三維（3D）細胞培養模型是將具有3D結構的載體與不同類型的細胞在體外共培養，以模擬體內微環境的系統。這種新型細胞培養模型經證明與體內的自然系統接近，在細胞附著、遷移、有絲分裂和凋亡等過程產生不同于單層細胞培養的生物學反應，因此可作為評價活性物質動態藥理作用和癌細胞轉移過程的理想模型。本文對比分析了二維（2D）和3D模型培養下細胞生長發育的不同特點，介紹了3D細胞培養模型的建立方法，重點總結了3D細胞培養技術在腫瘤模型和腸道吸收模型中的應用進展，并揭示了3D細胞培養模型在活性物質評估和篩選中的應用前景。通過本文綜述，期望可為新型3D細胞培養模型的開發和應用提供參考。
引用本文： 盧曉琴, 劉曉鳳, 鐘浩, 張維, 余淑珍, 關榮發. 三維細胞培養技術及其應用進展. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(3): 602-608. doi: 10.7507/1001-5515.202204062 復制
0 引言
細胞體外培養模型和動物體內實驗常常用于研究各類疾病的發生和發展。細胞體外培養是指將來自動物或人體的細胞培養于適宜的環境下，使細胞能夠正常生長、繁殖并維持一定結構和功能[1]。傳統動物體內實驗是一種主要依靠神經行為學觀察和組織病理學檢查的方法，與細胞體外培養模型相比存在明顯的局限性，主要表現為：實驗周期長、成本高以及實驗結果主觀性較強，不能從毒性作用機制方面解析活性物質的神經性毒性，并且活性物質在動物體內發揮作用的機制與其在人體中的作用機制存在較大差異，不能完全反映活性物質的實際代謝情況[2]。細胞體外培養實驗在一定程度上彌補了動物實驗的不足，特別是在細胞分子機制相關方面的研究，但是隨著細胞培養模型研究的不斷深入，研究人員發現二維（two-dimensional，2D）細胞培養模型存在細胞存活率低、細胞形態容易受損、細胞缺乏良好的組織結構等缺點。因此，為了彌補2D細胞培養模型的不足，研究人員設計開發了第三維度的細胞培養方法[3]。
三維（three-dimensional，3D）細胞培養模型的研究結果與臨床試驗結果接近，特別是在抗腫瘤藥物的篩選方面。將3D細胞培養模型與高通量藥物篩選相結合，可以更高效地得到具有參考價值的臨床候選藥物。隨著科學技術的進步以及創新藥物和功能食品研究的不斷深入，人們開始對可以調節人體機能的天然活性物質的生理生化作用有了進一步的認識[4]。目前，單純依靠藥物來輔助治療疾病還存在一定的風險，所以越來越多的研究人員開始著手從天然物質中尋找有效的功能因子。大量研究表明，黃酮類、萜類、多糖類、皂苷類等天然活性因子具有預防和治療疾病的作用[5]，而對于活性因子的毒理學及功能性評價急需開發一種高效的體外評價模型。本文對比分析了2D和3D細胞培養模型的優缺點，簡要概述了3D細胞培養模型的構建方法，并對3D模型的應用進行了總結和探討。通過本文綜述，期望可為生物活性因子的毒理學和功能性評價新模型的開發提供理論依據。
1 體外細胞培養
正常細胞從分裂、增殖、遷移到凋亡的過程，在本質上依賴于空間和時間組織原則，存在著細胞和細胞、細胞和基質間的相互關系。因此，細胞體外培養需要模擬細胞在體內生長的微環境，提供滿足細胞正常生長的條件。體外細胞培養技術自創立以來，在生物學及醫學領域快速發展和應用，已經成為各個領域進行科學研究的重要手段。目前細胞體外培養常見的模型分為2D細胞培養模型和3D細胞培養模型。
1.1 2D細胞培養模型
2D細胞培養模型是指在特定培養條件下，使細胞在培養皿或者培養瓶中生長，讓細胞在外基質環境中處于2D平面生長的狀態。用于2D體外細胞培養模型的細胞株多種多樣，如人結腸癌細胞Caco-2、人肝癌細胞HepG2、小鼠腹水瘤細胞S180、人造血系腫瘤細胞U937等，根據這些細胞株生長的方式，可分為貼壁細胞和懸浮細胞，其中絕大多數體外培養的細胞以貼壁的形式進行生長。由于動物體內實驗常常受到倫理等問題的限制，使得細胞培養實驗逐漸在生物活性驗證、藥物篩選、毒理學評價等研究中逐漸占據主導地位[6]。目前2D細胞培養技術已經取得了巨大的進步，利用細胞在體外建立抗癌[7]、抗炎[8]等模型，可以有效地評估生物活性物質的生理生化功能。Jiang等[9]在體外成功培養了人角膜內皮細胞（human corneal endothelial cells，HCEnC），并構建了一種評價紫外線（ultraviolet，UV）對細胞HCEnC損傷愈合的體外細胞培養模型，研究結果表明細胞的愈合效果與UV的劑量相關，當使用抗壞血酸-2-磷酸酯這種抗氧化劑時可以顯著減少細胞內的自由基，從而改善UV對細胞HCEnC造成的損傷。Khalifa等[10]建立脂肪化的人肝癌細胞HepG2模型，證明多肽激素艾塞那肽（Exendin-4）可以通過Wnt/β-catenin信號通路直接激活胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide-1 receptors，GLP-1R），進而下調肝型脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein，FABP1）和叉頭盒蛋白A1（forkhead-box A1，FOXA1）的表達，減少脂肪酸攝取和轉運，從而改善了油酸誘導的人肝癌細胞HepG2中脂質的沉積。除了通過調節某種信號通路之外，也可以敲除特定基因來直接治療某種疾病。比如，基于DNA聚合酶（DNA polymerase theta，DNA-POLQ）在肝癌中的表達，通過體外培養人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞，利用慢病毒感染DNA-POLQ構建HCC細胞培養模型。有研究報道，通過敲除DNA-POLQ，并與相應陰性對照對比分析，以了解HCC細胞功能喪失的情況，并利用該體外細胞培養模型揭示DNA-POLQ可能參與了HCC的發展，以此來證明敲除DNA-POLQ可能是治療HCC有效的方法之一[11]。另一項研究指出，對于基因治療系統這種新手段，可以直接通過肽轉運蛋白來敲除人誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem，iPS），進而將細胞分化為腸上皮樣細胞，以此建立更精確的腸道藥物吸收模型[12]。雖然構建2D細胞培養模型的技術越來越成熟，但是在某些研究中，利用2D細胞培養模型所得出的實驗結果與動物體內實驗的結果仍存在較大的差異，產生這些差異的主要原因可能是細胞之間在一定程度上失去了組織聯系及相互作用，即細胞在體外培養條件下的生長情況與體內的生長情況存在一定差異，從而使得2D細胞培養模型不能完全滿足研究的需要。因此，急需構建一種能夠準確模擬體內細胞生長的方法，從而滿足細胞體外相關研究的需求。
1.2 3D細胞培養模型
3D細胞培養模型是近年來開發的一種新型細胞體外培養技術，它的培養方法是將細胞、細胞生長因子、再造基質蛋白以及適合的骨架混合在一個體系中進行共同培養，其目的是使細胞的生長環境更接近生物體內的狀態，有效模擬細胞在人體內的微環境，從而進行相關疾病的研究。將2D細胞培養模型和3D細胞培養模型進行對比，其各自的優點及局限性如表1所示。
表1
2D細胞培養模型和3D細胞培養模型的優點及局限性
Table1.
The advantages and limitations of 2D and 3D cell culture models
在3D細胞培養模型中，細胞對內源性和外源性刺激（如溫度、pH、營養吸收、轉運和分化等）的應答更接近于它們在體內的狀態，能夠更加準確地模擬細胞在正常和病態下的生理生化狀態。Paniushkina等[13]基于瓊脂糖插片的3D細胞培養模型和2D細胞培養模型評估了細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的產生、分離和表征。與2D細胞培養模型相比，3D細胞培養模型允許在無血清條件下長期培養不同來源的細胞，且可以輕松恢復EV，從而使實驗結果更加準確。作為體外2D細胞培養和細胞體內天然生長環境的橋梁，3D細胞培養模型具有不可比擬的優勢，主要表現為3D細胞培養下既能模擬細胞體內生存的微環境又可以直觀檢測細胞生長狀態。當采用共培養的方式培養細胞時，還可以依據實驗目的的不同進行相應的調整。例如，研究上皮結構的生成可以將膠原蛋白層與嵌入式的人腸纖維細胞共培養，一起構建3D人結腸癌細胞Caco-2模型[14]，這種先進的腸道模型可以更好地再現體內腸道微環境及其生理特征。
2 3D細胞培養模型的建立方法
正常情況下，細胞的分裂、增殖和調亡過程都是在體內微環境中進行，2D細胞培養模型僅僅是將該過程轉移到體外，通過添加支持細胞生長的載體如聚苯乙烯和玻璃，使細胞在其表面進行生長，但這些基質并不能使細胞進行精確復制，而且阻礙了細胞之間、細胞和基質間的信號傳遞[3]。另外，許多2D細胞培養實驗中沒有充分考慮到不同類型細胞之間的相互作用，絕大多數的培養為單一類型細胞的培養。為了彌補2D細胞培養模型中的不足，創造一種盡可能接近原生組織的生長環境，研究人員將細胞引入到具有生物相容性的支架中，并充分考慮支架的選材、細胞來源和實際的培養方法等重要參數，構建了滿足不同研究需求的3D細胞培養模型。目前，3D細胞培養的模型主要包括無支架的3D細胞培養模型和有支架的3D細胞培養模型。
2.1 無支架的3D細胞培養模型的建立
無支架的3D細胞培養模型又稱為3D多細胞聚集球體模型（3D multi cell aggregation sphere model，3D MCTSs）。如圖1所示，3D MCTSs通常是由細胞單獨培養或者共培養技術來構建的模型，主要的方式包括使用超低附著培養板或采用懸掛滴培養、旋轉培養和凹板法[15-16]，以及采用近年來出現的微流芯片技術等。目前，這些無支架的3D細胞培養建模方法已經得到廣泛應用。例如：張增利[17]采用無支架的3D細胞培養模型中最常用的超低附著培養板法，即利用附著板中半球結構的低黏附力促進細胞自聚成球體，成功建立癌癥患者來源的3D腫瘤細胞培養系統。通過這種方法構建的3D腫瘤細胞培養模型可以隨時觀察細胞生長狀態。此外，還利用此技術在體外構建了非小細胞肺癌原代細胞球模型，用于藥物的篩查。研究結果表明，這種無支架的3D細胞培養模型可以提供可靠的藥物篩查數據，是一種高效的藥物高通量篩選的方法。?tampar等[18]利用懸滴培養法構建了一種3D人肝癌細胞HepG2培養模型，構建方法主要是通過在培養基中添加了4%甲基纖維素來開發球狀體，通過對此3D細胞培養模型進行表征發現，與傳統的2D細胞培養相比，此模型中細胞的形態更接近體內組織和器官中細胞的狀態，且此模型可用于評估化學物質的遺傳毒性作用。但是懸滴法在實際操作中比較復雜，相比之下，凹面細胞培養法會相對簡單，此方法只需要在細胞培養器中放入適合的多凹面細胞培養板，利用凹面光滑的末端槽就可以獲得大量的細胞球體。隨著體外培養技術的不斷發展，研究人員開始將細胞培養與微重力結合，這種細胞培養方法同樣也不需要支架，只需要通過旋轉細胞培養系統（rotary cell culture system，RCCS）來模擬微重力，構建流程為：先在體外培養目標細胞，再將細胞植入建立的模擬微重力儀器中，然后通過微重力回轉器與地面平行旋轉，使細胞在該系統中呈自由落體狀態生長[19]。為了使細胞表型和生物學特性更加準確，Miller等[20]開發了3D微流控細胞陳列芯片技術，該技術能夠真實重構腫瘤細胞中的3D微環境和微血管內皮細胞。此外，該模型不僅能夠更好地預測特定腫瘤患者對抗腫瘤藥物的敏感性，而且還能為患者找到更好的治療方案。與常規2D模型培養的腫瘤細胞相比，在3D細胞培養模型中球體細胞和相對封閉的球內細胞均可以充分接觸培養基，這有利于維持細胞的表型，因此可以提供相對準確的觀測性結果。
圖1
2D和3D細胞培養模型示意圖
Figure1.
Schematic representing the 2D and 3D cell culture models
2.2 有支架的3D細胞培養模型建立
有支架的3D細胞培養模型是將目標細胞、細胞生長因子、再造基質蛋白以及支架混合后共同培養。因為細胞之間存在高度異質性，在不同細胞以及細胞微環境之間具有復雜的相互作用，與無支架的3D細胞培養模型相比，有支架的3D細胞培養模型更有利于細胞之間、細胞與基質間和組織間信號的傳遞[21]。在有支架的3D細胞培養條件下，要使細胞更“接近體內”狀態就必須要考慮培養過程中所用支架的選擇，不同種類的細胞需要選擇其合適的支架。其中，瓊脂糖、膠原蛋白、纖維連接蛋白、明膠、層粘連蛋白、玻璃體粘連蛋白等都是常用的支架材料。這些材料通過孔隙度、纖維性、滲透性和力學穩定性來模擬細胞外基質，進而增強黏附細胞的生長和相互作用，促進細胞之間的相互交流和信號的傳遞[22]。在一些以水凝膠為支架的3D細胞培養模型中，因支架材料中含有大量可溶性生長因子而使細胞具有較高的生物活性，從而有利于細胞的生長和分化。Liu等[23]利用生物可降解、熱敏性強及可注射的羧甲基甲殼素水凝膠為支架，使細胞在此培養系統中可以持續增殖，從而形成具有較高細胞活性的3D多細胞球體。Saleh等[24]使用瓊脂糖凝膠通過液體覆蓋技術制備了3D球體模型，成功構建了黑色素瘤B16F10、巨噬細胞J774和小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3三種細胞系的3D細胞培養系統，并基于此模型研究了黑色素瘤B16F10的微環境以及新藥物的抗癌作用。Turtoi等[25]建立了一種基于透明質酸（hyaluronic acid，HA）的人肝癌細胞HepG2培養模型，通過把人肝癌細胞HepG2植入透明質酸/聚甲基乙烯基醚-ALT-馬來酸酐（hyaluronic acid/polymethylvinyl ether ALT maleic anhydride，HA3P50）支架中來構建3D細胞培養模型，結果表明此方法建立的人肝癌細胞HepG2培養模型可以通過控制肝細胞特異性生物標志物（白蛋白、尿素、膽汁酸、轉氨酶）的釋放和細胞色素P450（CYP）7A1酶的合成，增殖成更大的細胞聚集體，表現出類似于體內肝臟的功能。Zhang等[26]分別構建了共培養和單細胞培養兩種細胞培養模型，通過把懸浮的小鼠胚胎細胞NIH/3T3轉移至12孔細胞侵襲實驗培養板（Transwell）后添加膠原凝膠使其表面膠化，然后對腸上皮、纖維細胞網絡和細胞外基質進行改進，并在上層接種人結腸癌細胞Caco-2，讓細胞生長在3D空間中，以此構建3D Caco-2/3T3共培養模型；同時建立了只含有人結腸癌細胞Caco-2的單細胞培養模型。利用這兩種細胞培養模型研究藥物的滲透性和藥物的吸收率，研究結果表明共培養模型可以作為研究藥物吸收轉運的理想模型。
3 3D細胞培養模型的應用
體外細胞培養模型與動物體內模型相比，成本更低，更容易控制，且可以克服倫理問題的限制，所以越來越多的研究選擇體外細胞培養模型進行相關的功能驗證和活性評價。2D細胞培養模型固有的缺陷限制了其應用，3D細胞培養模型與2D細胞培養模型相比，靈活性好以及更能適應實驗的變化，逐漸成為研究各類疾病發生機制、藥物高通量篩選、活性物質的功能驗證等領域的理想模型。
3.1 3D腫瘤細胞培養模型的應用
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命和健康，近半個世紀以來，世界各國均投入了大量人力、物力從事惡性腫瘤的研究，由于2D細胞培養模型無法準確地模擬癌細胞在體內的狀態，所以開發體外3D腫瘤細胞培養模型逐漸成為了研究的熱點。3D腫瘤細胞培養模型中細胞的極性和基因表達與機體內腫瘤細胞非常接近，因此3D腫瘤細胞培養模型逐漸成為抗癌藥物高通量篩選的理想模型，在評估藥物的治療效果方面發揮了至關重要的作用。此外，3D腫瘤細胞培養模型的構建對于治療性DNA疫苗、單克隆抗體的體外實驗等相關的研究也具有重要意義。近年來3D腫瘤細胞培養模型發展迅速，不僅僅在建模上采用新技術，而且能夠針對疾病的特殊性，應用在個性化治療和免疫治療等方面，為開發個性化的抗腫瘤治療提供了新思路。Betriu等[27]利用3D自組裝肽支架培養了胰腺導管腺癌細胞（pancreatic ductal adenocarcinoma cells，PDAC），建立了厄洛替尼治療表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）內化和降解的新模型，并與2D PDAC培養模型對比，結果顯示3D細胞培養模型更加準確模擬了體內腫瘤細胞生長的微環境。Grunewald等[28]采用3D生物打印技術大規模構建了重復性較好的3D神經母細胞腫瘤模型，該模型是一種用于臨床的嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T cell immunotherapy，CAR-T），可以根據細胞表型來進行體外分析。此外，研究人員還開發了卵巢癌和前列腺癌3D細胞培養模型，重現了腫瘤發展的復雜過程[29-30]。
從研究和應用的角度來看，體外細胞培養模型已被證明是評估活性因子特定功能不可或缺的手段之一。研究表明，海藻酸鈉/明膠可以在體外制備3D腫瘤細胞培養模型[31]，并利用該模型評估了藏紅花素對人乳腺癌細胞MCF-7細胞的抑制作用，研究結果表明3D細胞培養模型彌補了2D細胞培養模型在藏紅花素藥性評價方面的不足。從細胞生物學角度來看，誘導腫瘤細胞分化、抑制相關腫瘤基因的表達和腫瘤細胞增殖或者導致腫瘤細胞死亡的活性物質均可發揮抗腫瘤作用，這些活性物質主要通過抑制細胞周期和誘導細胞凋亡而發揮作用[32]。雖然抗腫瘤藥物的研發在不斷的突破，但目前仍然存在著很多惡性腫瘤無法攻克的現實。腫瘤相關的研究應充分考慮腫瘤細胞在體內微環境的存活狀態以及腫瘤細胞之間、細胞與外基質之間所傳遞的信號，這對于攻克腫瘤治療中的相關難題具有重要意義。Milazzo等[33]將絲素蛋白（silk fibroin，SF）作為支持3D細胞培養模型的支架材料，為了更加有利于信號的傳導，SF支架的結構設計為多孔海綿的形式，通過對此模型進行表征證明了它可以用于研究腫瘤的防治等相關工作。徐怡朦等[34]以水凝膠為支架材料，通過3D生物打印技術構建了人乳腺癌細胞MCF-7和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的3D細胞培養模型，并對比分析了在2D和3D細胞培養模型中阿霉素對癌細胞的增殖效果的影響，研究結果表明人乳腺癌細胞MDA-MB-231對阿霉素的耐藥性高于人乳腺癌細胞MCF-7，且與2D細胞培養模型相比，3D細胞培養模型中的球體內部存在差異增殖區，細胞可以躲避藥物的穿透，使得3D培養的人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231對阿霉素的耐藥性顯著增加。因此，3D細胞培養模型可以在體外高效準確地評估抗癌藥物的療效，可用于抗腫瘤活性物質的篩選工作。
3.2 3D腸道細胞培養模型的應用
體外培養的腸類器官可以很好地模擬體內腸隱窩和微絨毛等結構[35]，在此模型中細胞可以吸收培養基中的氨基酸、葡萄糖、無機鹽等營養成分，該模型具有體內腸道組織的許多生理學特征，所以越來越多的腸道相關研究更加傾向于使用腸類器官模型。Xu等[36]采用了3D人結腸癌細胞Caco-2培養模型研究了腸上皮細胞在腫瘤壞死因子-α刺激后的生理學反應，研究結果表明此腸道細胞培養模型為腸屏障疾病潛在機制的研究提供了全新的思路與解決方案。梁提松[37]根據人結腸癌細胞Caco-2細胞獨特的結構，使用水凝膠構建3D Caco-2細胞培養模型，對楊梅花色苷在體外吸收和抗氧化性進行了評價，驗證了3D Caco-2細胞培養模型比2D細胞培養模型更具優勢，同時也為基于3D腸細胞培養模型研究功能因子的作用機制提供了科學的依據。3D人結腸癌細胞Caco-2培養模型具有腸細胞特殊的絨毛結構，常用于研究藥物或者活性物質吸收、代謝等過程，可以為藥物評價提供可靠的研究數據[38-39]。本文總結了3D細胞培養模型的應用，如表2所示[14, 27-39, 40-42]。
表2
3D細胞培養模型的應用
Table2.
Applications of 3D cell culture systems
4 結論與展望
3D細胞培養模型可以使細胞具有更多類似于在體內生存的生理學特征，目前，3D細胞培養模型的應用涉及了各個領域，不僅僅局限于對活性物質的功能性評價，在臨床醫學中也具有廣泛的應用，特別是在體外重現癌癥發展的復雜過程方面。此外，在化學物質毒性預測以及風險評估中，3D細胞培養模型可以實時評估藥物代謝和毒副作用，為化學物質的管理提供了理論依據。本文重點介紹了3D細胞培養模型的特點、建立方法及應用。3D細胞培養模型不僅有利于細胞的生長和分化，還有利于細胞之間、細胞與基質間的信號傳導。3D細胞培養模型向人們直觀地展現了細胞培養過程的形態，且在細胞培養過程中具有良好的可控性。3D細胞培養模型高度模擬了細胞生長的微環境，使細胞保持了類似于體內的分子基因型和表型；還可以結合實時活細胞成像分析，以及虛擬化現實（virtual reality，VR）可視化細胞，直接獲取細胞的圖像，為活性物質和藥物的初篩提供可靠的數據。隨著3D打印、3D芯片、3D細胞培養高內涵成像分析、生物反應器等技術的快速發展，3D細胞培養技術在癌癥研究、活性物質的挖掘、功能食品的開發等領域具有更廣泛的潛在應用價值。目前，3D細胞培養模型的建立仍然存在一些問題和挑戰，如技術的成熟度不足、建模的成本較高、可重復性較差、高通量分析以及自動化技術尚待完善等，建立標準化的3D細胞培養模型仍然需要進一步的研究。未來可以通過多學科交叉，如結合材料科學、細胞生物學和生物反應器設計等多個關鍵領域來建立標準化的3D細胞培養模型，從而解決3D細胞培養模型中現存的問題，使3D細胞培養技術逐漸走向成熟。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：盧曉琴和劉曉鳳為綜述主要撰寫人，完成相關文獻資料的收集和分析及論文稿件的寫作；鐘浩、張維和余淑珍參與文獻資料的分析、整理及論文修改；關榮發為論文的構思者及負責人，指導論文寫作及論文的主要審核人。
0 引言
細胞體外培養模型和動物體內實驗常常用于研究各類疾病的發生和發展。細胞體外培養是指將來自動物或人體的細胞培養于適宜的環境下，使細胞能夠正常生長、繁殖并維持一定結構和功能[1]。傳統動物體內實驗是一種主要依靠神經行為學觀察和組織病理學檢查的方法，與細胞體外培養模型相比存在明顯的局限性，主要表現為：實驗周期長、成本高以及實驗結果主觀性較強，不能從毒性作用機制方面解析活性物質的神經性毒性，并且活性物質在動物體內發揮作用的機制與其在人體中的作用機制存在較大差異，不能完全反映活性物質的實際代謝情況[2]。細胞體外培養實驗在一定程度上彌補了動物實驗的不足，特別是在細胞分子機制相關方面的研究，但是隨著細胞培養模型研究的不斷深入，研究人員發現二維（two-dimensional，2D）細胞培養模型存在細胞存活率低、細胞形態容易受損、細胞缺乏良好的組織結構等缺點。因此，為了彌補2D細胞培養模型的不足，研究人員設計開發了第三維度的細胞培養方法[3]。
三維（three-dimensional，3D）細胞培養模型的研究結果與臨床試驗結果接近，特別是在抗腫瘤藥物的篩選方面。將3D細胞培養模型與高通量藥物篩選相結合，可以更高效地得到具有參考價值的臨床候選藥物。隨著科學技術的進步以及創新藥物和功能食品研究的不斷深入，人們開始對可以調節人體機能的天然活性物質的生理生化作用有了進一步的認識[4]。目前，單純依靠藥物來輔助治療疾病還存在一定的風險，所以越來越多的研究人員開始著手從天然物質中尋找有效的功能因子。大量研究表明，黃酮類、萜類、多糖類、皂苷類等天然活性因子具有預防和治療疾病的作用[5]，而對于活性因子的毒理學及功能性評價急需開發一種高效的體外評價模型。本文對比分析了2D和3D細胞培養模型的優缺點，簡要概述了3D細胞培養模型的構建方法，并對3D模型的應用進行了總結和探討。通過本文綜述，期望可為生物活性因子的毒理學和功能性評價新模型的開發提供理論依據。
1 體外細胞培養
正常細胞從分裂、增殖、遷移到凋亡的過程，在本質上依賴于空間和時間組織原則，存在著細胞和細胞、細胞和基質間的相互關系。因此，細胞體外培養需要模擬細胞在體內生長的微環境，提供滿足細胞正常生長的條件。體外細胞培養技術自創立以來，在生物學及醫學領域快速發展和應用，已經成為各個領域進行科學研究的重要手段。目前細胞體外培養常見的模型分為2D細胞培養模型和3D細胞培養模型。
1.1 2D細胞培養模型
2D細胞培養模型是指在特定培養條件下，使細胞在培養皿或者培養瓶中生長，讓細胞在外基質環境中處于2D平面生長的狀態。用于2D體外細胞培養模型的細胞株多種多樣，如人結腸癌細胞Caco-2、人肝癌細胞HepG2、小鼠腹水瘤細胞S180、人造血系腫瘤細胞U937等，根據這些細胞株生長的方式，可分為貼壁細胞和懸浮細胞，其中絕大多數體外培養的細胞以貼壁的形式進行生長。由于動物體內實驗常常受到倫理等問題的限制，使得細胞培養實驗逐漸在生物活性驗證、藥物篩選、毒理學評價等研究中逐漸占據主導地位[6]。目前2D細胞培養技術已經取得了巨大的進步，利用細胞在體外建立抗癌[7]、抗炎[8]等模型，可以有效地評估生物活性物質的生理生化功能。Jiang等[9]在體外成功培養了人角膜內皮細胞（human corneal endothelial cells，HCEnC），并構建了一種評價紫外線（ultraviolet，UV）對細胞HCEnC損傷愈合的體外細胞培養模型，研究結果表明細胞的愈合效果與UV的劑量相關，當使用抗壞血酸-2-磷酸酯這種抗氧化劑時可以顯著減少細胞內的自由基，從而改善UV對細胞HCEnC造成的損傷。Khalifa等[10]建立脂肪化的人肝癌細胞HepG2模型，證明多肽激素艾塞那肽（Exendin-4）可以通過Wnt/β-catenin信號通路直接激活胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide-1 receptors，GLP-1R），進而下調肝型脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding protein，FABP1）和叉頭盒蛋白A1（forkhead-box A1，FOXA1）的表達，減少脂肪酸攝取和轉運，從而改善了油酸誘導的人肝癌細胞HepG2中脂質的沉積。除了通過調節某種信號通路之外，也可以敲除特定基因來直接治療某種疾病。比如，基于DNA聚合酶（DNA polymerase theta，DNA-POLQ）在肝癌中的表達，通過體外培養人肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞，利用慢病毒感染DNA-POLQ構建HCC細胞培養模型。有研究報道，通過敲除DNA-POLQ，并與相應陰性對照對比分析，以了解HCC細胞功能喪失的情況，并利用該體外細胞培養模型揭示DNA-POLQ可能參與了HCC的發展，以此來證明敲除DNA-POLQ可能是治療HCC有效的方法之一[11]。另一項研究指出，對于基因治療系統這種新手段，可以直接通過肽轉運蛋白來敲除人誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem，iPS），進而將細胞分化為腸上皮樣細胞，以此建立更精確的腸道藥物吸收模型[12]。雖然構建2D細胞培養模型的技術越來越成熟，但是在某些研究中，利用2D細胞培養模型所得出的實驗結果與動物體內實驗的結果仍存在較大的差異，產生這些差異的主要原因可能是細胞之間在一定程度上失去了組織聯系及相互作用，即細胞在體外培養條件下的生長情況與體內的生長情況存在一定差異，從而使得2D細胞培養模型不能完全滿足研究的需要。因此，急需構建一種能夠準確模擬體內細胞生長的方法，從而滿足細胞體外相關研究的需求。
1.2 3D細胞培養模型
3D細胞培養模型是近年來開發的一種新型細胞體外培養技術，它的培養方法是將細胞、細胞生長因子、再造基質蛋白以及適合的骨架混合在一個體系中進行共同培養，其目的是使細胞的生長環境更接近生物體內的狀態，有效模擬細胞在人體內的微環境，從而進行相關疾病的研究。將2D細胞培養模型和3D細胞培養模型進行對比，其各自的優點及局限性如表1所示。
表1
2D細胞培養模型和3D細胞培養模型的優點及局限性
Table1.
The advantages and limitations of 2D and 3D cell culture models
在3D細胞培養模型中，細胞對內源性和外源性刺激（如溫度、pH、營養吸收、轉運和分化等）的應答更接近于它們在體內的狀態，能夠更加準確地模擬細胞在正常和病態下的生理生化狀態。Paniushkina等[13]基于瓊脂糖插片的3D細胞培養模型和2D細胞培養模型評估了細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的產生、分離和表征。與2D細胞培養模型相比，3D細胞培養模型允許在無血清條件下長期培養不同來源的細胞，且可以輕松恢復EV，從而使實驗結果更加準確。作為體外2D細胞培養和細胞體內天然生長環境的橋梁，3D細胞培養模型具有不可比擬的優勢，主要表現為3D細胞培養下既能模擬細胞體內生存的微環境又可以直觀檢測細胞生長狀態。當采用共培養的方式培養細胞時，還可以依據實驗目的的不同進行相應的調整。例如，研究上皮結構的生成可以將膠原蛋白層與嵌入式的人腸纖維細胞共培養，一起構建3D人結腸癌細胞Caco-2模型[14]，這種先進的腸道模型可以更好地再現體內腸道微環境及其生理特征。
2 3D細胞培養模型的建立方法
正常情況下，細胞的分裂、增殖和調亡過程都是在體內微環境中進行，2D細胞培養模型僅僅是將該過程轉移到體外，通過添加支持細胞生長的載體如聚苯乙烯和玻璃，使細胞在其表面進行生長，但這些基質并不能使細胞進行精確復制，而且阻礙了細胞之間、細胞和基質間的信號傳遞[3]。另外，許多2D細胞培養實驗中沒有充分考慮到不同類型細胞之間的相互作用，絕大多數的培養為單一類型細胞的培養。為了彌補2D細胞培養模型中的不足，創造一種盡可能接近原生組織的生長環境，研究人員將細胞引入到具有生物相容性的支架中，并充分考慮支架的選材、細胞來源和實際的培養方法等重要參數，構建了滿足不同研究需求的3D細胞培養模型。目前，3D細胞培養的模型主要包括無支架的3D細胞培養模型和有支架的3D細胞培養模型。
2.1 無支架的3D細胞培養模型的建立
無支架的3D細胞培養模型又稱為3D多細胞聚集球體模型（3D multi cell aggregation sphere model，3D MCTSs）。如圖1所示，3D MCTSs通常是由細胞單獨培養或者共培養技術來構建的模型，主要的方式包括使用超低附著培養板或采用懸掛滴培養、旋轉培養和凹板法[15-16]，以及采用近年來出現的微流芯片技術等。目前，這些無支架的3D細胞培養建模方法已經得到廣泛應用。例如：張增利[17]采用無支架的3D細胞培養模型中最常用的超低附著培養板法，即利用附著板中半球結構的低黏附力促進細胞自聚成球體，成功建立癌癥患者來源的3D腫瘤細胞培養系統。通過這種方法構建的3D腫瘤細胞培養模型可以隨時觀察細胞生長狀態。此外，還利用此技術在體外構建了非小細胞肺癌原代細胞球模型，用于藥物的篩查。研究結果表明，這種無支架的3D細胞培養模型可以提供可靠的藥物篩查數據，是一種高效的藥物高通量篩選的方法。?tampar等[18]利用懸滴培養法構建了一種3D人肝癌細胞HepG2培養模型，構建方法主要是通過在培養基中添加了4%甲基纖維素來開發球狀體，通過對此3D細胞培養模型進行表征發現，與傳統的2D細胞培養相比，此模型中細胞的形態更接近體內組織和器官中細胞的狀態，且此模型可用于評估化學物質的遺傳毒性作用。但是懸滴法在實際操作中比較復雜，相比之下，凹面細胞培養法會相對簡單，此方法只需要在細胞培養器中放入適合的多凹面細胞培養板，利用凹面光滑的末端槽就可以獲得大量的細胞球體。隨著體外培養技術的不斷發展，研究人員開始將細胞培養與微重力結合，這種細胞培養方法同樣也不需要支架，只需要通過旋轉細胞培養系統（rotary cell culture system，RCCS）來模擬微重力，構建流程為：先在體外培養目標細胞，再將細胞植入建立的模擬微重力儀器中，然后通過微重力回轉器與地面平行旋轉，使細胞在該系統中呈自由落體狀態生長[19]。為了使細胞表型和生物學特性更加準確，Miller等[20]開發了3D微流控細胞陳列芯片技術，該技術能夠真實重構腫瘤細胞中的3D微環境和微血管內皮細胞。此外，該模型不僅能夠更好地預測特定腫瘤患者對抗腫瘤藥物的敏感性，而且還能為患者找到更好的治療方案。與常規2D模型培養的腫瘤細胞相比，在3D細胞培養模型中球體細胞和相對封閉的球內細胞均可以充分接觸培養基，這有利于維持細胞的表型，因此可以提供相對準確的觀測性結果。
圖1
2D和3D細胞培養模型示意圖
Figure1.
Schematic representing the 2D and 3D cell culture models
2.2 有支架的3D細胞培養模型建立
有支架的3D細胞培養模型是將目標細胞、細胞生長因子、再造基質蛋白以及支架混合后共同培養。因為細胞之間存在高度異質性，在不同細胞以及細胞微環境之間具有復雜的相互作用，與無支架的3D細胞培養模型相比，有支架的3D細胞培養模型更有利于細胞之間、細胞與基質間和組織間信號的傳遞[21]。在有支架的3D細胞培養條件下，要使細胞更“接近體內”狀態就必須要考慮培養過程中所用支架的選擇，不同種類的細胞需要選擇其合適的支架。其中，瓊脂糖、膠原蛋白、纖維連接蛋白、明膠、層粘連蛋白、玻璃體粘連蛋白等都是常用的支架材料。這些材料通過孔隙度、纖維性、滲透性和力學穩定性來模擬細胞外基質，進而增強黏附細胞的生長和相互作用，促進細胞之間的相互交流和信號的傳遞[22]。在一些以水凝膠為支架的3D細胞培養模型中，因支架材料中含有大量可溶性生長因子而使細胞具有較高的生物活性，從而有利于細胞的生長和分化。Liu等[23]利用生物可降解、熱敏性強及可注射的羧甲基甲殼素水凝膠為支架，使細胞在此培養系統中可以持續增殖，從而形成具有較高細胞活性的3D多細胞球體。Saleh等[24]使用瓊脂糖凝膠通過液體覆蓋技術制備了3D球體模型，成功構建了黑色素瘤B16F10、巨噬細胞J774和小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3三種細胞系的3D細胞培養系統，并基于此模型研究了黑色素瘤B16F10的微環境以及新藥物的抗癌作用。Turtoi等[25]建立了一種基于透明質酸（hyaluronic acid，HA）的人肝癌細胞HepG2培養模型，通過把人肝癌細胞HepG2植入透明質酸/聚甲基乙烯基醚-ALT-馬來酸酐（hyaluronic acid/polymethylvinyl ether ALT maleic anhydride，HA3P50）支架中來構建3D細胞培養模型，結果表明此方法建立的人肝癌細胞HepG2培養模型可以通過控制肝細胞特異性生物標志物（白蛋白、尿素、膽汁酸、轉氨酶）的釋放和細胞色素P450（CYP）7A1酶的合成，增殖成更大的細胞聚集體，表現出類似于體內肝臟的功能。Zhang等[26]分別構建了共培養和單細胞培養兩種細胞培養模型，通過把懸浮的小鼠胚胎細胞NIH/3T3轉移至12孔細胞侵襲實驗培養板（Transwell）后添加膠原凝膠使其表面膠化，然后對腸上皮、纖維細胞網絡和細胞外基質進行改進，并在上層接種人結腸癌細胞Caco-2，讓細胞生長在3D空間中，以此構建3D Caco-2/3T3共培養模型；同時建立了只含有人結腸癌細胞Caco-2的單細胞培養模型。利用這兩種細胞培養模型研究藥物的滲透性和藥物的吸收率，研究結果表明共培養模型可以作為研究藥物吸收轉運的理想模型。
3 3D細胞培養模型的應用
體外細胞培養模型與動物體內模型相比，成本更低，更容易控制，且可以克服倫理問題的限制，所以越來越多的研究選擇體外細胞培養模型進行相關的功能驗證和活性評價。2D細胞培養模型固有的缺陷限制了其應用，3D細胞培養模型與2D細胞培養模型相比，靈活性好以及更能適應實驗的變化，逐漸成為研究各類疾病發生機制、藥物高通量篩選、活性物質的功能驗證等領域的理想模型。
3.1 3D腫瘤細胞培養模型的應用
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命和健康，近半個世紀以來，世界各國均投入了大量人力、物力從事惡性腫瘤的研究，由于2D細胞培養模型無法準確地模擬癌細胞在體內的狀態，所以開發體外3D腫瘤細胞培養模型逐漸成為了研究的熱點。3D腫瘤細胞培養模型中細胞的極性和基因表達與機體內腫瘤細胞非常接近，因此3D腫瘤細胞培養模型逐漸成為抗癌藥物高通量篩選的理想模型，在評估藥物的治療效果方面發揮了至關重要的作用。此外，3D腫瘤細胞培養模型的構建對于治療性DNA疫苗、單克隆抗體的體外實驗等相關的研究也具有重要意義。近年來3D腫瘤細胞培養模型發展迅速，不僅僅在建模上采用新技術，而且能夠針對疾病的特殊性，應用在個性化治療和免疫治療等方面，為開發個性化的抗腫瘤治療提供了新思路。Betriu等[27]利用3D自組裝肽支架培養了胰腺導管腺癌細胞（pancreatic ductal adenocarcinoma cells，PDAC），建立了厄洛替尼治療表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）內化和降解的新模型，并與2D PDAC培養模型對比，結果顯示3D細胞培養模型更加準確模擬了體內腫瘤細胞生長的微環境。Grunewald等[28]采用3D生物打印技術大規模構建了重復性較好的3D神經母細胞腫瘤模型，該模型是一種用于臨床的嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T cell immunotherapy，CAR-T），可以根據細胞表型來進行體外分析。此外，研究人員還開發了卵巢癌和前列腺癌3D細胞培養模型，重現了腫瘤發展的復雜過程[29-30]。
從研究和應用的角度來看，體外細胞培養模型已被證明是評估活性因子特定功能不可或缺的手段之一。研究表明，海藻酸鈉/明膠可以在體外制備3D腫瘤細胞培養模型[31]，并利用該模型評估了藏紅花素對人乳腺癌細胞MCF-7細胞的抑制作用，研究結果表明3D細胞培養模型彌補了2D細胞培養模型在藏紅花素藥性評價方面的不足。從細胞生物學角度來看，誘導腫瘤細胞分化、抑制相關腫瘤基因的表達和腫瘤細胞增殖或者導致腫瘤細胞死亡的活性物質均可發揮抗腫瘤作用，這些活性物質主要通過抑制細胞周期和誘導細胞凋亡而發揮作用[32]。雖然抗腫瘤藥物的研發在不斷的突破，但目前仍然存在著很多惡性腫瘤無法攻克的現實。腫瘤相關的研究應充分考慮腫瘤細胞在體內微環境的存活狀態以及腫瘤細胞之間、細胞與外基質之間所傳遞的信號，這對于攻克腫瘤治療中的相關難題具有重要意義。Milazzo等[33]將絲素蛋白（silk fibroin，SF）作為支持3D細胞培養模型的支架材料，為了更加有利于信號的傳導，SF支架的結構設計為多孔海綿的形式，通過對此模型進行表征證明了它可以用于研究腫瘤的防治等相關工作。徐怡朦等[34]以水凝膠為支架材料，通過3D生物打印技術構建了人乳腺癌細胞MCF-7和人乳腺癌細胞MDA-MB-231的3D細胞培養模型，并對比分析了在2D和3D細胞培養模型中阿霉素對癌細胞的增殖效果的影響，研究結果表明人乳腺癌細胞MDA-MB-231對阿霉素的耐藥性高于人乳腺癌細胞MCF-7，且與2D細胞培養模型相比，3D細胞培養模型中的球體內部存在差異增殖區，細胞可以躲避藥物的穿透，使得3D培養的人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231對阿霉素的耐藥性顯著增加。因此，3D細胞培養模型可以在體外高效準確地評估抗癌藥物的療效，可用于抗腫瘤活性物質的篩選工作。
3.2 3D腸道細胞培養模型的應用
體外培養的腸類器官可以很好地模擬體內腸隱窩和微絨毛等結構[35]，在此模型中細胞可以吸收培養基中的氨基酸、葡萄糖、無機鹽等營養成分，該模型具有體內腸道組織的許多生理學特征，所以越來越多的腸道相關研究更加傾向于使用腸類器官模型。Xu等[36]采用了3D人結腸癌細胞Caco-2培養模型研究了腸上皮細胞在腫瘤壞死因子-α刺激后的生理學反應，研究結果表明此腸道細胞培養模型為腸屏障疾病潛在機制的研究提供了全新的思路與解決方案。梁提松[37]根據人結腸癌細胞Caco-2細胞獨特的結構，使用水凝膠構建3D Caco-2細胞培養模型，對楊梅花色苷在體外吸收和抗氧化性進行了評價，驗證了3D Caco-2細胞培養模型比2D細胞培養模型更具優勢，同時也為基于3D腸細胞培養模型研究功能因子的作用機制提供了科學的依據。3D人結腸癌細胞Caco-2培養模型具有腸細胞特殊的絨毛結構，常用于研究藥物或者活性物質吸收、代謝等過程，可以為藥物評價提供可靠的研究數據[38-39]。本文總結了3D細胞培養模型的應用，如表2所示[14, 27-39, 40-42]。
表2
3D細胞培養模型的應用
Table2.
Applications of 3D cell culture systems
4 結論與展望
3D細胞培養模型可以使細胞具有更多類似于在體內生存的生理學特征，目前，3D細胞培養模型的應用涉及了各個領域，不僅僅局限于對活性物質的功能性評價，在臨床醫學中也具有廣泛的應用，特別是在體外重現癌癥發展的復雜過程方面。此外，在化學物質毒性預測以及風險評估中，3D細胞培養模型可以實時評估藥物代謝和毒副作用，為化學物質的管理提供了理論依據。本文重點介紹了3D細胞培養模型的特點、建立方法及應用。3D細胞培養模型不僅有利于細胞的生長和分化，還有利于細胞之間、細胞與基質間的信號傳導。3D細胞培養模型向人們直觀地展現了細胞培養過程的形態，且在細胞培養過程中具有良好的可控性。3D細胞培養模型高度模擬了細胞生長的微環境，使細胞保持了類似于體內的分子基因型和表型；還可以結合實時活細胞成像分析，以及虛擬化現實（virtual reality，VR）可視化細胞，直接獲取細胞的圖像，為活性物質和藥物的初篩提供可靠的數據。隨著3D打印、3D芯片、3D細胞培養高內涵成像分析、生物反應器等技術的快速發展，3D細胞培養技術在癌癥研究、活性物質的挖掘、功能食品的開發等領域具有更廣泛的潛在應用價值。目前，3D細胞培養模型的建立仍然存在一些問題和挑戰，如技術的成熟度不足、建模的成本較高、可重復性較差、高通量分析以及自動化技術尚待完善等，建立標準化的3D細胞培養模型仍然需要進一步的研究。未來可以通過多學科交叉，如結合材料科學、細胞生物學和生物反應器設計等多個關鍵領域來建立標準化的3D細胞培養模型，從而解決3D細胞培養模型中現存的問題，使3D細胞培養技術逐漸走向成熟。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：盧曉琴和劉曉鳳為綜述主要撰寫人，完成相關文獻資料的收集和分析及論文稿件的寫作；鐘浩、張維和余淑珍參與文獻資料的分析、整理及論文修改；關榮發為論文的構思者及負責人，指導論文寫作及論文的主要審核人。
