在胚胎發育過程的研究中，胚胎各階段的形態特征是評價其發育優劣的重要依據，用于指導胚胎體外培養體系的優化和改進。本文為胚胎長時程培養設計了一種基于“低倍搜尋、高倍觀察”策略的在線監測系統。首先，針對胚胎在發育過程中體積不斷增大的情況，本系統配置了4倍相差、10倍和20倍霍夫曼調制相襯三種光學模塊，以滿足不同視場的觀察需求；通過光機系統匹配設計、誤差控制和裝調試驗，保證了成像光學分辨率，并獲得了胚胎的高對比度的浮雕立體成像效果；然后，通過低倍大視場進行識別定位，高倍小視場捕獲細節，本系統實現了胚胎的在線跟蹤監測；最后，開發并驗證了一種基于圖像輪廓面積和清晰度評價的胚胎識別定位算法。本文開發的體外胚胎培養在線監測系統能在不影響胚胎發育的前提下，跟蹤記錄發育過程的形態特征，為胚胎發育評估和體外培養體系的優化提供依據。
引用本文： 曾維俊, 趙振英, 楊語諶, 周旻超, 王弼陡, 孫海旋. 胚胎長時程培養在線監測系統設計與試驗. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(6): 1134-1143. doi: 10.7507/1001-5515.202107053 復制
引言
隨著2021年我國三胎政策的全面開放，預防和治療新生兒的出生缺陷已成為生殖生物學領域重要的科研方向。但目前，對人類胚胎正常發育的生理學過程，尚有很多未解之謎。所以，對人類胚胎發育過程的研究，不僅有助于人們對生命起源和胚胎發育的進一步了解，更為解決出生缺陷等重大生殖健康問題提供了理論基礎[1]。
國際倫理標準規定，人類胚胎的科學研究只能止步于受精后14天，而與出生缺陷相關的疾病，如無腦畸形、先天性心臟病等的發生，大多與以原腸運動為基礎的三胚層分化異常密切相關，發生在受精14天之后[2]。因此科研人員只能借助于模式動物，如小鼠和猴子，探索胚胎更長時期的發育機制。目前，中國科學院動物研究所的科研人員已成功實現食蟹猴胚胎在體外長時程培養至受精后20天，并在此基礎上研究了靈長類動物原腸運動的發生過程[3]。不過由于人員經驗、實驗技術和培養條件的限制，雖然在發育不同階段鑒定了胚胎特征，但無法追蹤到胚胎在整個發育過程中的動態變化，且胚胎體外培養不同批次之間穩定性和重復性差，發育至后期階段的比例非常有限。因此急需開發一種新型全自動的胚胎培養設備，能對溫濕度、氣體組分、培養液成分、液流剪切力等參數進行在線調控，以實現更長時程的胚胎培養。同時，為追蹤胚胎發育過程信息，培養設備需對胚胎發育全程進行在線監測，還原胚胎的形態變化，記錄胚胎發育的關鍵事件。
胚胎早期（囊胚之前）的體外培養系統，目前主要采用微滴或微穴培養方式，胚胎從受精卵開始發育，經歷原核期、卵裂期、桑椹胚和囊胚期，總體積變化不大，且胚胎處于靜置狀態，便于自動化顯微成像和在線監測，基于微穴培養的觀察方式已衍生多種臨床應用的培養箱產品，如time-lapse培養箱，胚胎在培養期間不受外界干擾，由內置的光學模塊對胚胎發育過程的形態進行延時拍攝，基于胚胎形態動力學參數評估其發育潛能，篩選出最優的胚胎[4-7]。然而，在體外長時程培養條件下，隨時間推移，胚胎的發育體積變化巨大，以小鼠為例，其妊娠期為20天，受精后4.5天達到囊胚期，胚體大小約為0.1 mm，而到12.5天時胚體增長至約4.2 mm，增長約40倍[8]。因此采用微滴或微穴培養方式和單一光學觀察方式顯然已無法滿足更長時程發育的培養和觀測需求。另外受在線換液和液流剪切動作影響，胚胎在培養液中的位置會隨液體流動在培養空間內改變，相應的光學系統成像視場中心和焦面位置也需要及時進行調整，極大地增加了在線自動觀察的難度。
本文針對胚胎體外長時程培養過程中的形態觀察需求，開發了一套在線培養監測裝置和配套培養器皿，為胚胎不同發育階段配置了不同放大倍數的光學觀察模塊，基于“低倍搜尋、高倍觀察”的策略，采用多維運動機構對胚胎進行自動跟蹤和捕捉，通過圖像處理算法識別和定位胚胎在空間中的位置，最終拍攝得到清晰的胚胎圖像。為了驗證系統的可行性，本文以小鼠為試驗對象，取小鼠受精后第3天的胚胎進行體外長時程培養，拍攝了胚胎從囊胚發育至原腸胚不同階段的形態，驗證了光學系統的成像質量；然后在裝置內開展了胚胎的在線培養監測試驗研究，將胚胎置于培養皿柵罩內的任意位置，系統按照設計的在線跟蹤策略和圖像處理算法對胚胎進行自動捕捉和成像，從而獲得胚胎清晰圖像。文中涉及的鼠胚動物試驗得到了中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所實驗動物倫理委員會的批準。
1 胚胎長時程培養裝置方案
胚胎長時程培養裝置作為體外生命孕育系統，用于模擬子宮內環境研究胚胎發育機制和不同因素對胚胎發育的影響，從而探索新型的胚胎體外培養體系。早期胚胎的體外培養和監測技術已較為成熟，而囊胚之后的培養目前只能依靠人工操作和經驗技術，缺乏自動化設備，因此，長時程培養裝置的開發目的，一方面研究優化培養參數，構建穩定的培養體系，做到高通量和高成活率培養，在此基礎上探索更長時程的培養，另一方面通過在線監測記錄胚胎發育的過程信息，動態評估胚胎發育優劣，為培養參數調控提供依據。
1.1 培養裝置組成
胚胎長時程培養裝置及配套培養器皿如圖1所示，其中培養裝置主要包括培養模塊、液路模塊、氣路模塊和光學模塊。培養模塊提供37 ℃恒溫培養環境，由多個培養室組成，每個培養室內部可放置一個培養器皿，液路模塊負責培養液的在線更換和液流剪切動作的實現，氣路模塊用于供應胚胎發育所必需的CO2混合氣，光學模塊負責培養期間對胚胎的在線監測。
圖1
胚胎長時程培養裝置及配套培養器皿
Figure1.
Long-term embryo culture device and matching culture utensils
胚胎培養器皿由柵罩和35 mm標準培養皿構成。柵罩貼于培養皿的底部，由兩個長片和八個隔片拼接形成4個正方形的培養隔間，每個隔間內放置一枚胚胎，在培養隔間四周的相應區域開設柵孔，孔隙為0.1 mm左右，能允許培養液內外自由交換，同時阻擋胚胎逸出。培養隔間截面尺寸為4.5 mm × 4.5 mm，滿足胚胎長時程培養的空間需求。培養隔間沿直線排列，與培養室排列方向一致，便于光學模塊運動掃描和觀察。
液路的進液針一分四對準每個培養隔間，換液時通過柵孔能將新鮮培養液灌注至培養隔間內，通過液路泵閥的控制可以實現進液針對培養液的吸吐動作，在培養隔間內部形成紊流，從而達到對胚胎的液流剪切效果。
1.2 在線監測方案
通過柵罩的空間約束，胚胎可以有效地約束在特定空間內，為光學觀察提供了便利，但是由于換液和液流剪切動作的影響，胚胎在培養液中的位置會隨液體流動在培養隔間內發生改變，極大地增加了在線自動觀察的難度。
針對上述問題，本文提出了低倍搜尋、高倍觀察的監測方案，如圖2所示，首先低倍觀察模式下，移動光學系統的視場中心至胚胎培養隔間的中央處，在低倍大視場物鏡下拍攝培養隔間的完整圖像，基于圖像算法識別出胚胎的輪廓，并定位胚胎的中心坐標，計算其相對視場中心的偏離量，然后通過運動機構對光學系統進行位置補償，將視場中心移動至胚胎中心處，再切換至高倍小視場物鏡拍攝胚胎的細節。
圖2
胚胎在線監測方案示意
Figure2.
Schematic diagram of online embryo monitoring
采用低倍搜尋、高倍觀察的監測方案，可以應對不同發育階段胚胎體積變化的情況，選用合適的光學系統進行觀察或拍攝。欲實現理想的監測效果，需解決以下幾個問題：
（1）光學系統匹配：為胚胎長時程培養匹配合適的光學系統，滿足觀察分辨率和立體感需求，記錄胚胎發育過程的形態細節。
（2）光機運動模塊設計：光學系統由低倍切換至高倍觀察涉及到多自由度的機械運動，通過誤差控制，既要保證光學成像分辨率，又要實現精確位置定位。
（3）胚胎在線跟蹤策略：基于培養裝置的系統控制架構，建立各個模塊或部件的配合時序關系，實現對胚胎的自動化在線跟蹤和拍攝。
（4）胚胎圖像處理算法：圖像處理算法用于識別胚胎輪廓并定位胚胎在培養隔間內的坐標，進而進行位置補償并切換至高倍觀察，是對胚胎進行跟蹤和捕捉以實現長時程在線監測的核心。
2 光機系統設計與驗證
胚胎細胞是透明的，在非熒光染色觀察時利用光的干涉原理，將通過樣品光線的相位差轉換為人眼可以分辨的振幅差（即明暗），使樣品便于觀察，廣泛運用的觀察方式有相差、霍夫曼調制相襯和微分干涉相襯觀察三種[9-12]。其中，相差系統簡單經濟，常用于活體細胞的鑒定和細胞計數，后兩者可以使細胞產生較強的三維立體效果，對比度更高，觀察更直觀，尤其適合顯微操作。
本文采用相差和霍夫曼調制相襯結合的方式對胚胎進行在線監測，低倍搜尋時采用相差成像，能分辨出胚胎的大致輪廓即可，高倍觀察時采用霍夫曼調制相襯成像，能呈現對比度更高的胚胎內部形態細節。
2.1 光學系統匹配
胚胎在線監測的光學系統方案如圖3所示，采用倒置顯微鏡結構，支持相差和霍夫曼調制相襯兩種觀察模式，照明光依次經過偏振片、光闌、聚光鏡、胚胎樣品、物鏡、筒鏡和合適的縮小鏡后，在相機靶面上成像，通過切換物鏡和相應的光闌，可以更改胚胎的觀察方式為相差或霍夫曼調制相襯。
圖3
光學系統方案
Figure3.
Optical system scheme
為適應胚胎發育不同階段的觀測需求，采用了3種不同放大倍數的物鏡，分別為4 ×、10 × 和20 × 物鏡，其中，4×為相差物鏡，用于大視場成像和胚胎搜尋，后兩者為霍夫曼調制相襯物鏡，用于小視場胚胎細節的觀察，光學系統元件選用奧林巴斯相關模塊，其中關鍵的元件和參數配置如表1所示。
表1
光學系統主要元件及參數
Table1.
Main components and parameters of optical system
不同光譜成分對胚胎的發育影響不同，藍紫光對胚胎發育損傷最大，綠光和紅光幾乎沒有損傷[13-14]。本文胚胎培養裝置的照明光選用對胚胎發育影響最小的紅光，波長為635 nm，單色光可有效降低光學系統的色差影響。
根據光學元件相關參數可以由下式計算得到系統的光學分辨率[15]：
 |
式中，R為光學分辨率，λ為入射光波長，NA為物鏡的數值孔徑。
為了讓被物鏡分辨清楚的圖像細節也被相機分辨清楚，相機理想像元尺寸需滿足奈奎斯特采樣定律[16]，由如下公式計算：
 |
式中，l為相機理想像元尺寸，R為光學分辨率，M為光學系統的綜合放大倍率。
此外，在4×相差視場觀察下，相機靶面要求能覆蓋完整的單個培養隔間（4.5 mm × 4.5 mm）。
因此，光學系統的參數匹配要求如表2所示，最終選用相機為度申科技USB3.0大靶面相機，型號U3P2 100-H，分辨率5 480 × 3 648，像元大小3.45 μm，靶面尺寸18.9 mm × 12.6 mm。
表2
光學系統參數匹配表
Table2.
Parameter matching of optical system
2.2 光機運動模塊設計
胚胎在線監測的光學系統采用倒置顯微鏡結構方案，如圖4所示，所有光學元件安裝在立柱上，呈C型結構，培養模塊位于聚光鏡和物鏡模塊之間，其中光闌和物鏡均沿直線排布，可以通過相應的x向直線運動機構實現光闌和物鏡的切換，使兩者搭配進行觀察。物鏡模塊搭載在調焦機構上，可沿z向作升降運動，調節物鏡成像焦平面的高度，從而對樣品不同層切面成像。
圖4
光機運動模塊實物圖
Figure4.
Picture of optomechanical motion module
另外，采用低倍搜尋、高倍觀察的監測方案，需根據胚胎偏離光學系統視場中心的坐標值對光學系統x和y方向的位置進行補償，分別由平臺x機構和平臺y機構執行相應的動作，同時通過平臺x機構可以將光學系統切換至不同培養室內的培養隔間進行觀察。
所有直線運動單元采用步進電機+絲桿傳動的方式，為保證機構的定位精度，步進電機配置了編碼器，避免運動過程中的丟步現象，絲桿螺母通過消隙處理避免空回誤差。
為保證光學系統的成像質量，立柱上了設置了x和y向定位基準，用以對安裝在立柱上的光學元件的離軸誤差進行控制，光學系統的綜合離軸誤差合成公式如下[17-18]：
 |
式中
為系統綜合離軸誤差，
和
為x和y向的離軸誤差分量，其中以
為例，計算公式如下：
 |
式中
為第i個光學元件中心至x基準面的距離誤差，主要由零件的尺寸加工誤差引入，考慮到各光學元件的誤差傳遞方式相同，裝配尺寸相近，可以按等作用誤差原則進行分配，計算公式如下：
 |
控制光學系統的綜合離軸誤差為0.05 mm，由于光闌和物鏡x向是可移動的，通過運動機構精度保證，各光學元件中心至基準的誤差分配結果詳見表3，據此對相關結構件的尺寸誤差進行約束。
表3
光學系統誤差分配表（mm）
Table3.
Error distribution of optical system (mm)
2.3 系統裝調與試驗
為保證成像質量，達到設計分辨率要求和高對比度效果，光學系統裝調最關鍵的環節便是滿足相差光路環形光闌與物鏡內置相位板的共軛關系，以及霍夫曼調制相襯光路矩形光闌與物鏡內置調制板的共軛的關系，其裝調示意圖如圖5所示。
圖5
光學系統裝調示意
Figure5.
Installation and adjustment of optical system
在相差觀察視場內，照明光通過環形光闌呈現為明亮的圓環，而物鏡后焦面內置相位板為灰暗的圓環，兩者互相匹配，大小一致，需要通過x和y兩個方向的平移，保證兩者重合。
霍夫曼物鏡后焦面內置調制板分為三個區域，依次是D區（透光率1%）、G區（透光率15%）和B區（透光率100%）。矩形光闌分兩個區域，一是透射區（T區），另一個是亮度隨偏振器而改變的偏振區（P區）。在霍夫曼觀察視場內，調節x、y方向的平移和繞軸旋轉，使矩形光闌的T區進入物鏡調制板的G區，光闌的P區進入物鏡調制板的B區。通過旋轉位于光闌上部的偏振片的角度，可以改變圖像對比度。
本研究對光學系統的成像質量進行了驗證。利用Edmund USAF 1951分辨率測試目標板（空間頻率最高645 lp/mm）對光學分辨率進行測試。取分辨率板成像圖案中剛能分辨的某一單元線條，查找對應的空間頻率的數值，由下式計算系統的光學分辨率。
 |
式中，R為光學分辨率（單位：μm），f為空間頻率（單位：lp/mm）。
最終系統的光學分辨率測試結果如表4所示，考慮到光學系統不可避免存在像差，測量值與理論值接近，認為三種模式均達到了光學設計要求。
表4
光學分辨率測試結果
Table4.
Results of optical resolution test
2.4 胚胎成像試驗
分辨率是表征光學成像系統解析物體細節的能力，而胚胎作為透明體，光線經過樣品后產生的相位差轉換成圖像對比度的變化，所呈現出的直觀立體效果可以通過實際胚胎成像進行觀察和評價。胚胎從囊胚發育至原腸胚不同階段的形態，在相差和霍夫曼觀察模式下拍攝的圖像如圖6所示。
圖6
胚胎拍攝圖像
Figure6.
Images of embryos
從圖6可見，低倍的相差成像系統能從背景中識別出胚胎大致輪廓，但內部細節無法看清，而霍夫曼調制相襯成像系統所呈現的胚胎圖像具有更加明顯的浮雕立體效果，且能清晰地表征出胚胎的形態細節。
3 胚胎跟蹤和捕捉策略
培養裝置光學模塊的運動部件各自由度的執行器為步進電機，電機的運動控制模塊通過控制器局域網絡（controller area network，CAN）總線接口與上位機進行通訊，相機與上位機通過USB3.0進行通訊和數據傳輸，采用軟件觸發模式拍攝采集圖像，所有電機運動和相機拍攝動作由上位機進行時序調度和控制。
在胚胎長時程培養過程中，采用低倍搜尋、高倍觀察的在線監測方案，由光學模塊的多自由度機構配合對胚胎進行跟蹤和捕捉拍攝，基于圖像處理算法定位胚胎的空間位置。
胚胎在線跟蹤拍攝流程和原理詳見圖7，在所有機構零位狀態下開始，首先將觀察方式切換為4×相差模式，移動至要觀察的胚胎，采用低倍系統進行粗調拍攝，記錄得到多焦面圖像數據，然后基于多焦面圖像數據，通過圖像識別和定位處理算法，獲取胚胎在空間中的x、y和z的位置坐標，再由運動機構進行位置補償，將光學視場中心移動至目標胚胎中心處，最后切換至高倍霍夫曼觀察模式，對胚胎細節進行微調拍攝，記錄胚胎細胞不同層切面的圖像。
圖7
胚胎在線跟蹤拍攝流程和原理
Figure7.
Process and principle of embryo online tracking and capturing
上述在對某個胚胎進行在線跟蹤拍攝期間，該培養室的液路暫停工作，包括換液操作和動態液流剪切動作，以確保拍攝期間內胚胎在培養隔間內的位置是固定的。
胚胎長時程培養過程中通過自動跟蹤拍攝，實現在線監測的核心環節是胚胎的圖像處理算法，基于低倍大視場光學系統拍攝的多焦面圖像獲取胚胎準確的空間位置坐標，進而轉入高倍系統觀察胚胎的細節形態。
4 胚胎圖像處理與試驗
胚胎在低倍視場下拍攝的圖像隨著物鏡觀察焦面高度位置的切換，樣本會經歷模糊—清晰—模糊的過程，需通過圖像算法識別出胚胎最清晰的焦面圖像，進而確定其在培養隔間中的x、y、z坐標。
目前廣泛采用的清晰度識別方法基于圖像邊緣信息或圖像的灰度梯度信息，認為對焦清晰的圖像具有更尖銳的邊緣，故具有更大的梯度函數值，主要包括絕對方差函數、Roberts梯度和函數、梯度向量平方函數、Brenner函數、Laplacian函數、Tenengrad函數和Variance函數等[19-20]。這些算法都是對全局圖像進行清晰度評價，而胚胎在圖像中占據面積一般很小，且往往出現背景清晰、胚胎模糊或背景模糊、胚胎清晰的現象，對評價結果的貢獻量微弱，因此，無法直接基于清晰度識別來確定胚胎最為清晰的焦面。
為了實現胚胎低倍搜尋、高倍觀察的在線監測效果，本文提出了另一種胚胎識別定位思路，并開展了圖像算法的試驗研究。首先對低倍視場拍攝的多焦面圖像，進行去噪和灰度二值化預處理，然后基于輪廓查找和面積過濾算法，依此遍歷各個焦面圖像，確定出胚胎的質心坐標（x和y坐標），再以胚胎質心為中心對每張焦面圖像截取胚胎所在的圖像區域，最后對不同焦面截取的圖像進行清晰度評價，找出最清晰的焦面，從而確定胚胎的z坐標。定位出胚胎的具體位置，便可以通過運動機構對光學系統的位置進行修正補償，實現胚胎的對中和對焦，再切換至高倍模式觀察胚胎的細節。胚胎識別定位的詳細圖像處理算法流程如圖8所示。
圖8
胚胎識別定位算法流程圖
Figure8.
Flow chart of embryo identification and location algorithm
4.1 圖像預處理
由于實驗室操作環境的影響，制備胚胎時培養液內可能會混入雜質成分，并且隨著胚胎發育的不斷推進，胚胎周圍也會逐漸滋生許多顆粒細胞，因此為避免雜質的干擾對胚胎輪廓提取的影響，需對圖像進行去噪處理，保留重要的胚胎的輪廓信息，去除無用的雜質信息。
胚胎圖像預處理效果如圖9所示。圖像取灰度化后，首先進行濾波處理和二值化閾值分割，選取閾值時，以保留胚胎圖像部分的主要信息為準。濾波算法采用中值濾波，能消除和平滑圖像中較小的椒鹽噪聲，而且能有效保護圖像的邊緣信息，不對后續的輪廓提取造成影響[21]。
圖9
圖像預處理效果
Figure9.
Effect of image preprocessing
對二值化圖像通過膨脹及腐蝕算法進行處理能有效去除較大的雜質噪聲[22]，膨脹運算后可以將胚胎培養隔間內的長條紋和小顆粒雜質完全濾除，雖然胚胎圖像自身受膨脹運算也會出現收縮，但再進行腐蝕運算后，胚胎面積會恢復，同時原來離散的接近貼壁的干擾圖像能與柵罩的內壁進一步聯通，形成完整輪廓，為后續的輪廓提取和面積過濾做準備。
4.2 胚胎輪廓提取
預處理后的圖像通過resize()函數縮放為800 × 600的分辨率，以左上角為圖像的坐標原點，則視場中心的坐標為（400，300），圖像總面積為480 000。
通過調用OpenCV函數庫中的查找輪廓findContours()函數、輪廓面積contourArea()函數和圖像矩moments()函數，提取出封閉區域的輪廓，并計算其面積和質心坐標。
輪廓提取結果如表5所示，找到4處輪廓，其中編號2即為胚胎的輪廓，與其他輪廓有明顯的差別，經過簡單的面積和質心過濾可以將其他過小過大或培養隔間之外的輪廓排除，便能定位出胚胎的坐標（443，218），其與視場中心（400，300）作差，可求得坐標的補償量。
表5
輪廓提取結果
Table5.
Results of contour extraction
4.3 清晰度評價
以胚胎質心為中心，根據胚胎實際占據的面積，截取出不同焦平面圖像中胚胎所在的圖像區域，進行清晰度評價。本文選取了三種清晰度評價方法進行對比，分別是Tenengrad梯度方法、Laplacian梯度方法和方差方法。其中，Tenengrad梯度方法使用Sobel算子提取圖像水平和垂直方向的梯度值，其清晰度評價函數 Ten 定義為如下公式[23-24]：
 |
式中，
，其中 
和 
分別是Sobel算子沿x向和y向的卷積核，
和 
分別為圖像在點 
處的灰度值和灰度梯度值，
為圖像總像素數。
Laplacian梯度方法和Tenengrad梯度方法原理相似，只是Laplacian算子是一種二階導數算子，可以滿足不同方向圖像邊緣銳化的要求。
方差方法認為清晰聚焦的圖像有著比模糊圖像更大的灰度差異，可以將方差函數F作為清晰度評價函數[25]：
 |
式中，
為整幅圖像的平均灰度值，
為點 
處的灰度值，
為圖像總像素數。
表6列出三種不同方法得出的清晰度評分結果，值越大表示圖像越清晰，可以看出，不同評價方法的結論是一致的，均認為第3個焦面的胚胎最清晰，與肉眼判斷的結果吻合。
表6
清晰度評分結果
Table6.
Results of definition evaluation
識別出最清晰的一層焦面，便可以定位胚胎在空間內z方向的坐標，進而通過位置補償將光學系統移動至胚胎中心，切換至高倍觀察模式對胚胎進行拍攝，獲取胚胎清晰的形態圖像。
5 結論
本文為胚胎體外長時程培養設計了一種在線監測系統，配置了4 × 相差、10 × 和20 × 霍夫曼調制相襯光學系統。實驗證明，匹配的光學系統成像分辨率滿足設計要求，并達到高對比度的浮雕立體效果。胚胎的在線監測系統采用“低倍搜尋、高倍觀察”的跟蹤和捕捉策略，并基于圖像輪廓面積和清晰度評價對胚胎進行識別和定位，結果證明開發的圖像處理算法具有較好的準確性和通用性。
本文開發的胚胎長時程培養在線監測系統可以準確捕捉胚胎發育過程中的形態信息，重現胚胎發育的動態過程，評價胚胎發育的優劣，為胚胎體外長時程培養體系的優化和迭代提供依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
隨著2021年我國三胎政策的全面開放，預防和治療新生兒的出生缺陷已成為生殖生物學領域重要的科研方向。但目前，對人類胚胎正常發育的生理學過程，尚有很多未解之謎。所以，對人類胚胎發育過程的研究，不僅有助于人們對生命起源和胚胎發育的進一步了解，更為解決出生缺陷等重大生殖健康問題提供了理論基礎[1]。
國際倫理標準規定，人類胚胎的科學研究只能止步于受精后14天，而與出生缺陷相關的疾病，如無腦畸形、先天性心臟病等的發生，大多與以原腸運動為基礎的三胚層分化異常密切相關，發生在受精14天之后[2]。因此科研人員只能借助于模式動物，如小鼠和猴子，探索胚胎更長時期的發育機制。目前，中國科學院動物研究所的科研人員已成功實現食蟹猴胚胎在體外長時程培養至受精后20天，并在此基礎上研究了靈長類動物原腸運動的發生過程[3]。不過由于人員經驗、實驗技術和培養條件的限制，雖然在發育不同階段鑒定了胚胎特征，但無法追蹤到胚胎在整個發育過程中的動態變化，且胚胎體外培養不同批次之間穩定性和重復性差，發育至后期階段的比例非常有限。因此急需開發一種新型全自動的胚胎培養設備，能對溫濕度、氣體組分、培養液成分、液流剪切力等參數進行在線調控，以實現更長時程的胚胎培養。同時，為追蹤胚胎發育過程信息，培養設備需對胚胎發育全程進行在線監測，還原胚胎的形態變化，記錄胚胎發育的關鍵事件。
胚胎早期（囊胚之前）的體外培養系統，目前主要采用微滴或微穴培養方式，胚胎從受精卵開始發育，經歷原核期、卵裂期、桑椹胚和囊胚期，總體積變化不大，且胚胎處于靜置狀態，便于自動化顯微成像和在線監測，基于微穴培養的觀察方式已衍生多種臨床應用的培養箱產品，如time-lapse培養箱，胚胎在培養期間不受外界干擾，由內置的光學模塊對胚胎發育過程的形態進行延時拍攝，基于胚胎形態動力學參數評估其發育潛能，篩選出最優的胚胎[4-7]。然而，在體外長時程培養條件下，隨時間推移，胚胎的發育體積變化巨大，以小鼠為例，其妊娠期為20天，受精后4.5天達到囊胚期，胚體大小約為0.1 mm，而到12.5天時胚體增長至約4.2 mm，增長約40倍[8]。因此采用微滴或微穴培養方式和單一光學觀察方式顯然已無法滿足更長時程發育的培養和觀測需求。另外受在線換液和液流剪切動作影響，胚胎在培養液中的位置會隨液體流動在培養空間內改變，相應的光學系統成像視場中心和焦面位置也需要及時進行調整，極大地增加了在線自動觀察的難度。
本文針對胚胎體外長時程培養過程中的形態觀察需求，開發了一套在線培養監測裝置和配套培養器皿，為胚胎不同發育階段配置了不同放大倍數的光學觀察模塊，基于“低倍搜尋、高倍觀察”的策略，采用多維運動機構對胚胎進行自動跟蹤和捕捉，通過圖像處理算法識別和定位胚胎在空間中的位置，最終拍攝得到清晰的胚胎圖像。為了驗證系統的可行性，本文以小鼠為試驗對象，取小鼠受精后第3天的胚胎進行體外長時程培養，拍攝了胚胎從囊胚發育至原腸胚不同階段的形態，驗證了光學系統的成像質量；然后在裝置內開展了胚胎的在線培養監測試驗研究，將胚胎置于培養皿柵罩內的任意位置，系統按照設計的在線跟蹤策略和圖像處理算法對胚胎進行自動捕捉和成像，從而獲得胚胎清晰圖像。文中涉及的鼠胚動物試驗得到了中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所實驗動物倫理委員會的批準。
1 胚胎長時程培養裝置方案
胚胎長時程培養裝置作為體外生命孕育系統，用于模擬子宮內環境研究胚胎發育機制和不同因素對胚胎發育的影響，從而探索新型的胚胎體外培養體系。早期胚胎的體外培養和監測技術已較為成熟，而囊胚之后的培養目前只能依靠人工操作和經驗技術，缺乏自動化設備，因此，長時程培養裝置的開發目的，一方面研究優化培養參數，構建穩定的培養體系，做到高通量和高成活率培養，在此基礎上探索更長時程的培養，另一方面通過在線監測記錄胚胎發育的過程信息，動態評估胚胎發育優劣，為培養參數調控提供依據。
1.1 培養裝置組成
胚胎長時程培養裝置及配套培養器皿如圖1所示，其中培養裝置主要包括培養模塊、液路模塊、氣路模塊和光學模塊。培養模塊提供37 ℃恒溫培養環境，由多個培養室組成，每個培養室內部可放置一個培養器皿，液路模塊負責培養液的在線更換和液流剪切動作的實現，氣路模塊用于供應胚胎發育所必需的CO2混合氣，光學模塊負責培養期間對胚胎的在線監測。
圖1
胚胎長時程培養裝置及配套培養器皿
Figure1.
Long-term embryo culture device and matching culture utensils
胚胎培養器皿由柵罩和35 mm標準培養皿構成。柵罩貼于培養皿的底部，由兩個長片和八個隔片拼接形成4個正方形的培養隔間，每個隔間內放置一枚胚胎，在培養隔間四周的相應區域開設柵孔，孔隙為0.1 mm左右，能允許培養液內外自由交換，同時阻擋胚胎逸出。培養隔間截面尺寸為4.5 mm × 4.5 mm，滿足胚胎長時程培養的空間需求。培養隔間沿直線排列，與培養室排列方向一致，便于光學模塊運動掃描和觀察。
液路的進液針一分四對準每個培養隔間，換液時通過柵孔能將新鮮培養液灌注至培養隔間內，通過液路泵閥的控制可以實現進液針對培養液的吸吐動作，在培養隔間內部形成紊流，從而達到對胚胎的液流剪切效果。
1.2 在線監測方案
通過柵罩的空間約束，胚胎可以有效地約束在特定空間內，為光學觀察提供了便利，但是由于換液和液流剪切動作的影響，胚胎在培養液中的位置會隨液體流動在培養隔間內發生改變，極大地增加了在線自動觀察的難度。
針對上述問題，本文提出了低倍搜尋、高倍觀察的監測方案，如圖2所示，首先低倍觀察模式下，移動光學系統的視場中心至胚胎培養隔間的中央處，在低倍大視場物鏡下拍攝培養隔間的完整圖像，基于圖像算法識別出胚胎的輪廓，并定位胚胎的中心坐標，計算其相對視場中心的偏離量，然后通過運動機構對光學系統進行位置補償，將視場中心移動至胚胎中心處，再切換至高倍小視場物鏡拍攝胚胎的細節。
圖2
胚胎在線監測方案示意
Figure2.
Schematic diagram of online embryo monitoring
采用低倍搜尋、高倍觀察的監測方案，可以應對不同發育階段胚胎體積變化的情況，選用合適的光學系統進行觀察或拍攝。欲實現理想的監測效果，需解決以下幾個問題：
（1）光學系統匹配：為胚胎長時程培養匹配合適的光學系統，滿足觀察分辨率和立體感需求，記錄胚胎發育過程的形態細節。
（2）光機運動模塊設計：光學系統由低倍切換至高倍觀察涉及到多自由度的機械運動，通過誤差控制，既要保證光學成像分辨率，又要實現精確位置定位。
（3）胚胎在線跟蹤策略：基于培養裝置的系統控制架構，建立各個模塊或部件的配合時序關系，實現對胚胎的自動化在線跟蹤和拍攝。
（4）胚胎圖像處理算法：圖像處理算法用于識別胚胎輪廓并定位胚胎在培養隔間內的坐標，進而進行位置補償并切換至高倍觀察，是對胚胎進行跟蹤和捕捉以實現長時程在線監測的核心。
2 光機系統設計與驗證
胚胎細胞是透明的，在非熒光染色觀察時利用光的干涉原理，將通過樣品光線的相位差轉換為人眼可以分辨的振幅差（即明暗），使樣品便于觀察，廣泛運用的觀察方式有相差、霍夫曼調制相襯和微分干涉相襯觀察三種[9-12]。其中，相差系統簡單經濟，常用于活體細胞的鑒定和細胞計數，后兩者可以使細胞產生較強的三維立體效果，對比度更高，觀察更直觀，尤其適合顯微操作。
本文采用相差和霍夫曼調制相襯結合的方式對胚胎進行在線監測，低倍搜尋時采用相差成像，能分辨出胚胎的大致輪廓即可，高倍觀察時采用霍夫曼調制相襯成像，能呈現對比度更高的胚胎內部形態細節。
2.1 光學系統匹配
胚胎在線監測的光學系統方案如圖3所示，采用倒置顯微鏡結構，支持相差和霍夫曼調制相襯兩種觀察模式，照明光依次經過偏振片、光闌、聚光鏡、胚胎樣品、物鏡、筒鏡和合適的縮小鏡后，在相機靶面上成像，通過切換物鏡和相應的光闌，可以更改胚胎的觀察方式為相差或霍夫曼調制相襯。
圖3
光學系統方案
Figure3.
Optical system scheme
為適應胚胎發育不同階段的觀測需求，采用了3種不同放大倍數的物鏡，分別為4 ×、10 × 和20 × 物鏡，其中，4×為相差物鏡，用于大視場成像和胚胎搜尋，后兩者為霍夫曼調制相襯物鏡，用于小視場胚胎細節的觀察，光學系統元件選用奧林巴斯相關模塊，其中關鍵的元件和參數配置如表1所示。
表1
光學系統主要元件及參數
Table1.
Main components and parameters of optical system
不同光譜成分對胚胎的發育影響不同，藍紫光對胚胎發育損傷最大，綠光和紅光幾乎沒有損傷[13-14]。本文胚胎培養裝置的照明光選用對胚胎發育影響最小的紅光，波長為635 nm，單色光可有效降低光學系統的色差影響。
根據光學元件相關參數可以由下式計算得到系統的光學分辨率[15]：
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式中，R為光學分辨率，λ為入射光波長，NA為物鏡的數值孔徑。
為了讓被物鏡分辨清楚的圖像細節也被相機分辨清楚，相機理想像元尺寸需滿足奈奎斯特采樣定律[16]，由如下公式計算：
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式中，l為相機理想像元尺寸，R為光學分辨率，M為光學系統的綜合放大倍率。
此外，在4×相差視場觀察下，相機靶面要求能覆蓋完整的單個培養隔間（4.5 mm × 4.5 mm）。
因此，光學系統的參數匹配要求如表2所示，最終選用相機為度申科技USB3.0大靶面相機，型號U3P2 100-H，分辨率5 480 × 3 648，像元大小3.45 μm，靶面尺寸18.9 mm × 12.6 mm。
表2
光學系統參數匹配表
Table2.
Parameter matching of optical system
2.2 光機運動模塊設計
胚胎在線監測的光學系統采用倒置顯微鏡結構方案，如圖4所示，所有光學元件安裝在立柱上，呈C型結構，培養模塊位于聚光鏡和物鏡模塊之間，其中光闌和物鏡均沿直線排布，可以通過相應的x向直線運動機構實現光闌和物鏡的切換，使兩者搭配進行觀察。物鏡模塊搭載在調焦機構上，可沿z向作升降運動，調節物鏡成像焦平面的高度，從而對樣品不同層切面成像。
圖4
光機運動模塊實物圖
Figure4.
Picture of optomechanical motion module
另外，采用低倍搜尋、高倍觀察的監測方案，需根據胚胎偏離光學系統視場中心的坐標值對光學系統x和y方向的位置進行補償，分別由平臺x機構和平臺y機構執行相應的動作，同時通過平臺x機構可以將光學系統切換至不同培養室內的培養隔間進行觀察。
所有直線運動單元采用步進電機+絲桿傳動的方式，為保證機構的定位精度，步進電機配置了編碼器，避免運動過程中的丟步現象，絲桿螺母通過消隙處理避免空回誤差。
為保證光學系統的成像質量，立柱上了設置了x和y向定位基準，用以對安裝在立柱上的光學元件的離軸誤差進行控制，光學系統的綜合離軸誤差合成公式如下[17-18]：
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式中為系統綜合離軸誤差，和為x和y向的離軸誤差分量，其中以為例，計算公式如下：
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式中為第i個光學元件中心至x基準面的距離誤差，主要由零件的尺寸加工誤差引入，考慮到各光學元件的誤差傳遞方式相同，裝配尺寸相近，可以按等作用誤差原則進行分配，計算公式如下：
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控制光學系統的綜合離軸誤差為0.05 mm，由于光闌和物鏡x向是可移動的，通過運動機構精度保證，各光學元件中心至基準的誤差分配結果詳見表3，據此對相關結構件的尺寸誤差進行約束。
表3
光學系統誤差分配表（mm）
Table3.
Error distribution of optical system (mm)
2.3 系統裝調與試驗
為保證成像質量，達到設計分辨率要求和高對比度效果，光學系統裝調最關鍵的環節便是滿足相差光路環形光闌與物鏡內置相位板的共軛關系，以及霍夫曼調制相襯光路矩形光闌與物鏡內置調制板的共軛的關系，其裝調示意圖如圖5所示。
圖5
光學系統裝調示意
Figure5.
Installation and adjustment of optical system
在相差觀察視場內，照明光通過環形光闌呈現為明亮的圓環，而物鏡后焦面內置相位板為灰暗的圓環，兩者互相匹配，大小一致，需要通過x和y兩個方向的平移，保證兩者重合。
霍夫曼物鏡后焦面內置調制板分為三個區域，依次是D區（透光率1%）、G區（透光率15%）和B區（透光率100%）。矩形光闌分兩個區域，一是透射區（T區），另一個是亮度隨偏振器而改變的偏振區（P區）。在霍夫曼觀察視場內，調節x、y方向的平移和繞軸旋轉，使矩形光闌的T區進入物鏡調制板的G區，光闌的P區進入物鏡調制板的B區。通過旋轉位于光闌上部的偏振片的角度，可以改變圖像對比度。
本研究對光學系統的成像質量進行了驗證。利用Edmund USAF 1951分辨率測試目標板（空間頻率最高645 lp/mm）對光學分辨率進行測試。取分辨率板成像圖案中剛能分辨的某一單元線條，查找對應的空間頻率的數值，由下式計算系統的光學分辨率。
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式中，R為光學分辨率（單位：μm），f為空間頻率（單位：lp/mm）。
最終系統的光學分辨率測試結果如表4所示，考慮到光學系統不可避免存在像差，測量值與理論值接近，認為三種模式均達到了光學設計要求。
表4
光學分辨率測試結果
Table4.
Results of optical resolution test
2.4 胚胎成像試驗
分辨率是表征光學成像系統解析物體細節的能力，而胚胎作為透明體，光線經過樣品后產生的相位差轉換成圖像對比度的變化，所呈現出的直觀立體效果可以通過實際胚胎成像進行觀察和評價。胚胎從囊胚發育至原腸胚不同階段的形態，在相差和霍夫曼觀察模式下拍攝的圖像如圖6所示。
圖6
胚胎拍攝圖像
Figure6.
Images of embryos
從圖6可見，低倍的相差成像系統能從背景中識別出胚胎大致輪廓，但內部細節無法看清，而霍夫曼調制相襯成像系統所呈現的胚胎圖像具有更加明顯的浮雕立體效果，且能清晰地表征出胚胎的形態細節。
3 胚胎跟蹤和捕捉策略
培養裝置光學模塊的運動部件各自由度的執行器為步進電機，電機的運動控制模塊通過控制器局域網絡（controller area network，CAN）總線接口與上位機進行通訊，相機與上位機通過USB3.0進行通訊和數據傳輸，采用軟件觸發模式拍攝采集圖像，所有電機運動和相機拍攝動作由上位機進行時序調度和控制。
在胚胎長時程培養過程中，采用低倍搜尋、高倍觀察的在線監測方案，由光學模塊的多自由度機構配合對胚胎進行跟蹤和捕捉拍攝，基于圖像處理算法定位胚胎的空間位置。
胚胎在線跟蹤拍攝流程和原理詳見圖7，在所有機構零位狀態下開始，首先將觀察方式切換為4×相差模式，移動至要觀察的胚胎，采用低倍系統進行粗調拍攝，記錄得到多焦面圖像數據，然后基于多焦面圖像數據，通過圖像識別和定位處理算法，獲取胚胎在空間中的x、y和z的位置坐標，再由運動機構進行位置補償，將光學視場中心移動至目標胚胎中心處，最后切換至高倍霍夫曼觀察模式，對胚胎細節進行微調拍攝，記錄胚胎細胞不同層切面的圖像。
圖7
胚胎在線跟蹤拍攝流程和原理
Figure7.
Process and principle of embryo online tracking and capturing
上述在對某個胚胎進行在線跟蹤拍攝期間，該培養室的液路暫停工作，包括換液操作和動態液流剪切動作，以確保拍攝期間內胚胎在培養隔間內的位置是固定的。
胚胎長時程培養過程中通過自動跟蹤拍攝，實現在線監測的核心環節是胚胎的圖像處理算法，基于低倍大視場光學系統拍攝的多焦面圖像獲取胚胎準確的空間位置坐標，進而轉入高倍系統觀察胚胎的細節形態。
4 胚胎圖像處理與試驗
胚胎在低倍視場下拍攝的圖像隨著物鏡觀察焦面高度位置的切換，樣本會經歷模糊—清晰—模糊的過程，需通過圖像算法識別出胚胎最清晰的焦面圖像，進而確定其在培養隔間中的x、y、z坐標。
目前廣泛采用的清晰度識別方法基于圖像邊緣信息或圖像的灰度梯度信息，認為對焦清晰的圖像具有更尖銳的邊緣，故具有更大的梯度函數值，主要包括絕對方差函數、Roberts梯度和函數、梯度向量平方函數、Brenner函數、Laplacian函數、Tenengrad函數和Variance函數等[19-20]。這些算法都是對全局圖像進行清晰度評價，而胚胎在圖像中占據面積一般很小，且往往出現背景清晰、胚胎模糊或背景模糊、胚胎清晰的現象，對評價結果的貢獻量微弱，因此，無法直接基于清晰度識別來確定胚胎最為清晰的焦面。
為了實現胚胎低倍搜尋、高倍觀察的在線監測效果，本文提出了另一種胚胎識別定位思路，并開展了圖像算法的試驗研究。首先對低倍視場拍攝的多焦面圖像，進行去噪和灰度二值化預處理，然后基于輪廓查找和面積過濾算法，依此遍歷各個焦面圖像，確定出胚胎的質心坐標（x和y坐標），再以胚胎質心為中心對每張焦面圖像截取胚胎所在的圖像區域，最后對不同焦面截取的圖像進行清晰度評價，找出最清晰的焦面，從而確定胚胎的z坐標。定位出胚胎的具體位置，便可以通過運動機構對光學系統的位置進行修正補償，實現胚胎的對中和對焦，再切換至高倍模式觀察胚胎的細節。胚胎識別定位的詳細圖像處理算法流程如圖8所示。
圖8
胚胎識別定位算法流程圖
Figure8.
Flow chart of embryo identification and location algorithm
4.1 圖像預處理
由于實驗室操作環境的影響，制備胚胎時培養液內可能會混入雜質成分，并且隨著胚胎發育的不斷推進，胚胎周圍也會逐漸滋生許多顆粒細胞，因此為避免雜質的干擾對胚胎輪廓提取的影響，需對圖像進行去噪處理，保留重要的胚胎的輪廓信息，去除無用的雜質信息。
胚胎圖像預處理效果如圖9所示。圖像取灰度化后，首先進行濾波處理和二值化閾值分割，選取閾值時，以保留胚胎圖像部分的主要信息為準。濾波算法采用中值濾波，能消除和平滑圖像中較小的椒鹽噪聲，而且能有效保護圖像的邊緣信息，不對后續的輪廓提取造成影響[21]。
圖9
圖像預處理效果
Figure9.
Effect of image preprocessing
對二值化圖像通過膨脹及腐蝕算法進行處理能有效去除較大的雜質噪聲[22]，膨脹運算后可以將胚胎培養隔間內的長條紋和小顆粒雜質完全濾除，雖然胚胎圖像自身受膨脹運算也會出現收縮，但再進行腐蝕運算后，胚胎面積會恢復，同時原來離散的接近貼壁的干擾圖像能與柵罩的內壁進一步聯通，形成完整輪廓，為后續的輪廓提取和面積過濾做準備。
4.2 胚胎輪廓提取
預處理后的圖像通過resize()函數縮放為800 × 600的分辨率，以左上角為圖像的坐標原點，則視場中心的坐標為（400，300），圖像總面積為480 000。
通過調用OpenCV函數庫中的查找輪廓findContours()函數、輪廓面積contourArea()函數和圖像矩moments()函數，提取出封閉區域的輪廓，并計算其面積和質心坐標。
輪廓提取結果如表5所示，找到4處輪廓，其中編號2即為胚胎的輪廓，與其他輪廓有明顯的差別，經過簡單的面積和質心過濾可以將其他過小過大或培養隔間之外的輪廓排除，便能定位出胚胎的坐標（443，218），其與視場中心（400，300）作差，可求得坐標的補償量。
表5
輪廓提取結果
Table5.
Results of contour extraction
4.3 清晰度評價
以胚胎質心為中心，根據胚胎實際占據的面積，截取出不同焦平面圖像中胚胎所在的圖像區域，進行清晰度評價。本文選取了三種清晰度評價方法進行對比，分別是Tenengrad梯度方法、Laplacian梯度方法和方差方法。其中，Tenengrad梯度方法使用Sobel算子提取圖像水平和垂直方向的梯度值，其清晰度評價函數 Ten 定義為如下公式[23-24]：
|
式中，，其中 和 分別是Sobel算子沿x向和y向的卷積核， 和 分別為圖像在點 處的灰度值和灰度梯度值， 為圖像總像素數。
Laplacian梯度方法和Tenengrad梯度方法原理相似，只是Laplacian算子是一種二階導數算子，可以滿足不同方向圖像邊緣銳化的要求。
方差方法認為清晰聚焦的圖像有著比模糊圖像更大的灰度差異，可以將方差函數F作為清晰度評價函數[25]：
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式中， 為整幅圖像的平均灰度值， 為點 處的灰度值， 為圖像總像素數。
表6列出三種不同方法得出的清晰度評分結果，值越大表示圖像越清晰，可以看出，不同評價方法的結論是一致的，均認為第3個焦面的胚胎最清晰，與肉眼判斷的結果吻合。
表6
清晰度評分結果
Table6.
Results of definition evaluation
識別出最清晰的一層焦面，便可以定位胚胎在空間內z方向的坐標，進而通過位置補償將光學系統移動至胚胎中心，切換至高倍觀察模式對胚胎進行拍攝，獲取胚胎清晰的形態圖像。
5 結論
本文為胚胎體外長時程培養設計了一種在線監測系統，配置了4 × 相差、10 × 和20 × 霍夫曼調制相襯光學系統。實驗證明，匹配的光學系統成像分辨率滿足設計要求，并達到高對比度的浮雕立體效果。胚胎的在線監測系統采用“低倍搜尋、高倍觀察”的跟蹤和捕捉策略，并基于圖像輪廓面積和清晰度評價對胚胎進行識別和定位，結果證明開發的圖像處理算法具有較好的準確性和通用性。
本文開發的胚胎長時程培養在線監測系統可以準確捕捉胚胎發育過程中的形態信息，重現胚胎發育的動態過程，評價胚胎發育的優劣，為胚胎體外長時程培養體系的優化和迭代提供依據。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
