針對泌尿系疾病導致的組織器官損傷和缺失，目前臨床上的治療方法存在局限性。組織工程通過對細胞、生物支架和生物相關分子的研究，提供了一種可替代或再生受損組織器官的治療手段。三維（3D）生物打印技術作為新興制造技術，能對載有細胞的生物材料精確控制，進一步推動著組織工程領域的發展。本文綜述了3D生物打印技術在腎臟、輸尿管、膀胱、尿道組織工程中的研究進展和應用，并討論了目前面臨的主要挑戰和未來展望。
引用本文： 符舟洋, 肖樹偉, 符偉軍. 三維生物打印技術在泌尿系組織工程中的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(3): 639-644. doi: 10.7507/1001-5515.202107061 復制
引言
臨床上許多泌尿系疾病，如惡性腫瘤、外傷、先天性畸形和退行性疾病所導致的泌尿系組織器官的損傷，常用自體組織進行修復，但手術難度大、自體組織取材范圍有限以及術后并發癥的發生，大大降低了手術成功率和患者術后的生存質量。尤其是針對終末期器官衰竭患者，全球范圍內器官短缺的現狀無法滿足每個患者器官移植的需求。于是，科研人員通過組織工程研究給患者提供了一種新的替代治療方法。
近年來，組織工程得到迅速發展，但仍存在重建組織器官生物學功能有限、血管化網絡建立不完善等問題。三維（three-dimensional，3D）生物打印技術作為一種新興的制造技術，已經廣泛運用于皮膚科、骨科、口腔科等組織工程領域[1-3]。該技術的發展也給泌尿系統組織工程帶來了新的希望。本文就3D生物打印技術在泌尿系組織工程的最新進展進行綜述，討論了需要解決的主要挑戰，并對未來的發展進行了展望。
1 3D生物打印技術
3D生物打印技術是基于計算機電子模型，將細胞、生物材料和生長因子逐層融合或沉積，精確打印出模仿天然組織或器官結構解剖功能的支架結構。相較于最初的手工構建，它能更加精確地制造出和原生組織器官的空間分布和結構一致的復雜結構，有利于實現組織器官的功能化，并且具有可重復性，在未來有大規模生產的潛能。
3D生物打印技術的研究和發展包含三個方面：① 生物打印策略；② 3D構圖；③ 生物墨水。其中生物打印策略和生物墨水是實現組織器官再生的關鍵。常見的打印方式包括擠出式打印、噴墨式打印和光基礎打印[4-6]。
擠出式打印是通過施加氣動或機械壓力于打印頭沉積生物墨水完成支架構建，是目前組織工程領域運用最為廣泛的打印技術，其最大的優勢在于可沉積高黏度和高細胞濃度的材料，即可選用的打印生物材料范圍廣泛。但由于擠出時產生的壓力和剪切應力，此項打印技術很難兼顧生物打印速度、打印分辨率和細胞存活率這三方面的問題[7]。科研人員嘗試進行了技術上的優化，如Serex等[8]開發了基于微流體的打印頭，能夠實時調節細胞濃度，完成高細胞濃度下的生物打印。懸浮打印技術是基于擠出打印的一項前沿技術。Lee等[9]利用自由形式可逆嵌入懸浮水凝膠（freeform reversible embedding of suspended hydrogels，FRESH）技術，即用懸浮水凝膠作為打印支撐體介質，高精度地打印出了工程化人類心臟。此項技術打印出的結構因有支撐介質的存在不易坍塌，并且在實現全方向打印的基礎上大幅提升了打印速度，為軟材料或者低黏度流體的打印提供了新的平臺。
噴墨式打印是將生物墨水以水滴形式通過噴嘴溢出打印，具有成本低、速度快等優點。但它無法打印高黏度（打印黏度限制在3.5～12 mPa·s）和高細胞濃度的材料，這就導致打印出來的支架機械強度不夠，細胞密度低。
常見的光基礎打印包括激光輔助打印（laser-assisted bioprinting，LAB）和立體光刻（stereolithography，SLA）。其中LAB是通過激光撞擊區域產生的高壓氣體誘導生物墨水進入打印床上構建支架，其最大的優點就是不需要打印機頭，這樣就可避免因壓力和剪切應力對細胞活力和功能造成影響，所以細胞存活率極高。相較于噴墨式打印，LAB能打印更高黏性的生物墨水（1～300 mPa·s）。但商業化打印設備的缺乏、成本高是此項技術有待解決的問題。Grigoryan等[10]利用SLA技術構建了復雜血管化網絡，使用可光聚合水凝膠完成血管內和多血管設計并打印出了可通氣氧合的類肺結構。
上述三種技術各有其獨特優勢和局限性，在不同的應用場景如何正確運用這些技術取決于不同的生物墨水的制備[7]。理想的生物墨水必須滿足以下特點：① 可打印性；② 生物相容性；③ 生物可降解性；④ 良好的機械強度。常用的生物墨水一般包含有天然衍生聚合物，如膠原蛋白、明膠、殼聚糖等[11-12]，以及合成聚合物，如聚己內酯（poly(ε-caprolactone)，PCL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚（乳酸-共己內酯）（poly(lactide-co-caprolactone)，PLCL）等。科研人員常將多種材料復合出新型生物墨水為細胞附著繁殖、組織發育、宿主整合和血管化提供框架。除了以上提到的常見生物墨水材料外，脫細胞基質生物墨水由于含有大量有利于細胞生長和分化的因子，也廣受科研人員關注，并開始在尿道、膀胱和腎臟組織工程中開展應用[13-15]。
2 3D生物打印技術在泌尿系組織工程中的研究
2.1 在腎臟組織工程中的研究
腎臟作為一個高度復雜的實質器官，有著獨特的發育過程和微觀的空間構造，由30多種不同類型的高度分化的細胞組成。想要實現新腎臟的構建是一件十分困難的事情，需要將特定細胞類型、微管結構、血管化和生物材料進行整合來改善腎臟細胞的分離、擴增和分化，最終形成仿生腎臟。
有研究證實，人類多功能干細胞包含多種譜系，能模擬人類腎臟的生成，并且此種細胞向腎臟類器官樣細胞的定向分化是穩健的、可再生的，可以在干細胞系之間轉移[16-17]。所以，腎臟類器官的研究是十分有前景的。3D生物打印最開始用于生產制造腎近端小管，Homan等[18]采用3D生物打印技術打印出的小管結構完全嵌入細胞外基質中，并最終在微流體芯片上形成了可灌注的腎近端小管結構。然而，該方法存在著體外模型應用的局限性。Singh等[19]在此基礎上改進了生物墨水的策略，將去細胞腎臟外基質與海藻酸鈉混合出新的生物墨水，并運用3D同軸打印技術制造了可灌注的腎近端小管和血管結構，觀察到腎近端管狀上皮細胞和人臍靜脈內皮細胞成熟表達。另一項研究研發了全細胞的近端腎小管體外模型，包括腎成纖維細胞、內皮細胞和腎近端小管上皮細胞[20]。3D生物打印技術完成了特定結構的設計，并增強了細胞間的直接接觸，使間質細胞的結構性作用得到發揮。但大多數類器官都在靜態環境培養，存在著類器官無血管且細胞發育不成熟的問題。3D打印微流控芯片在體外形成了流動培養類器官的環境，最終構建了腎臟類器官可灌注內腔血管網絡[21]。在后續研究中，Lin等[22]創建了更優化的3D血管化的近端小管模型，該模型由鄰近的導管組成，導管內襯近端小管上皮和血管內皮細胞，嵌入可滲透的細胞外基質中，并獨立使用閉環灌注系統來研究腎臟的再吸收。
隨著技術的進步，Lawlor等[23]基于擠出工藝的3D生物打印技術研制了具有快速和高通量優點的腎臟類器官，此款類器官具備組成腎臟結構和功能的基本單位。研究人員還利用它評估了氨基糖苷的相對毒性，證實此款類器官用于藥物檢測的優越性。基于擠出工藝的3D生物打印技術能通過調控精確生物物理性能（類器官大小、細胞數量和顯微結構構象）顯著提高每個起始細胞的腎單位產量，產生均勻分化的功能性的腎臟組織結構。
2.2 在輸尿管組織工程中的研究
輸尿管屬于中空管狀器官，長25～30 cm，直徑3~ 4 mm，由四層組織結構組成：① 尿路上皮層（即尿路上皮細胞）；② 固有層：由疏松結締組織、血管、靜脈及淋巴管組成；③ 肌肉層：內縱肌層和外圓肌層兩層（輸尿管下1/3段有第3層肌肉層）；④ 外膜層：包含有血管、淋巴管。
一個理想的再生輸尿管需要滿足以下條件[24]：① 保證不泄漏，并且能抵抗有毒環境（即與尿液的接觸）；② 能再生功能性尿路上皮和平滑肌層，使其能承受流體剪切應力和徑向壓力（最大應力在1～10 MPa，破裂壓力在500～550 mm Hg）；③ 能恢復重建段的蠕動波（彈性模量在1～10 MPa，抗拉強度在4～9 MPa）；④ 實現平滑肌細胞層的血管化和神經再生。
由于輸尿管損傷一般需要立即處理，該領域內大多數研究圍繞現成移植物制備展開，如羊膜、頰黏膜、膀胱黏膜下層基質等[25]。盡管科研人員做了許多研究，但實驗中仍有纖維化、梗阻和腎積水等不良結局的發生，并且存在高免疫原性、力學性能不足等問題[26]。為了解決以上問題，一些天然材料和合成高分子材料被制作或改良出來，De Jonge等[27]開發了增強的管狀膠原-Viciryl支架，顯示出尿路上皮再生、平滑肌向內生長和新血管形成。該團隊[28]還通過將管狀膠原-Viciryl支架預植入羊模型，得出支架預植入這一方法能很好地預防纖維化和炎癥的結論。具有良好機械強度和可調生物降解性的絲素蛋白材料也被證實適用于輸尿管支架的構建[29]。
Versteegden等[30]運用星形芯棒原位固定、3D打印技術、化學交聯技術等制備了一種具有徑向彈性的管狀膠原支架。此研究解決了管狀膠原支架缺乏放射狀可逆擴張能力的問題，拓寬了構建符合動態運動的中空組織器官的道路。
總的來說，輸尿管的再生因受到臨床需求、大型動物模型需求和植入手術難度的限制，此領域發展相對緩慢。未來輸尿管組織工程可通過3D生物打印技術，將載有細胞和生長因子的材料在不同的空間分布上精確打印，從形狀結構的模擬進階到生理功能的模擬。
2.3 在膀胱組織工程中的研究
膀胱是腹膜外的中空非管狀器官，膀胱壁由四層組成：① 尿路上皮層：是多層的特化上皮，包括基底細胞、中間細胞和傘狀細胞；② 固有層：由纖維狀或束狀膠原和彈性蛋白纖維網絡組成，是含有神經和血管的結締組織層；③ 肌層：逼尿肌層由內、中、外三層組成，內層和外層的肌肉細胞主要是縱向的，而中間層的細胞為周向，給予膀胱結構支持，促進膀胱充盈和排空的生理功能；④ 漿膜層：覆蓋在外表面。
基于生物工程膀胱擴大和重建的研究日益增多，但大多是圍繞膀胱支架補片的構建展開[31]。Xiao等[14]采用雙層絲素蛋白支架和包裹有脂肪源性干細胞的膀胱脫細胞基質水凝膠構建出膀胱支架補片，用于大鼠膀胱擴大術模型。結果顯示該支架材料能促進膀胱壁和生理功能恢復。但對于更大膀胱補片或者完整膀胱的構建仍需進一步探索，筆者認為FRESH技術的出現可用于懸垂的中空非管狀器官的構建[9]。
另外，文獻中也提及相較于二維結構，3D支架結構顯示出明顯優勢。Imamura等[32]運用3D生物打印技術在微針陣列上插入由骨髓來源細胞組成的球體，最終構成自組織結構，然后植入輻射損傷膀胱的大鼠模型中進行體內實驗，觀察到移植的自組織結構存活下來。這種采用微球進行組裝的構建體加強了細胞間的相互作用和氧氣營養物質的擴散，并且具有更高的生物相容性。Bouhout等[33]用膠原蛋白作為生物材料構建了簡易的球形膀胱模型，包埋在支架內的膀胱間充質細胞和種植在支架表面的尿路上皮細胞因受到與天然組織相似的張力，顯示出高度成熟的尿路上皮組織，并且表達肌球蛋白的平滑肌細胞呈現出平行于管腔表面重新排列的趨勢。隨著3D生物打印技術快速發展，其特有的優勢在膀胱的修復再生領域擁有著巨大的潛力。
2.4 在尿道組織工程中的研究
人類男性尿道長18～23 cm，女性尿道長2.5～5 cm，主要由三種細胞組成，包括尿路上皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞。其生理結構上與輸尿管相似，同樣分為四層：① 黏膜層；② 黏膜下層；③ 肌層：內縱肌層和外圓肌層；④ 外膜層：結締組織。相似的組織結構使其在重建方法上與輸尿管具有一定的可參照性。已有許多研究人員從支架材料、種子細胞、生長因子等方面進行了探索[34]。
3D生物打印技術在尿道組織工程的首次可行性嘗試是Zhang等[35]在體外利用PCL/PLCL聚合物打印出螺旋式結構模擬兔的天然尿道，并將含有膀胱平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）、尿路上皮細胞（urethral epithelial cells，UCs）的纖維蛋白水凝膠印刷在螺旋結構兩側，給細胞提供良好的生長微環境。結果顯示制造的仿生尿道擁有與兔尿道相似的力學性能，并且在打印后7天膀胱平滑肌細胞和尿路上皮細胞仍保持超過80%的高活力。之后，科研人員開發了更多優化生物墨水策略。例如，張楷樂等[36]在海藻酸鈉水凝膠基礎上使用纖維蛋白原水凝膠3D生物打印出尿道補片；Findrik Balogová等[37]嘗試將PLA和聚β-羥基丁酸兩種材料共混擠壓打印出用作尿道置換的管狀替代物，并探討了印刷所選工藝和印刷參數對打印過程的影響。這些生物墨水的開發，是為了更好地模擬尿道支架的物理特性，即具有一定的彈性和柔韌性來協調完成排尿功能，但關于人類尿道組織學、組成結構和力學性質的數據仍甚少。Cunnane等[38]通過收集9名男性患者的前尿道樣本，首次表征了人類男性前尿道的基本力學特性，討論了其與組織和大體形態之間的聯系，結果顯示尿道組織具有黏彈性力學特性，沒有方向性或區域性的差異，且與彈性蛋白和膠原蛋白含量有關（膠原蛋白∶彈性蛋白 ≈ 0.3∶1）。這一研究極大地填補了尿道組織工程在仿生學上的空缺，對于之后重建尿道具有重要的指導性意義。
在3D生物打印技術策略層面，為更好地打印出尿道多層環狀生理結構，Pi等[39]研發出一種多通道同軸擠壓系統（multichannel coaxial extrusion system，MCCES），運用3D生物打印技術打印出多層管狀支架，該系統的獨特之處在于它能夠在單個步驟中制備出多層可灌注的中空套管，并且在不需要改變打印噴嘴的情況下，可以連續改變形狀和尺寸。隨后，科研人員使用該系統將人尿路上皮細胞和人膀胱平滑肌細胞封裝在定制的生物墨水中打印出了雙層仿生尿路上皮組織結構（內層：尿路上皮層；外層：平滑肌層）。MCCES技術能構建具有灌注培養能力的多尺寸流道，在尿道組織工程領域具有廣闊的應用前景。
尿道組織工程研究者也在嘗試突破材料支架對傳統組織工程的限制，例如一種無固體支架、無噴嘴和無標記的快速生物制造技術已被研發出來[40]。它是采用磁聲懸浮生物組裝的原理，即強磁場和聲場的組合能夠在介質中的低順磁性試劑（釓鹽）濃度下從組織球體快速懸浮構建生物組織。目前已實現由人膀胱平滑肌細胞肌球構建3D尿道組織。另外，海綿體作為包繞尿道的海綿狀組織，為尿道提供機械和血管支持，海綿體異常的患者同樣也需要修復重建。Oh等[41]結合3D生物打印技術在陰莖海綿體組織工程領域進行了初步探索。該研究將人主動脈平滑肌細胞（human aortic smooth muscle cells，haSMCs）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）植入到擠出打印的PCL陰莖海綿體支架上共培養，實驗結果顯示PCL支架所具有的高度規則的孔隙結構為人主動脈平滑肌細胞和人臍靜脈內皮細胞的附著、增殖和分化提供了良好的環境，這種高精確度且可重復的制造技術為海綿體再生提供了新的發展視角。
3 面臨的主要挑戰
3.1 3D生物打印策略問題
生物打印速度慢這一問題在很大程度上阻礙了臨床應用，集成多種材料的SLA技術有可能實現速度的提升[42]。相對于原生組織器官而言，生物打印組織器官的分辨率較低這一問題也阻礙了3D生物打印的發展，筆者認為可以對四維生物打印策略進行深入研究探索，有望完全模擬出高復雜性且功能性強的仿生組織器官[43]。
3.2 力學性能問題
對于泌尿系組織工程來說，構建出與天然組織器官具有相似生物力學性能的仿生支架尤為重要[44]。筆者認為應從仿生學的角度出發，通過體外實驗和體內實驗對原生組織進行標準化測試分析，如尿動力學實驗、離體單軸或多軸機械實驗等，來指導再生支架的構建。結合3D生物打印技術，需要對生物墨水進行優化來模擬天然組織，最常用作生物墨水的水凝膠材料可以通過添加納米黏土、纖維素納米纖維或是構建雙網絡水凝膠等方式來提升生物墨水的力學性能[45]。
3.3 血管化網絡問題
血管不僅能運輸氧氣和營養物質，還能清除代謝產物。血管化網絡的快速形成關乎支架的存活，也進一步影響到重建組織器官結構和功能的恢復。研究人員曾嘗試采取大網膜包裹孵育移植物[14]、加入外源性血管生長因子、缺氧預處理[46]等方法來促進支架血管化，這些研究都起到了積極影響。但是大型移植物的血液供應仍是一大挑戰。筆者認為3D生物打印技術可以通過計算機建模，預留出相互交通的血管微通道網絡，并整合上述研究方法構建出發展成熟和灌注良好的血管網絡[47]。
3.4 神經化網絡問題
人體的儲尿和排尿需要通過肌壁的收縮舒張來完成。如何實現器官的高順應性，取決于平滑肌和神經纖維網絡的再生和協同調控。筆者認為3D生物打印技術可加入像碳納米管、還原氧化石墨烯等導電材料賦予生物墨水導電性，聯合神經細胞、平滑肌細胞一同打印，構建出理想的神經化網絡促進成熟平滑肌層的再生，進一步實現功能的恢復[48-49]。
4 討論與展望
3D生物打印技術能精確控制組織構建物的空間分布和結構，有望在實現結構再現的基礎上制造出功能化的組織器官。不同的生物墨水、打印方法和打印設備都影響著移植替代物的制備[50]。目前，大多數3D生物打印策略還存在以下問題：① 如何提升打印的分辨率、精度和速度，并提高細胞存活率；② 如何加強打印支架的力學性能；③ 如何構建血管化網絡；④ 如何構建神經化網絡。未來還需在生物墨水和打印技術上深入研究，并確定適配于不同組織器官的印刷工藝和參數，給打印制造過程提供一個穩定的條件，做到過程的標準化，以保證可重復且安全地應用于臨床。
總的來說，3D生物打印技術在組織工程領域是一項很有前景的技術，在泌尿外科組織工程中的應用尚處于初步探索階段，加強跨學科跨專業之間的合作成為必然趨勢，只有將生物工程學、材料科學、生物學、醫學等學科相結合，才能完善對細胞選擇、細胞功能優化、材料研發、再生過程及相關機制等的理解，最終解決存在的技術挑戰，生產出受損組織器官的全功能替代品，以提高患者的生存和生活質量。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：符舟洋為綜述主要撰寫人，完成相關文獻資料的收集和分析及論文初稿的寫作；肖樹偉負責文獻調研及寫作指導；符偉軍為論文的負責人及主要審核人。
引言
臨床上許多泌尿系疾病，如惡性腫瘤、外傷、先天性畸形和退行性疾病所導致的泌尿系組織器官的損傷，常用自體組織進行修復，但手術難度大、自體組織取材范圍有限以及術后并發癥的發生，大大降低了手術成功率和患者術后的生存質量。尤其是針對終末期器官衰竭患者，全球范圍內器官短缺的現狀無法滿足每個患者器官移植的需求。于是，科研人員通過組織工程研究給患者提供了一種新的替代治療方法。
近年來，組織工程得到迅速發展，但仍存在重建組織器官生物學功能有限、血管化網絡建立不完善等問題。三維（three-dimensional，3D）生物打印技術作為一種新興的制造技術，已經廣泛運用于皮膚科、骨科、口腔科等組織工程領域[1-3]。該技術的發展也給泌尿系統組織工程帶來了新的希望。本文就3D生物打印技術在泌尿系組織工程的最新進展進行綜述，討論了需要解決的主要挑戰，并對未來的發展進行了展望。
1 3D生物打印技術
3D生物打印技術是基于計算機電子模型，將細胞、生物材料和生長因子逐層融合或沉積，精確打印出模仿天然組織或器官結構解剖功能的支架結構。相較于最初的手工構建，它能更加精確地制造出和原生組織器官的空間分布和結構一致的復雜結構，有利于實現組織器官的功能化，并且具有可重復性，在未來有大規模生產的潛能。
3D生物打印技術的研究和發展包含三個方面：① 生物打印策略；② 3D構圖；③ 生物墨水。其中生物打印策略和生物墨水是實現組織器官再生的關鍵。常見的打印方式包括擠出式打印、噴墨式打印和光基礎打印[4-6]。
擠出式打印是通過施加氣動或機械壓力于打印頭沉積生物墨水完成支架構建，是目前組織工程領域運用最為廣泛的打印技術，其最大的優勢在于可沉積高黏度和高細胞濃度的材料，即可選用的打印生物材料范圍廣泛。但由于擠出時產生的壓力和剪切應力，此項打印技術很難兼顧生物打印速度、打印分辨率和細胞存活率這三方面的問題[7]。科研人員嘗試進行了技術上的優化，如Serex等[8]開發了基于微流體的打印頭，能夠實時調節細胞濃度，完成高細胞濃度下的生物打印。懸浮打印技術是基于擠出打印的一項前沿技術。Lee等[9]利用自由形式可逆嵌入懸浮水凝膠（freeform reversible embedding of suspended hydrogels，FRESH）技術，即用懸浮水凝膠作為打印支撐體介質，高精度地打印出了工程化人類心臟。此項技術打印出的結構因有支撐介質的存在不易坍塌，并且在實現全方向打印的基礎上大幅提升了打印速度，為軟材料或者低黏度流體的打印提供了新的平臺。
噴墨式打印是將生物墨水以水滴形式通過噴嘴溢出打印，具有成本低、速度快等優點。但它無法打印高黏度（打印黏度限制在3.5～12 mPa·s）和高細胞濃度的材料，這就導致打印出來的支架機械強度不夠，細胞密度低。
常見的光基礎打印包括激光輔助打印（laser-assisted bioprinting，LAB）和立體光刻（stereolithography，SLA）。其中LAB是通過激光撞擊區域產生的高壓氣體誘導生物墨水進入打印床上構建支架，其最大的優點就是不需要打印機頭，這樣就可避免因壓力和剪切應力對細胞活力和功能造成影響，所以細胞存活率極高。相較于噴墨式打印，LAB能打印更高黏性的生物墨水（1～300 mPa·s）。但商業化打印設備的缺乏、成本高是此項技術有待解決的問題。Grigoryan等[10]利用SLA技術構建了復雜血管化網絡，使用可光聚合水凝膠完成血管內和多血管設計并打印出了可通氣氧合的類肺結構。
上述三種技術各有其獨特優勢和局限性，在不同的應用場景如何正確運用這些技術取決于不同的生物墨水的制備[7]。理想的生物墨水必須滿足以下特點：① 可打印性；② 生物相容性；③ 生物可降解性；④ 良好的機械強度。常用的生物墨水一般包含有天然衍生聚合物，如膠原蛋白、明膠、殼聚糖等[11-12]，以及合成聚合物，如聚己內酯（poly(ε-caprolactone)，PCL）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚（乳酸-共己內酯）（poly(lactide-co-caprolactone)，PLCL）等。科研人員常將多種材料復合出新型生物墨水為細胞附著繁殖、組織發育、宿主整合和血管化提供框架。除了以上提到的常見生物墨水材料外，脫細胞基質生物墨水由于含有大量有利于細胞生長和分化的因子，也廣受科研人員關注，并開始在尿道、膀胱和腎臟組織工程中開展應用[13-15]。
2 3D生物打印技術在泌尿系組織工程中的研究
2.1 在腎臟組織工程中的研究
腎臟作為一個高度復雜的實質器官，有著獨特的發育過程和微觀的空間構造，由30多種不同類型的高度分化的細胞組成。想要實現新腎臟的構建是一件十分困難的事情，需要將特定細胞類型、微管結構、血管化和生物材料進行整合來改善腎臟細胞的分離、擴增和分化，最終形成仿生腎臟。
有研究證實，人類多功能干細胞包含多種譜系，能模擬人類腎臟的生成，并且此種細胞向腎臟類器官樣細胞的定向分化是穩健的、可再生的，可以在干細胞系之間轉移[16-17]。所以，腎臟類器官的研究是十分有前景的。3D生物打印最開始用于生產制造腎近端小管，Homan等[18]采用3D生物打印技術打印出的小管結構完全嵌入細胞外基質中，并最終在微流體芯片上形成了可灌注的腎近端小管結構。然而，該方法存在著體外模型應用的局限性。Singh等[19]在此基礎上改進了生物墨水的策略，將去細胞腎臟外基質與海藻酸鈉混合出新的生物墨水，并運用3D同軸打印技術制造了可灌注的腎近端小管和血管結構，觀察到腎近端管狀上皮細胞和人臍靜脈內皮細胞成熟表達。另一項研究研發了全細胞的近端腎小管體外模型，包括腎成纖維細胞、內皮細胞和腎近端小管上皮細胞[20]。3D生物打印技術完成了特定結構的設計，并增強了細胞間的直接接觸，使間質細胞的結構性作用得到發揮。但大多數類器官都在靜態環境培養，存在著類器官無血管且細胞發育不成熟的問題。3D打印微流控芯片在體外形成了流動培養類器官的環境，最終構建了腎臟類器官可灌注內腔血管網絡[21]。在后續研究中，Lin等[22]創建了更優化的3D血管化的近端小管模型，該模型由鄰近的導管組成，導管內襯近端小管上皮和血管內皮細胞，嵌入可滲透的細胞外基質中，并獨立使用閉環灌注系統來研究腎臟的再吸收。
隨著技術的進步，Lawlor等[23]基于擠出工藝的3D生物打印技術研制了具有快速和高通量優點的腎臟類器官，此款類器官具備組成腎臟結構和功能的基本單位。研究人員還利用它評估了氨基糖苷的相對毒性，證實此款類器官用于藥物檢測的優越性。基于擠出工藝的3D生物打印技術能通過調控精確生物物理性能（類器官大小、細胞數量和顯微結構構象）顯著提高每個起始細胞的腎單位產量，產生均勻分化的功能性的腎臟組織結構。
2.2 在輸尿管組織工程中的研究
輸尿管屬于中空管狀器官，長25～30 cm，直徑3~ 4 mm，由四層組織結構組成：① 尿路上皮層（即尿路上皮細胞）；② 固有層：由疏松結締組織、血管、靜脈及淋巴管組成；③ 肌肉層：內縱肌層和外圓肌層兩層（輸尿管下1/3段有第3層肌肉層）；④ 外膜層：包含有血管、淋巴管。
一個理想的再生輸尿管需要滿足以下條件[24]：① 保證不泄漏，并且能抵抗有毒環境（即與尿液的接觸）；② 能再生功能性尿路上皮和平滑肌層，使其能承受流體剪切應力和徑向壓力（最大應力在1～10 MPa，破裂壓力在500～550 mm Hg）；③ 能恢復重建段的蠕動波（彈性模量在1～10 MPa，抗拉強度在4～9 MPa）；④ 實現平滑肌細胞層的血管化和神經再生。
由于輸尿管損傷一般需要立即處理，該領域內大多數研究圍繞現成移植物制備展開，如羊膜、頰黏膜、膀胱黏膜下層基質等[25]。盡管科研人員做了許多研究，但實驗中仍有纖維化、梗阻和腎積水等不良結局的發生，并且存在高免疫原性、力學性能不足等問題[26]。為了解決以上問題，一些天然材料和合成高分子材料被制作或改良出來，De Jonge等[27]開發了增強的管狀膠原-Viciryl支架，顯示出尿路上皮再生、平滑肌向內生長和新血管形成。該團隊[28]還通過將管狀膠原-Viciryl支架預植入羊模型，得出支架預植入這一方法能很好地預防纖維化和炎癥的結論。具有良好機械強度和可調生物降解性的絲素蛋白材料也被證實適用于輸尿管支架的構建[29]。
Versteegden等[30]運用星形芯棒原位固定、3D打印技術、化學交聯技術等制備了一種具有徑向彈性的管狀膠原支架。此研究解決了管狀膠原支架缺乏放射狀可逆擴張能力的問題，拓寬了構建符合動態運動的中空組織器官的道路。
總的來說，輸尿管的再生因受到臨床需求、大型動物模型需求和植入手術難度的限制，此領域發展相對緩慢。未來輸尿管組織工程可通過3D生物打印技術，將載有細胞和生長因子的材料在不同的空間分布上精確打印，從形狀結構的模擬進階到生理功能的模擬。
2.3 在膀胱組織工程中的研究
膀胱是腹膜外的中空非管狀器官，膀胱壁由四層組成：① 尿路上皮層：是多層的特化上皮，包括基底細胞、中間細胞和傘狀細胞；② 固有層：由纖維狀或束狀膠原和彈性蛋白纖維網絡組成，是含有神經和血管的結締組織層；③ 肌層：逼尿肌層由內、中、外三層組成，內層和外層的肌肉細胞主要是縱向的，而中間層的細胞為周向，給予膀胱結構支持，促進膀胱充盈和排空的生理功能；④ 漿膜層：覆蓋在外表面。
基于生物工程膀胱擴大和重建的研究日益增多，但大多是圍繞膀胱支架補片的構建展開[31]。Xiao等[14]采用雙層絲素蛋白支架和包裹有脂肪源性干細胞的膀胱脫細胞基質水凝膠構建出膀胱支架補片，用于大鼠膀胱擴大術模型。結果顯示該支架材料能促進膀胱壁和生理功能恢復。但對于更大膀胱補片或者完整膀胱的構建仍需進一步探索，筆者認為FRESH技術的出現可用于懸垂的中空非管狀器官的構建[9]。
另外，文獻中也提及相較于二維結構，3D支架結構顯示出明顯優勢。Imamura等[32]運用3D生物打印技術在微針陣列上插入由骨髓來源細胞組成的球體，最終構成自組織結構，然后植入輻射損傷膀胱的大鼠模型中進行體內實驗，觀察到移植的自組織結構存活下來。這種采用微球進行組裝的構建體加強了細胞間的相互作用和氧氣營養物質的擴散，并且具有更高的生物相容性。Bouhout等[33]用膠原蛋白作為生物材料構建了簡易的球形膀胱模型，包埋在支架內的膀胱間充質細胞和種植在支架表面的尿路上皮細胞因受到與天然組織相似的張力，顯示出高度成熟的尿路上皮組織，并且表達肌球蛋白的平滑肌細胞呈現出平行于管腔表面重新排列的趨勢。隨著3D生物打印技術快速發展，其特有的優勢在膀胱的修復再生領域擁有著巨大的潛力。
2.4 在尿道組織工程中的研究
人類男性尿道長18～23 cm，女性尿道長2.5～5 cm，主要由三種細胞組成，包括尿路上皮細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞。其生理結構上與輸尿管相似，同樣分為四層：① 黏膜層；② 黏膜下層；③ 肌層：內縱肌層和外圓肌層；④ 外膜層：結締組織。相似的組織結構使其在重建方法上與輸尿管具有一定的可參照性。已有許多研究人員從支架材料、種子細胞、生長因子等方面進行了探索[34]。
3D生物打印技術在尿道組織工程的首次可行性嘗試是Zhang等[35]在體外利用PCL/PLCL聚合物打印出螺旋式結構模擬兔的天然尿道，并將含有膀胱平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）、尿路上皮細胞（urethral epithelial cells，UCs）的纖維蛋白水凝膠印刷在螺旋結構兩側，給細胞提供良好的生長微環境。結果顯示制造的仿生尿道擁有與兔尿道相似的力學性能，并且在打印后7天膀胱平滑肌細胞和尿路上皮細胞仍保持超過80%的高活力。之后，科研人員開發了更多優化生物墨水策略。例如，張楷樂等[36]在海藻酸鈉水凝膠基礎上使用纖維蛋白原水凝膠3D生物打印出尿道補片；Findrik Balogová等[37]嘗試將PLA和聚β-羥基丁酸兩種材料共混擠壓打印出用作尿道置換的管狀替代物，并探討了印刷所選工藝和印刷參數對打印過程的影響。這些生物墨水的開發，是為了更好地模擬尿道支架的物理特性，即具有一定的彈性和柔韌性來協調完成排尿功能，但關于人類尿道組織學、組成結構和力學性質的數據仍甚少。Cunnane等[38]通過收集9名男性患者的前尿道樣本，首次表征了人類男性前尿道的基本力學特性，討論了其與組織和大體形態之間的聯系，結果顯示尿道組織具有黏彈性力學特性，沒有方向性或區域性的差異，且與彈性蛋白和膠原蛋白含量有關（膠原蛋白∶彈性蛋白 ≈ 0.3∶1）。這一研究極大地填補了尿道組織工程在仿生學上的空缺，對于之后重建尿道具有重要的指導性意義。
在3D生物打印技術策略層面，為更好地打印出尿道多層環狀生理結構，Pi等[39]研發出一種多通道同軸擠壓系統（multichannel coaxial extrusion system，MCCES），運用3D生物打印技術打印出多層管狀支架，該系統的獨特之處在于它能夠在單個步驟中制備出多層可灌注的中空套管，并且在不需要改變打印噴嘴的情況下，可以連續改變形狀和尺寸。隨后，科研人員使用該系統將人尿路上皮細胞和人膀胱平滑肌細胞封裝在定制的生物墨水中打印出了雙層仿生尿路上皮組織結構（內層：尿路上皮層；外層：平滑肌層）。MCCES技術能構建具有灌注培養能力的多尺寸流道，在尿道組織工程領域具有廣闊的應用前景。
尿道組織工程研究者也在嘗試突破材料支架對傳統組織工程的限制，例如一種無固體支架、無噴嘴和無標記的快速生物制造技術已被研發出來[40]。它是采用磁聲懸浮生物組裝的原理，即強磁場和聲場的組合能夠在介質中的低順磁性試劑（釓鹽）濃度下從組織球體快速懸浮構建生物組織。目前已實現由人膀胱平滑肌細胞肌球構建3D尿道組織。另外，海綿體作為包繞尿道的海綿狀組織，為尿道提供機械和血管支持，海綿體異常的患者同樣也需要修復重建。Oh等[41]結合3D生物打印技術在陰莖海綿體組織工程領域進行了初步探索。該研究將人主動脈平滑肌細胞（human aortic smooth muscle cells，haSMCs）和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）植入到擠出打印的PCL陰莖海綿體支架上共培養，實驗結果顯示PCL支架所具有的高度規則的孔隙結構為人主動脈平滑肌細胞和人臍靜脈內皮細胞的附著、增殖和分化提供了良好的環境，這種高精確度且可重復的制造技術為海綿體再生提供了新的發展視角。
3 面臨的主要挑戰
3.1 3D生物打印策略問題
生物打印速度慢這一問題在很大程度上阻礙了臨床應用，集成多種材料的SLA技術有可能實現速度的提升[42]。相對于原生組織器官而言，生物打印組織器官的分辨率較低這一問題也阻礙了3D生物打印的發展，筆者認為可以對四維生物打印策略進行深入研究探索，有望完全模擬出高復雜性且功能性強的仿生組織器官[43]。
3.2 力學性能問題
對于泌尿系組織工程來說，構建出與天然組織器官具有相似生物力學性能的仿生支架尤為重要[44]。筆者認為應從仿生學的角度出發，通過體外實驗和體內實驗對原生組織進行標準化測試分析，如尿動力學實驗、離體單軸或多軸機械實驗等，來指導再生支架的構建。結合3D生物打印技術，需要對生物墨水進行優化來模擬天然組織，最常用作生物墨水的水凝膠材料可以通過添加納米黏土、纖維素納米纖維或是構建雙網絡水凝膠等方式來提升生物墨水的力學性能[45]。
3.3 血管化網絡問題
血管不僅能運輸氧氣和營養物質，還能清除代謝產物。血管化網絡的快速形成關乎支架的存活，也進一步影響到重建組織器官結構和功能的恢復。研究人員曾嘗試采取大網膜包裹孵育移植物[14]、加入外源性血管生長因子、缺氧預處理[46]等方法來促進支架血管化，這些研究都起到了積極影響。但是大型移植物的血液供應仍是一大挑戰。筆者認為3D生物打印技術可以通過計算機建模，預留出相互交通的血管微通道網絡，并整合上述研究方法構建出發展成熟和灌注良好的血管網絡[47]。
3.4 神經化網絡問題
人體的儲尿和排尿需要通過肌壁的收縮舒張來完成。如何實現器官的高順應性，取決于平滑肌和神經纖維網絡的再生和協同調控。筆者認為3D生物打印技術可加入像碳納米管、還原氧化石墨烯等導電材料賦予生物墨水導電性，聯合神經細胞、平滑肌細胞一同打印，構建出理想的神經化網絡促進成熟平滑肌層的再生，進一步實現功能的恢復[48-49]。
4 討論與展望
3D生物打印技術能精確控制組織構建物的空間分布和結構，有望在實現結構再現的基礎上制造出功能化的組織器官。不同的生物墨水、打印方法和打印設備都影響著移植替代物的制備[50]。目前，大多數3D生物打印策略還存在以下問題：① 如何提升打印的分辨率、精度和速度，并提高細胞存活率；② 如何加強打印支架的力學性能；③ 如何構建血管化網絡；④ 如何構建神經化網絡。未來還需在生物墨水和打印技術上深入研究，并確定適配于不同組織器官的印刷工藝和參數，給打印制造過程提供一個穩定的條件，做到過程的標準化，以保證可重復且安全地應用于臨床。
總的來說，3D生物打印技術在組織工程領域是一項很有前景的技術，在泌尿外科組織工程中的應用尚處于初步探索階段，加強跨學科跨專業之間的合作成為必然趨勢，只有將生物工程學、材料科學、生物學、醫學等學科相結合，才能完善對細胞選擇、細胞功能優化、材料研發、再生過程及相關機制等的理解，最終解決存在的技術挑戰，生產出受損組織器官的全功能替代品，以提高患者的生存和生活質量。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：符舟洋為綜述主要撰寫人，完成相關文獻資料的收集和分析及論文初稿的寫作；肖樹偉負責文獻調研及寫作指導；符偉軍為論文的負責人及主要審核人。