前后正常血小板數量的測定
圖2 為超聲處理前后血小板的數量測定結果。由于血小板在活化的過程中會釋放比靜息血小板尺寸更小的微粒，所以靜息血小板個數與總微粒個數比值的測定結果，一方面可以反映血小板產生微粒數目的變化，另一方面也可以反映活化血小板數目的變化，從而可以得出超聲作用對血小板激活程度的影響。與未施加任何超聲作用的血小板樣品相比，樣品 PLTs-US1、PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s 的 P 值分別為 0.429、0.036、0.023、0.001、0.009、0.003、0.006、0.001。由此可知：當超聲時間為 60 s 時，施加超聲聲強為 0.25 W/cm2的血小板基本沒有被激活，而隨著超聲聲強的增加（0.25～1.25 W/cm2），血小板被逐漸激活，并且激活的程度不斷加劇；當超聲聲強為 0.25 W/cm2時，隨著超聲作用時間的延長（0～150 s），血小板被激活的程度亦逐漸增加，此測定結果與血小板形貌觀察結果相符。
圖2
超聲作用前后靜息血小板個數與樣品中總微粒個數的 比值結果（*，P < 0.05； **，P < 0.01）
Figure2.
The ratio of the resting platelets number to the total number of particles before and after ultrasound (*, P < 0.05; **, P < 0.01)
2.3 超聲作用對血小板聚集能力的影響
按照 1.2.1 小節所述方法對血小板進行超聲處理后，用酶標儀分光光度法對血小板的聚集能力進行了檢測。圖3a 是不同強度的超聲作用（1 MHz、60 s）血小板后的聚集結果，由圖中可以看出，超聲聲強為 0.25 W/cm2時，血小板的聚集趨勢基本與天然血小板相同，而當超聲聲強高于 0.25 W/cm2時，血小板呈現不規律的聚集趨勢，說明 0.25 W/cm2的超聲聲強對血小板的聚集能力基本沒有影響，而 0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2的超聲聲強影響了血小板的聚集能力。在此基礎上，進一步研究了不同的超聲時間（1 MHz、0.25 W/cm2）對血小板聚集功能的影響。如圖3b 所示，樣品 PLTs-US1-60s 為超聲時間 60 s 時的血小板，與圖3a 中的 PLTs-US1 是相同的樣品，其與天然血小板具有相同的聚集趨勢；當超聲時間為 90 s 時，0～600 s 的聚集趨勢與天然血小板及超聲時間 60 s 的血小板相似，但其 600 s 之后聚集程度基本保持不變，與天然血小板及超聲時間 60 s 的血小板聚集結果相比，趨于不變的時間有所提前，并且聚集趨勢迅速變化的階段不明顯。此外，當超聲時間進一步增加時（PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s），血小板呈現不規則的聚集趨勢。此結果說明了超聲參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 時，超聲能量的作用不會對血小板的聚集能力產生影響，超聲能量大于 0.25 W/cm2或者超聲時間大于 60 s 會影響血小板的聚集能力。
圖3
血小板聚集能力測定結果
a. 不同超聲聲強處理后的血小板；b. 不同超聲時間處理后的血小板
Figure3. Platelet aggregation resultsa. platelets treated with different ultrasonic intensity; b. platelets treated with different ultrasonic time
2.4 超聲作用對血小板蛋白成分的影響
血小板的紫外吸收光譜結果如圖4a 所示，超聲作用后血小板的紫外吸收光譜圖與未施加超聲血小板的光譜圖完全重合，并且都在 280 nm 處有吸收峰，這是由于蛋白質分子中氨基酸（色氨酸和酪氨酸）殘基的苯環所含有的共軛雙鍵，在 280 nm 波長處具有吸收紫外線的性質，并且超聲前后血小板的紫外吸收光譜一致，說明超聲作用后血小板的蛋白質分子中吸收紫外線的氨基酸未受影響。為了進一步研究血小板的蛋白質變化情況，實驗中通過 SDS-PAGE 實驗對血小板的蛋白條帶進行分析，如圖4b 所示，血小板超聲前后的蛋白條帶基本一致，超聲作用并未對血小板的蛋白成分產生影響，與血小板的紫外吸收結果相符。因此，本研究中所使用的超聲能量對血小板的蛋白成分沒有太大的影響。
圖4
超聲作用前后血小板的蛋白成分分析結果
a. 紫外吸收光譜分析結果；b. SDS-PAGE 結果
Figure4. Protein composition analysis results of platelets before and after ultrasounda. UV absorption spectrum analysis; b SDS-PAGE analysis
2.5 血小板活化程度的測定結果
為了進一步研究超聲對血小板活化程度的影響，用流式細胞儀監測超聲后血小板膜表面的 CD62P 變化，如圖5a 可知：與 FITC 鼠抗人 CD62P 抗體共孵育后的樣品 PLTs、PLTs-US1、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s 的流式細胞儀圖譜基本重合，而樣品 PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5 的圖譜則相對 PLTs 向右移，并且超聲聲強越大，移動的距離越大。另外，由圖5b 的熒光強度的平均值可知，樣品 PLTs、PLTs-US1、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s 的平均值近似，而樣品 PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5 的平均值則逐漸增大，與流式細胞儀的圖譜結果保持一致。這說明了超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間為 60 s 的超聲條件對血小板的活化程度基本沒有影響，而超聲聲強大于 0.25 W/cm2（0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2）則會激活血小板，這與血小板聚集實驗、SEM 圖像及超聲作用前后數量測定的結果一致。而對于超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間大于 60 s 的樣品，流式細胞儀的結果顯示，血小板膜表面的 CD62P 與天然的血小板無明顯區別，這可能是因為 CD62P 在血小板靜息狀態時位于血小板分泌細胞器 α 顆粒內，活化后期 α 顆粒會被釋放轉移到膜表面，因此，超聲時間的延長會影響血小板的聚集功能、表面形態以及微粒釋放，但對血小板 α 顆粒分泌 CD62P 無明顯影響。
圖5
流式細胞術分析超聲作用前后血小板表面 CD62P 結果
a. 圖譜結果；b. 熒光強度柱狀圖結果：*
a. histogram; b. statistical mean value: *
3 結論
本研究從超聲聲強、超聲作用時間兩方面研究了超聲能量對血小板生物活性的影響：首先，通過酶標儀分光光度法對血小板聚集功能進行探究；然后，通過 SEM 成像對血小板的形態學進行觀察，并進一步通過靜息血小板數目測定及流式細胞術研究了血小板的活化程度；最后，對超聲作用后血小板的蛋白成分進行了分析。最終得出結果：超聲頻率為 1 MHz 時，0.25 W/cm2的超聲聲強不僅對血小板的聚集功能沒有影響，而且對血小板的形態（SEM 圖像）及微粒釋放（粒徑分布、流式細胞儀檢測）均沒有明顯影響，但是當超聲聲強大于 0.25 W/cm2（0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2）時，除了會影響血小板的聚集能力，還會使血小板產生偽足，改變血小板的形態并增加血小板的微粒釋放，且隨著超聲聲強的增加而加劇對形態學和微粒釋放的影響；當超聲聲強為 0.25 W/cm2時，超聲時間 60 s 對血小板的生物活性不會產生影響，但是超聲時間大于 60 s 時（90、120、150 s），對血小板聚集能力、表面形態及微粒釋放會產生顯著影響，但對血小板 α 顆粒分泌 CD62P 無影響。除此之外，不同聲強和持續時間的超聲作用都不會改變血小板的蛋白成分。因此，超聲能量參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 時，對血小板的形貌結構、活化性能和蛋白成分均沒有影響；而超聲聲強大于 0.25 W/cm2以及超聲時間大于 60 s 時，會促進血小板的活化，影響血小板的生物活性。
綜上所述，本文系統地研究了超聲作用對血小板生物活性的影響，并從聚集功能、形貌特征、微粒釋放、激活分子及蛋白成分等方面對超聲作用后血小板的生物活性進行了客觀評估。超聲具有使用簡單、成本低廉以及無輻射損傷等特征[27]，超聲波振動可引起細胞質流動以及細胞休克、旋轉和摩擦，從而改變細胞膜的通透性。當超聲波能量為低強度時，該現象可逆，即在停止超聲輻照一段時間后，生物組織的結合狀態可以恢復，但是如果超聲波的強度太高，則會使生物組織內部出現不可逆的變化[24]。超聲的這些特性，使得超聲診斷和超聲治療在醫學領域應用廣泛。鑒于此，本研究通過使用無損超聲能量（1 MHz、0.25 W/cm2、60 s），增加了血小板膜的滲透性，促進了小分子物質進入血小板或血小板攝取外來物質的過程，進而實現了對血小板的標記，為研究以成像的方法診斷血小板相關疾病提供了研究基礎。另外，通過增大超聲聲強（大于 0.25 W/cm2）或者延長超聲時間（大于 60 s）的方法也為手術過程中減少患者出血性的風險提供了實驗依據。因此，本研究結果為超聲干預血管類疾病的治療以及降低術后出血風險的研究提供了體外實驗數據的支持。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
目前，血管類疾病仍然是威脅全世界人類健康的主要疾病之一。心腦血管疾病，如心梗、腦卒中等屬于臨床常見病與多發病，對患者的生活質量、健康等均造成了不良危害，已成為人類死亡的主要病因之一[1-2]。該類疾病主要表現為血液高凝狀態，即血液粘稠度高、流動速度慢，極易形成血栓而阻塞血管通路，導致局部血壓升高，進而影響血管的內膜結構，導致血管破裂、出血，并產生相應心腦血管的癥狀[3]。
在心腦血管疾病中，血小板是參與發病機制的重要因素[4]。血小板來源于骨髓成熟的巨核細胞，作為血液的主要成分之一，不僅在維持血管血液正常循環方面發揮作用[5-6]，而且在凝血、傷口愈合、炎癥反應等生理和病理過程中具有極其重要的作用[7-8]。2017 年，Tomaiuolo 等[9]提出血小板在止血過程中，可能會引發血栓的形成。2019 年，van der Meijden 等[10]對血小板在止血及血栓形成等過程中發揮作用的機制進行了深入探討。因此，血小板既是創傷后出血的保護機制，又是誘發心腦血管疾病的主要原因[11]。血小板這些功能的實現與其活化的狀態緊密相關，局部血小板的活化以及血小板的過度反應是心血管疾病發生的重要原因[12]，血小板活性或聚集性亦與心血管危害事件的預后密切關聯。因此，探究包括物理因素、化學因素和生物因素等對血小板生物活性的影響對心血管疾病有重要的臨床預測及監測價值[13]。
超聲波既可以用于人體疾病的診斷，又可以作為一種物理性能量形式用于疾病的治療。例如，超聲引導下經皮血管成形術治療血透患者動靜脈內瘺狹窄，既可以實時引導又能減少醫患放射線暴露[14-15]；血管內超聲是臨床上冠心病介入治療的重要輔助檢測方式，并且能夠反映血管內腔的變化以及管腔橫斷面結構、血管壁厚度、形態、斑塊成分等[16-17]；術中超聲可快速實時定位病變，判斷病變邊界，避免不必要的出血及損傷[18-20]；超聲引導關節腔注射富血小板血漿可有效改善輕、中度膝骨關節炎患者的疼痛，提高了患者的生存質量[21]。此外，超聲能量還能夠通過聲動力療法治療動脈粥樣硬化等血管疾病[22-23]，在不損傷細胞本身生物活性的情況下，通過瞬時增強細胞膜的通透性，使外來小分子物質進入細胞，進而標記細胞，進行細胞成像的應用研究[24]。
鑒于超聲在血管等疾病的臨床實踐和醫學研究中應用的普遍性，研究超聲對血小板生物活性的影響具有十分重要的意義。2012 年，Stief 等[25]研究了不同超聲頻率對人血液凝固程度的影響；2018 年，Jin 等[26]報道了超聲干預血小板原位合成金納米顆粒；2019 年，Liu 等[27]探究了超聲作用對裝載金納米顆粒的血小板生物活性的影響。雖然這些研究在一定程度上探究了超聲能量對血小板的影響，但是所研究的血小板生物學功能不夠全面，血小板生物活性的檢測指標單一，超聲能量的設計亦不夠系統，故需進一步系統研究超聲能量參數對血小板生物活性的影響。
本論文針對血小板生物活性的變化，通過不同超聲聲強、作用時間對血小板進行干預，探究了超聲作用對血小板的形貌、聚集能力、數量及蛋白成分等方面的影響，并通過異硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）熒光標記的鼠抗人 CD62P 抗體靶向活化血小板表面的 CD62P 分子，進一步探究了血小板的生物活性變化。
1 材料和方法
1.1 材料
實驗所用的新鮮濃縮血小板（1.0 × 109～1.3 ×109個血小板/mL），由江蘇省血液中心提供。FITC Mouse anti-Human CD62P（FITC 鼠抗人 CD62P 抗體）購自美國 BD 公司。人凝血酶購自美國 Sigma 公司。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、RIPA 裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）和考馬斯亮藍染色液均購自碧云天生物科技有限公司（海門，中國）。
1.2 方法
1.2.1 血小板的處理
首先，將儲存在酸性枸櫞酸鹽葡萄糖（acid citrate dextrose，ACD）中的血小板 600 g 離心 5 min 使血小板沉淀，棄去上清，收集血小板；然后，用 0.9% NaCl 等體積重懸血小板，再吸取樣品 10 μL 置 100 mL 電解液（0.9% NaCl 作為電解液）中，用粒徑分析儀（Multisizer4e，美國）20 μm 規格的小孔管（所測粒徑范圍為 0.4～12 μm；小孔管清洗需先用無水乙醇浸泡，再用純水清洗）從電解液中吸取 50 μL 樣品，進行測量并分析記錄粒徑范圍在 1～8 μm（血小板的直徑范圍）的血小板濃度（儀器可自動計算得出），最后用 0.9% NaCl 將血小板稀釋至濃度約為 7.08×108個血小板/mL。
1.2.2 超聲能量參數的調控
取處理后的血小板懸浮液 1 mL 置于 24 孔板（每孔 1 mL）中，然后進行如下超聲能量的處理：① 對不同孔中的相同試樣施以超聲脈沖重復頻率為 100 Hz，占空比為 20%，聲強分別為 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2的脈沖超聲波（1 MHz，60 s，DM-200B，深圳市德邁科技有限公司，中國），超聲處理后的血小板樣品分別記作 PLTs-US1、PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5；② 對不同孔中的相同試樣分別施以超聲時間為 60、90、120、150 s 的脈沖超聲波（1 MHz，0.25 W/cm2）。超聲處理后的血小板樣品分別記作 PLTs-US1-60s 或 PLTs-US1、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s。
1.2.3 血小板數量測定
由于血小板活化后釋放的微粒（粒徑范圍在 30 nm～1 μm）小于靜息血小板平均尺寸（2.0～5.0 μm），所以用粒徑分析儀（貝克曼 Multisizer4e，美國）20 μm 規格的小孔管測定超聲作用前后靜息血小板的數量，以此來分析判斷超聲對血小板活性的影響，具體方法如下：① 將初始濃度相同的血小板（約為 7.08×108個血小板/mL）分別施加不同的超聲條件（如 1.2.2 小節所述），并以沒有施加超聲刺激的血小板懸浮液作為空白對照組（PLTs）；② 分別吸取 10 μL 上述施加和未施加超聲波的血小板懸浮液，用粒徑分析儀對平均尺寸為 2.0～5.0 μm 的靜息血小板個數及其與樣品中總微粒個數的比值進行測定并分析。
1.2.4 血小板的形態學觀察
由于血小板在活化的過程中還會形成許多肌動蛋白聚合驅動的膜突起，突起改變了血小板的形態特征，因此用場發射掃描電子顯微鏡（SEM，Ultra Plus，德國）在加速電壓 1.00 kV 下觀察施加超聲波前后血小板的形態，樣品處理具體方法如下：① 將施加和未施加超聲波的血小板懸浮液 600 g 離心 5 min 后，棄上清，等體積加入 2.5% 的戊二醛溶液；② 將樣品放入恒溫混勻儀中，于 250 r/min、22 ℃ 條件下固定 30 min；③ 將固定完畢后的樣品 600 g 離心 5 min，加純水重復洗滌 3 次；④ 稀釋樣品使其濃度是原來的 20%，取其中 5 μL 滴硅片至自然干燥，然后，用 SEM 研究血小板的形貌。
為保證 SEM 表征結果的準確性和有效性，在滴加樣品之前，需先對硅片進行如下處理：① 用硅片刀將大塊的硅片切割成 0.5 cm×0.5 cm 大小；② 按濃硫酸和過氧化氫水溶液體積比為 3∶1 配制皮爾哈洗液，將其倒入盛有硅片的燒杯中，加熱煮沸，在此過程中，為徹底清洗硅片以及防止局部溫度過高而導致液體濺出，在煮沸的整個過程中（約 2 h）需每隔 0.5 h 攪拌一次，每次攪拌 5 min 左右（此加熱煮沸過程需在通風櫥中進行）；③ 將燒杯中的皮爾哈洗液回收到實驗室指定的廢液桶后，先用自來水沖洗燒杯中的硅片 5 遍，再用超純水沖洗 5 遍；④ 向燒杯中重新倒入超純水使其硅片浸泡其中，并將燒杯放入超聲波清洗儀中超聲清洗 15 min 后，如此重復 3 次；⑤ 再次除去水，然后用無水乙醇進行超聲重復清洗 3 次，最后將硅片置于裝有無水乙醇的廣口瓶中，密封保存；⑥ 使用前，取出硅片用氮氣將其吹干。
1.2.5 血小板聚集能力的測定
使用酶標儀分光光度法評估血小板的聚集，每個樣品重復測定 3 次（n = 3）。首先，將濃度為 1 IU/mL 的 500 μL 人凝血酶分別加入 1.2.2 小節中超聲處理后的血小板中；然后，在多功能酶標儀讀數器（Tecan Infinite 200PRO，中國）上，每隔 120 s 記錄一次 650 nm 波長處的血小板吸光度值，同時，基于濁度的降低觀察血小板的聚集情況。
1.2.6 血小板蛋白含量的測定
首先，將 1.2.2 小節中超聲處理后的血小板 600 g 離心 5 min，去除上清；然后，向樣品中分別加入 1 mL RIPA 裂解液，用移液器吹打數下至細胞完全裂解。然后通過如下兩種方法對裂解的蛋白質進行測定：① 各取 2 μL 裂解后的樣品，使用超微量核酸蛋白檢測儀（Nano-300，中國）的紫外測量功能對樣品進行全譜（200～800 nm）測定，分析各個樣品紫外吸收峰的特征；② 將裂解后的樣品與完全溶解的 5×上樣緩沖液（含有少量 DTT）按照 4∶1 的比例混勻后，沸水浴加熱 5 min，以充分變性樣品中的蛋白，經離心去除雜質后，各取 20 μL 用 SDS-PAGE（DYY-12，中國）檢測血小板蛋白條帶。
1.2.7 流式細胞儀測定
由于血小板活化后，其內的 α 顆粒與質膜或開放管道系統融合，使 CD62P 在細胞膜上的表達顯著增加，所以 CD62P 被認為是反映血小板活化的“金標準”，是血小板活化程度及血栓形成的特異性標志物。鑒于此，本文通過流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國）分析血小板膜表面 CD62P 的變化來判斷超聲作用對血小板活化程度的影響，具體方法如下：以相同濃度的無超聲作用和熒光抗體連接的血小板溶液作為空白對照，將施加和未施加超聲的樣品各取 1 mL 分別與 20 μL FITC 鼠抗人 CD62P 抗體于 22 ℃、250 r/min、避光條件下在恒溫混勻儀中共孵育 30 min，然后離心（600 g）洗滌 5 min，重復上述離心洗滌操作 2 次，以去除游離的 FITC 鼠抗人 CD62P 抗體，將各個待測樣品用 0.9% NaCl 稀釋至約 1×106個細胞/mL 后，使用流式細胞儀測試熒光強度（每個樣品所測細胞至少 10 000 個），所得實驗數據用 FlowJo 7.6 分析。
1.2.8 統計學分析
所有結果均由三次獨立實驗（n = 3）表示。此外，使用 Microsoft Excel 分析數值數據，并使用單向方差分析測試確定統計學意義。檢驗水準為 0.05。
2 結果與討論
2.1 血小板形貌觀察結果
圖1 是超聲作用前后血小板的場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖像，天然血小板（PLTs）的 SEM 圖像顯示：大多數的血小板呈圓球形，單個分布，無偽足；超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間為 60 s 時（PLTs-US1），血小板的 SEM 圖像與天然血小板相似，當超聲聲強大于 0.25 W/cm2時（PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5），血小板則大部分呈現聚集分布，出現偽足或呈現扁狀等不規則形貌，說明大多數的血小板已被激活；而當超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間為 90 s 時（PLTs-US1-90s），相比天然的血小板和超聲時間為 60 s 的血小板樣品，激活的血小板數量增多，并且隨著超聲時間的增加（PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s），血小板的激活程度也逐漸加劇。因此，本研究提示超聲參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 的超聲能量對血小板的形貌沒有太大的影響。
圖1
超聲作用前后血小板的 SEM 圖像
Figure1.
SEM images of platelets before and after ultrasound
2.2 超聲作用前后正常血小板數量的測定
圖2 為超聲處理前后血小板的數量測定結果。由于血小板在活化的過程中會釋放比靜息血小板尺寸更小的微粒，所以靜息血小板個數與總微粒個數比值的測定結果，一方面可以反映血小板產生微粒數目的變化，另一方面也可以反映活化血小板數目的變化，從而可以得出超聲作用對血小板激活程度的影響。與未施加任何超聲作用的血小板樣品相比，樣品 PLTs-US1、PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s 的 P 值分別為 0.429、0.036、0.023、0.001、0.009、0.003、0.006、0.001。由此可知：當超聲時間為 60 s 時，施加超聲聲強為 0.25 W/cm2的血小板基本沒有被激活，而隨著超聲聲強的增加（0.25～1.25 W/cm2），血小板被逐漸激活，并且激活的程度不斷加劇；當超聲聲強為 0.25 W/cm2時，隨著超聲作用時間的延長（0～150 s），血小板被激活的程度亦逐漸增加，此測定結果與血小板形貌觀察結果相符。
圖2
超聲作用前后靜息血小板個數與樣品中總微粒個數的 比值結果（*，P < 0.05； **，P < 0.01）
Figure2.
The ratio of the resting platelets number to the total number of particles before and after ultrasound (*, P < 0.05; **, P < 0.01)
2.3 超聲作用對血小板聚集能力的影響
按照 1.2.1 小節所述方法對血小板進行超聲處理后，用酶標儀分光光度法對血小板的聚集能力進行了檢測。圖3a 是不同強度的超聲作用（1 MHz、60 s）血小板后的聚集結果，由圖中可以看出，超聲聲強為 0.25 W/cm2時，血小板的聚集趨勢基本與天然血小板相同，而當超聲聲強高于 0.25 W/cm2時，血小板呈現不規律的聚集趨勢，說明 0.25 W/cm2的超聲聲強對血小板的聚集能力基本沒有影響，而 0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2的超聲聲強影響了血小板的聚集能力。在此基礎上，進一步研究了不同的超聲時間（1 MHz、0.25 W/cm2）對血小板聚集功能的影響。如圖3b 所示，樣品 PLTs-US1-60s 為超聲時間 60 s 時的血小板，與圖3a 中的 PLTs-US1 是相同的樣品，其與天然血小板具有相同的聚集趨勢；當超聲時間為 90 s 時，0～600 s 的聚集趨勢與天然血小板及超聲時間 60 s 的血小板相似，但其 600 s 之后聚集程度基本保持不變，與天然血小板及超聲時間 60 s 的血小板聚集結果相比，趨于不變的時間有所提前，并且聚集趨勢迅速變化的階段不明顯。此外，當超聲時間進一步增加時（PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s），血小板呈現不規則的聚集趨勢。此結果說明了超聲參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 時，超聲能量的作用不會對血小板的聚集能力產生影響，超聲能量大于 0.25 W/cm2或者超聲時間大于 60 s 會影響血小板的聚集能力。
圖3
血小板聚集能力測定結果
a. 不同超聲聲強處理后的血小板；b. 不同超聲時間處理后的血小板
Figure3. Platelet aggregation resultsa. platelets treated with different ultrasonic intensity; b. platelets treated with different ultrasonic time
2.4 超聲作用對血小板蛋白成分的影響
血小板的紫外吸收光譜結果如圖4a 所示，超聲作用后血小板的紫外吸收光譜圖與未施加超聲血小板的光譜圖完全重合，并且都在 280 nm 處有吸收峰，這是由于蛋白質分子中氨基酸（色氨酸和酪氨酸）殘基的苯環所含有的共軛雙鍵，在 280 nm 波長處具有吸收紫外線的性質，并且超聲前后血小板的紫外吸收光譜一致，說明超聲作用后血小板的蛋白質分子中吸收紫外線的氨基酸未受影響。為了進一步研究血小板的蛋白質變化情況，實驗中通過 SDS-PAGE 實驗對血小板的蛋白條帶進行分析，如圖4b 所示，血小板超聲前后的蛋白條帶基本一致，超聲作用并未對血小板的蛋白成分產生影響，與血小板的紫外吸收結果相符。因此，本研究中所使用的超聲能量對血小板的蛋白成分沒有太大的影響。
圖4
超聲作用前后血小板的蛋白成分分析結果
a. 紫外吸收光譜分析結果；b. SDS-PAGE 結果
Figure4. Protein composition analysis results of platelets before and after ultrasounda. UV absorption spectrum analysis; b SDS-PAGE analysis
2.5 血小板活化程度的測定結果
為了進一步研究超聲對血小板活化程度的影響，用流式細胞儀監測超聲后血小板膜表面的 CD62P 變化，如圖5a 可知：與 FITC 鼠抗人 CD62P 抗體共孵育后的樣品 PLTs、PLTs-US1、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s 的流式細胞儀圖譜基本重合，而樣品 PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5 的圖譜則相對 PLTs 向右移，并且超聲聲強越大，移動的距離越大。另外，由圖5b 的熒光強度的平均值可知，樣品 PLTs、PLTs-US1、PLTs-US1-90s、PLTs-US1-120s、PLTs-US1-150s 的平均值近似，而樣品 PLTs-US2、PLTs-US3、PLTs-US4、PLTs-US5 的平均值則逐漸增大，與流式細胞儀的圖譜結果保持一致。這說明了超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間為 60 s 的超聲條件對血小板的活化程度基本沒有影響，而超聲聲強大于 0.25 W/cm2（0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2）則會激活血小板，這與血小板聚集實驗、SEM 圖像及超聲作用前后數量測定的結果一致。而對于超聲聲強為 0.25 W/cm2、超聲時間大于 60 s 的樣品，流式細胞儀的結果顯示，血小板膜表面的 CD62P 與天然的血小板無明顯區別，這可能是因為 CD62P 在血小板靜息狀態時位于血小板分泌細胞器 α 顆粒內，活化后期 α 顆粒會被釋放轉移到膜表面，因此，超聲時間的延長會影響血小板的聚集功能、表面形態以及微粒釋放，但對血小板 α 顆粒分泌 CD62P 無明顯影響。
圖5
流式細胞術分析超聲作用前后血小板表面 CD62P 結果
a. 圖譜結果；b. 熒光強度柱狀圖結果：*
a. histogram; b. statistical mean value: *
3 結論
本研究從超聲聲強、超聲作用時間兩方面研究了超聲能量對血小板生物活性的影響：首先，通過酶標儀分光光度法對血小板聚集功能進行探究；然后，通過 SEM 成像對血小板的形態學進行觀察，并進一步通過靜息血小板數目測定及流式細胞術研究了血小板的活化程度；最后，對超聲作用后血小板的蛋白成分進行了分析。最終得出結果：超聲頻率為 1 MHz 時，0.25 W/cm2的超聲聲強不僅對血小板的聚集功能沒有影響，而且對血小板的形態（SEM 圖像）及微粒釋放（粒徑分布、流式細胞儀檢測）均沒有明顯影響，但是當超聲聲強大于 0.25 W/cm2（0.50、0.75、1.00、1.25 W/cm2）時，除了會影響血小板的聚集能力，還會使血小板產生偽足，改變血小板的形態并增加血小板的微粒釋放，且隨著超聲聲強的增加而加劇對形態學和微粒釋放的影響；當超聲聲強為 0.25 W/cm2時，超聲時間 60 s 對血小板的生物活性不會產生影響，但是超聲時間大于 60 s 時（90、120、150 s），對血小板聚集能力、表面形態及微粒釋放會產生顯著影響，但對血小板 α 顆粒分泌 CD62P 無影響。除此之外，不同聲強和持續時間的超聲作用都不會改變血小板的蛋白成分。因此，超聲能量參數為 1 MHz、0.25 W/cm2、60 s 時，對血小板的形貌結構、活化性能和蛋白成分均沒有影響；而超聲聲強大于 0.25 W/cm2以及超聲時間大于 60 s 時，會促進血小板的活化，影響血小板的生物活性。
綜上所述，本文系統地研究了超聲作用對血小板生物活性的影響，并從聚集功能、形貌特征、微粒釋放、激活分子及蛋白成分等方面對超聲作用后血小板的生物活性進行了客觀評估。超聲具有使用簡單、成本低廉以及無輻射損傷等特征[27]，超聲波振動可引起細胞質流動以及細胞休克、旋轉和摩擦，從而改變細胞膜的通透性。當超聲波能量為低強度時，該現象可逆，即在停止超聲輻照一段時間后，生物組織的結合狀態可以恢復，但是如果超聲波的強度太高，則會使生物組織內部出現不可逆的變化[24]。超聲的這些特性，使得超聲診斷和超聲治療在醫學領域應用廣泛。鑒于此，本研究通過使用無損超聲能量（1 MHz、0.25 W/cm2、60 s），增加了血小板膜的滲透性，促進了小分子物質進入血小板或血小板攝取外來物質的過程，進而實現了對血小板的標記，為研究以成像的方法診斷血小板相關疾病提供了研究基礎。另外，通過增大超聲聲強（大于 0.25 W/cm2）或者延長超聲時間（大于 60 s）的方法也為手術過程中減少患者出血性的風險提供了實驗依據。因此，本研究結果為超聲干預血管類疾病的治療以及降低術后出血風險的研究提供了體外實驗數據的支持。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
