本研究旨在評價負載尼洛替尼的生物相容性甲基丙烯酰化明膠（GelMA）微針貼片應用于心肌梗死（簡稱：心梗）后對心臟功能障礙的治療作用，為臨床抗心肌纖維化治療提供新的思路。本研究在心梗造模后10 d（疤痕成熟期），將GelMA微針貼片貼附于心外膜表面，靶向梗死及周圍區遞送抗纖維化藥物尼洛替尼。在心梗造模后28 d，通過超聲心動圖、血漿腦型利鈉肽、心重/體重比等指標評價心臟功能和左室重構情況；通過小麥胚芽凝集素染色評價心肌肥大情況；通過蘇木精—伊紅染色、天狼星紅染色評價心肌纖維化情況。結果顯示，相較于心梗對照組及使用空白GelMA微針貼片治療組，負載尼洛替尼的GelMA微針貼片可減輕心肌肥大和梗死周圍區纖維化過度擴張，從而預防不良心室重構，改善心功能。本研究所提這一治療策略是糾正心梗后心臟功能障礙的一次有益嘗試，有望成為糾正心梗后心臟功能障礙的新策略，對改善心梗患者的長期預后具有重要的臨床意義。
引用本文： 彭寧馨, 謝峻. 負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠微針貼片治療心肌梗死后心臟功能障礙的研發與應用. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(5): 996-1004. doi: 10.7507/1001-5515.202208039 復制
0 引言
心肌梗死（myocardial infarction，MI）（簡稱：心梗）是指冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，作為全球范圍內高發病率和高致死率的主要疾病之一，其不良預后與心梗后心力衰竭（簡稱：心衰）的發生密切相關。歐美地區數據提示，即使經過積極血運重建和術后強化藥物治療，心梗后一個月到6、7 年內，心衰發生率為13.1%～37.5% [1-2]。在我國心梗患者中，心梗后心衰的發病率同樣很高，而心梗后心衰的發生使得患者短期及長期的死亡風險明顯增加且預后差[3]。心室重構是心梗后心衰的主要病理特征，通常認為心梗后心臟的修復分為三個階段，即炎癥期、修復期及成熟期[4]。在修復期，生理性纖維化過程有助于心梗疤痕的形成，防止心臟破裂的發生。而最新研究發現，在成熟期成纖維細胞的持續活化及梗死周圍區的纖維化過度擴張是導致不良心室重構和心功能惡化的主要原因[5-6]。遺憾的是，目前臨床上用于預防心室重構的藥物，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑等，只能部分和間接地抑制心肌纖維化[7-9]。因此，尋找有效的治療策略來抑制心梗后心肌過度纖維化對于改善心梗患者遠期預后有著重要的臨床意義。
在心梗后組織修復的增殖階段，包括轉化生長因子—β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路、Wnt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路、磷脂酰肌醇—3—激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB）信號通路中多種細胞因子參與了心肌纖維化的形成。其中MAPKs信號通路、PI3K/PKB信號通路是非受體酪氨酸激酶經典通路，在心肌纖維化中起著關鍵作用[10]。因此，尼洛替尼（nilotinib，Ni）作為小分子酪氨酸激酶抑制劑可作用于這些信號通路，通過選擇性抑制酪氨酸激酶活性來阻斷下游信號傳導，從而直接抑制心梗后纖維化過度激活，改善不良心室重構。但是，廣泛的抗纖維化治療不利于疤痕的形成和室壁結構的穩定[11-12]。因此，本研究希望探索一種新的治療策略，實現局部遞送尼洛替尼抗纖維化的同時維持室壁穩定。既往研究發現，心梗后給予心臟微針貼片（microneedle，MN）治療可使梗死區室壁厚度增加，從而預防心室不良擴張，避免心臟破裂的發生[13] 。所以，本研究開發了一種負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）微針貼片，靶向局部心肌遞送抗纖維化藥物，期望最終可以實現為梗死區心肌提供一定強度機械支持的同時，有效抑制心肌纖維化，從而改善心梗后心功能惡化。
1 方法和材料
1.1 實驗動物
本研究經南京醫科大學鼓樓臨床醫學院倫理委員會審核批準，可開展全文實驗（批準號20201015）。首先，于斯貝福（北京）生物技術有限公司購得15只雄性斯潑累格·多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠（200～220 g，6～7周齡），每個籠子飼養5只SD大鼠，均在標準條件下飼養（溫度22～24 °C，濕度（50 ± 5）%，光照時刻為8：00～20：00），可自由進食和飲水。
1.2 載藥微針貼片制備
1.2.1 甲基丙烯酰化明膠制備
明膠經過甲基丙烯酸改性合成GelMA，其合成步驟如下：首先將10 g 明膠［購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］加入100 mL磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），并在60 ℃下持續攪拌直至完全溶解，然后將10 mL甲基丙烯酸酐［購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］逐滴加入到明膠溶液中，并在60 ℃下加熱2 h后，加入預熱的PBS（60 ℃），隨后繼續攪拌1～2 h。之后將所得溶液倒入透析袋中，在60 ℃下透析7 d以除去過量的甲基丙烯酸酐，最后冷凍干燥后得到的GelMA保存于?20 ℃備用。
1.2.2 負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠微針貼片制備
將1 mg尼洛替尼固體原料藥（購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶于GelMA預聚物質量濃度為30%、2—羥基—2—甲基苯丙酮［購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］體積濃度為1%的溶液中，然后滴入聚二甲基硅氧烷微針貼片模具（385個錐形陣列，直徑17.5 mm，每個錐形微針針尖長度570 μm），之后通過離心除去錐形微針針尖腔中的空氣，并將混合溶液填充入腔內。隨后，將GelMA質量濃度為30% 不含尼洛替尼的預聚物溶液作為背襯材料加入模具中。最終，復合預聚物溶液經紫外光（365 nm）固化，干燥脫模后可得到負載尼洛替尼的GelMA微針貼片。微針貼片的電鏡圖像由掃描電子顯微鏡JSM-IT200[捷歐路（北京）科貿有限公司，中國]拍攝得到。
1.2.3 負載羅丹明B的甲基丙烯酰化明膠微針貼片制備
同樣地，將0.5 mg的羅丹明B固體原料藥（購于巴斯夫生物科技有限公司）溶于GelMA預聚物質量濃度為30%、2—羥基—2—甲基苯丙酮體積濃度為1%的溶液中，然后滴入聚二甲基硅氧烷微針貼片模具，除去錐形微針針尖腔中的空氣后，加入質量濃度為30% 的GelMA預聚物溶液作為微針貼片背襯溶液。最后，通過固化、干燥和脫模獲得負載羅丹明B的GelMA 微針貼片。微針貼片的電鏡圖像由掃描電子顯微鏡JSM-IT200［捷歐路（北京）科貿有限公司，中國］拍攝得到。
1.3 大鼠心梗模型制備
用戊巴比妥將SD大鼠麻醉后，行氣管插管并連接到呼吸機輔助通氣。SD大鼠取仰臥位固定，常規備皮、消毒、鋪巾后，從SD大鼠左胸第四肋間間隙做橫形切口打開胸腔，撕開心包膜充分暴露心臟，用6-0縫合線結扎近端冠狀動脈左前降支，通過觀察結扎部位下方心肌顏色由紅色變為蒼白和隨后的超聲心動圖檢測來確認心梗模型造模成功。
1.4 分組及載藥微針貼片治療
心梗造模成功的15只SD大鼠隨機分為：心梗對照（MI對照）組、空白微針貼片（MI+MN）組和載藥微針貼片（MI+MN-Ni）組，每組5只。①（MI對照）組：心梗造模后不予任何處理；②（MI+MN）組：心梗造模后10 d給予空白微針貼片治療；③（MI+MN-Ni）組：心梗造模后10 d給予負載尼洛替尼的微針貼片治療。在心梗造模后7 d對所有大鼠進行超聲心動圖檢查。在心梗造模后10 d，即心梗疤痕基本成熟后，于（MI+MN）組和（MI+MN-Ni）組再次行開胸手術，將GelMA微針貼片貼附于梗死區及梗死周圍區的心外膜表面。在心梗造模后28 d，所有大鼠完成最后一次超聲心動圖檢查后，通過腹主動脈收集大鼠外周血，完整取下大鼠的心臟并稱重，之后分別用于蘇木精—伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining，HE）染色、天狼星紅染色、小麥胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色。脛骨和肺也被取下用于測量脛骨長度、肺濕重及肺干重。所有大鼠行安樂死處理。
1.5 心功能評估
在心梗造模前、心梗造模后7 d和心梗造模后28 d行超聲心動圖檢查，通過二維超聲檢測左心室短軸斷面，M型超聲檢測觀察左心室的運動情況以評估心臟功能。采用盲法分析和評估所有超聲心動圖結果，即不考慮每只動物給予的處理。收集的外周血在3 000 g下離心15 min以獲得血漿，之后通過酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒［購于艾博抗（上海）貿易有限公司］測定血漿腦型利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平。
1.6 心肌纖維化染色觀察
將本文1.4小節摘取的心臟組織部分用石蠟包埋后切片行HE染色，部分石蠟包埋后切片用天狼星紅染色試劑盒[購于艾博抗（上海）貿易有限公司]進行天狼星紅染色。天狼星紅染色在光學顯微鏡下觀察可見：膠原纖維被染成紅色、心肌纖維染成粉紅色。
1.7 相關蛋白纖維化檢測
取本文1.4小節摘取的各組心臟組織的梗死區及梗死周圍區冰凍標本勻漿，隨后加入裂解液提取總蛋白，經過聚丙烯酰胺凝膠（10%～12%分離膠，5%濃縮膠）電泳分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜。之后將聚偏二氟乙烯膜放置于5%脫脂奶中封閉2 h，加入1：1 000稀釋的α—平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗、骨膜蛋白（periostin，POSTN）一抗、Ⅰ型TGF-β（TGF-β1）一抗，4 ℃孵育過夜，加入三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液和吐溫-20緩沖液洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，常溫孵育2 h。聚偏二氟乙烯膜使用蛋白免疫印跡（western blot，WB）增強化學發光試劑盒［購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司］染色并發光成像，通過計算α-SMA、POSTN、TGF-β1分別與β—肌動蛋白（β-actin）條帶的平均灰度比值來評定相對蛋白表達水平。WB圖像由全自動化學發光成像系統Tanon 5200（上海天能生命科學有限公司，中國）拍攝。
1.8 免疫熒光觀察心肌細胞改變
將本文1.4小節摘取的心臟組織冰凍切片用于WGA染色。室溫下將切片用4%的多聚甲醛固定液固定10 min，隨后在PBS中洗滌切片3次，每次5 min。將WGA[購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]在PBS中稀釋至濃度為5.0 μg/mL，于室溫下避光孵育10 min。再次洗滌后，將4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在PBS中稀釋至濃度為0.1 μg/mL，于室溫下染色15 min，最后通過共聚焦激光掃描顯微鏡SP5（Leica microsystems Inc.，德國）拍攝免疫熒光的圖像。
1.9 心肌組織中核糖核酸的表達檢測比較
取本文1.4小節摘取的各組梗死區及梗死周圍區心臟組織少許，用新型總核糖核酸（RNA）提取試劑（購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司）提取總RNA，之后用分光光度計NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國 ）測定RNA濃度，使用HiScript Q RT SuperMix試劑盒(購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司)逆轉錄為互補脫氧核糖核酸。最后使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），并使用RT-qPCR檢測系統Q5（Applied Biosystems Inc.，德國）進行檢測編碼α-SMA、TGF-β1、POSTN、Ⅰ型膠原α1（collagen type I alpha 1，COL1a1）、白介素1β（Interleukin 1 beta，IL1β）、白介素6（Interleukin 6，IL6）、白介素10（Interleukin 10，IL10）、腫瘤壞死因子—α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的基因相對于甘油醛—3—磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的基因表達，如表1所示。
表1
RT-qPCR合成的引物序列
Table1.
Primer sequences for RT-qPCR synthesis
1.10 統計學方法
2 結果
2.1 負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠微針貼片的表型特征
GelMA微針貼片通過脫模獲得，如圖1所示，其在干燥過程中逐漸自然彎曲成弧形，有利于其在治療過程中更加貼合心臟表面。每個微針貼片尖端均以圓錐形整齊排列，總共約有385個微針排列成直徑為17.5 mm的均勻圓形貼片，單個針尖的高度約為570 μm。
圖1
微針貼片圖片、針尖長度及微針貼片負載羅丹明B隨時間釋放率曲線
Figure1.
The images of microneedle，microneedle tips size and release performance of loaded Rhodamine B
為了檢測GelMA 微針貼片的藥物負載和釋放性能，本研究使用羅丹明B作為模型藥物將其載入微針針尖中，隨后將負載羅丹明B的GelMA微針貼片浸入PBS中，定量PBS中隨著時間推移釋放的羅丹明B濃度變化，如圖1所示，負載的羅丹明B可以從GelMA 微針貼片持續釋放至少15 d。
2.2 載藥微針貼片治療改善心梗后心功能惡化
本研究通過超聲心動圖評估心梗大鼠治療前后心功能變化，如圖2所示，在心梗造模后7 d，三組大鼠的心功能均較心梗造模前明顯下降，且給予治療前各組間大鼠心梗程度無明顯差異。在心梗造模后10 d再次開胸，給予（MI+MN）組、（MI+MN-Ni）組心臟微針貼片治療。如圖2所示，心梗造模后28 d，在（MI+MN）組及（MI+MN-Ni）組中，兩組大鼠的左室射血分數（left ventricular ejection fractions，LVEF）和左室短軸縮短率（left vascular farction shortening，LVFS）不再下降，與（MI對照）組相比呈上升趨勢，且（MI+MN-Ni）組的上升趨勢優于（MI+MN）組。此外，本研究還檢測了與心衰嚴重程度相關的指標血漿BNP，如圖2所示，在治療結束時（MI+MN-Ni）組BNP水平明顯低于（MI對照）組或（MI+MN）組。
圖2
（MI對照）組、（MI+MN）組、（MI+MN-Ni）組LVFS和LVEF及各組BNP *P<0.05
Figure2.
LVFS, LVEF and BNP of MI control group, MI+MN group and MI+MN-Ni group *P<0.05
2.3 載藥微針貼片治療改善心梗后心肌細胞肥大
本研究通過測量并計算心重/體重比（heart weight to body weight ratio，HW/BW）、心重/脛骨長度比（heart weight to tibial length ratio，HW/TL）（單位：g/mm）及肺濕重/肺干重比（lung wet-to-dry weight ratio，lung wet/dry）來評價治療后左室重構的情況。如圖3所示，與（MI對照）組、（MI+MN）組相比，給予負載尼洛替尼的微針貼片治療后，（MI+MN-Ni）組心臟肥厚明顯改善。
圖3
各組HW/BW、HW/TL及肺濕重/肺干重比
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此外，本研究還通過DAPI和WGA染色來進一步觀察心肌細胞肥大情況，并定量心肌細胞橫截面積（cross section area，CSA），如圖4所示，空白微針貼片治療可以減少CSA，而負載尼洛替尼的微針貼片可使CSA進一步減少。
圖4
各組WGA染色及CSA結果
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2.4 載藥微針貼片治療減少心梗后心肌纖維化
本研究通過HE染色和天狼星紅染色來評估各組心肌纖維化程度。如圖5所示，與（MI對照）組相比，（MI+MN）組纖維化面積更少，而給予載藥微針貼片治療的（MI+MN-Ni）組纖維化面積顯著下降。此外，通過WB實驗可以觀察到，（MI+MN）組及（MI+MN-Ni）組梗死周圍區心肌中POSTN、TGF-β1的蛋白表達水平較（MI對照）組相比均有下降，且（MI+MN-Ni）組比（MI+MN）組下降更明顯。而α-SMA的蛋白表達水平在三組間未見明顯差異，這可能與α-SMA不僅在肌成纖維細胞中表達，而且也在血管平滑肌細胞以及周細胞中都有表達有關[14]。
圖5
各組心臟HE染色、天狼星紅染色及WB結果
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此外，本研究還通過RT-qPCR 分析了各組心臟組織中 POSTN、CoL1a1、TGF-β1、α-SMA的mRNA 表達。如圖6所示，相較于其他兩組，（MI+MN-Ni）組中與纖維化相關的POSTN、CoL1a1、TGF-β1的 mRNA表達水平顯著降低。然而各組間與炎癥相關的TNF-α、IL6、IL10、IL1β的mRNA表達水平并無明顯差異，這說明本研究中的微針貼片具有良好生物相容性，通過微針貼片局部遞送抗纖維化藥物的治療策略安全有效，不會加重局部組織的炎癥反應。
圖6
各組纖維化相關因子及炎癥因子RT-qPCR檢測結果
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3 討論
心梗后大量心肌細胞缺血壞死，梗死區心肌細胞最終被成纖維細胞產生的纖維疤痕所取代。雖然最初的修復性纖維化對于預防心室壁破裂至關重要，但持續過度的纖維化使得心室壁的機械應力增加，最終導致心室腔順應性的改變和心衰的發生[15-16]。本研究構建了一種負載尼洛替尼的GelMA微針貼片，在心梗后心臟修復的疤痕成熟期將其貼附于受損心肌表面，局部遞送抗纖維化藥物至梗死及梗死周圍區。本研究結果表明，載藥微針貼片治療可有效抑制心梗后心肌纖維化擴張，減輕心肌肥大，從而改善預后。
尼洛替尼是一種新型酪氨酸激酶抑制劑，最初主要用于治療慢性粒細胞性白血病。然而越來越多的研究發現，尼洛替尼還可以用于治療纖維化相關疾病，其主要是通過阻斷MAPKs、血小板衍生生長因子等信號通路來阻止纖維化的發生及發展[17-20]。但是，既往臨床試驗發現，全身給藥的治療方式常常引起骨髓抑制、皮疹及肝功能受損等不良反應[21]。因此，本研究選擇了一種更安全高效的給藥策略，將含有尼洛替尼的GelMA預聚物溶液制成微針貼片的針尖，不含尼洛替尼的GelMA預聚物溶液制成微針貼片的背襯層，借助合成的微針貼片作為局部給藥的載藥平臺。微針貼片的針尖插入局部心臟組織后能夠吸收組織間液并發生溶脹、降解、釋放藥物分子，從而實現抗纖維化藥物的局部給藥治療，避免了全身給藥帶來的藥物不良反應。
微針貼片治療作為一種新興且微創的給藥方式，其針尖可以穿透表皮層進入深部組織，靶向局部組織釋放藥物，目前已應用于創面愈合、疫苗注射、表面麻醉等方面[22-23]。微針貼片用于治療時的材料安全性和藥物遞送持續性是其作為良好載藥平臺的關鍵，本研究選擇了GelMA作為微針貼片的合成材料，其具有以下優勢：藥物釋放行為的可控性，可通過改變交聯度調整藥物釋放速率，實現緩慢持續給藥；生物可降解性，釋放藥物后可自行溶脹或降解；生物相容性，不會引起組織排異反應[24-26]。在心梗后抗纖維化治療中，負載尼洛替尼的微針貼片不僅可以為受損心肌提供機械支持[13]，還可以向梗死區及周圍區局部遞送藥物長達至少15 d，具有抑制心肌纖維化、改善心室重構、預防心功能惡化的治療潛能。
在細胞水平，TGF-β信號通路在心梗后心肌纖維化修復過程中起著重要作用，可調節多種生物過程，如細胞外基質的合成、細胞的生長分化和炎癥的浸潤[27-28]。既往研究證據表明，心肌損傷后，TGF-β1可以通過TGF-β1/Smad經典途徑和MAPKs的非經典途徑來調控心肌纖維化[29-31]。在肝纖維化模型中，給予尼洛替尼治療后，血液中纖維化相關標志物降低，結果顯示其主要是通過抑制TGF-β1激活下游的胞外蛋白激酶和蛋白激酶B來減少纖維化的[32]。在本研究中，WB結果同樣觀察到（MI+MN-Ni）組TGF-β1的表達顯著低于（MI對照）組及（MI+MN）組。因此，本文推測給予尼洛替尼治療可抑制酪氨酸激酶活化，從而下調TGF-β1的表達，減少心肌纖維化，預防不良心室重構。
4 結論
本研究構建了一種負載尼洛替尼的生物相容性GelMA微針貼片，該微針貼片可提供一定強度的機械支持，避免心臟破裂的發生，同時還可實現靶向梗死心肌及周圍區的局部藥物遞送。結果表明該治療策略可有效抑制心梗后心肌纖維化擴張，減輕心肌肥大，改善心功能。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：彭寧馨為本研究執行人，完成論文初稿的寫作與修改；謝峻指導研究設計和論文寫作，提出修改意見。
倫理聲明：本研究通過了南京醫科大學鼓樓臨床醫學院倫理委員會的審批（批文編號：20201015）
0 引言
心肌梗死（myocardial infarction，MI）（簡稱：心梗）是指冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，作為全球范圍內高發病率和高致死率的主要疾病之一，其不良預后與心梗后心力衰竭（簡稱：心衰）的發生密切相關。歐美地區數據提示，即使經過積極血運重建和術后強化藥物治療，心梗后一個月到6、7 年內，心衰發生率為13.1%～37.5% [1-2]。在我國心梗患者中，心梗后心衰的發病率同樣很高，而心梗后心衰的發生使得患者短期及長期的死亡風險明顯增加且預后差[3]。心室重構是心梗后心衰的主要病理特征，通常認為心梗后心臟的修復分為三個階段，即炎癥期、修復期及成熟期[4]。在修復期，生理性纖維化過程有助于心梗疤痕的形成，防止心臟破裂的發生。而最新研究發現，在成熟期成纖維細胞的持續活化及梗死周圍區的纖維化過度擴張是導致不良心室重構和心功能惡化的主要原因[5-6]。遺憾的是，目前臨床上用于預防心室重構的藥物，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑等，只能部分和間接地抑制心肌纖維化[7-9]。因此，尋找有效的治療策略來抑制心梗后心肌過度纖維化對于改善心梗患者遠期預后有著重要的臨床意義。
在心梗后組織修復的增殖階段，包括轉化生長因子—β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路、Wnt信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號通路、磷脂酰肌醇—3—激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB）信號通路中多種細胞因子參與了心肌纖維化的形成。其中MAPKs信號通路、PI3K/PKB信號通路是非受體酪氨酸激酶經典通路，在心肌纖維化中起著關鍵作用[10]。因此，尼洛替尼（nilotinib，Ni）作為小分子酪氨酸激酶抑制劑可作用于這些信號通路，通過選擇性抑制酪氨酸激酶活性來阻斷下游信號傳導，從而直接抑制心梗后纖維化過度激活，改善不良心室重構。但是，廣泛的抗纖維化治療不利于疤痕的形成和室壁結構的穩定[11-12]。因此，本研究希望探索一種新的治療策略，實現局部遞送尼洛替尼抗纖維化的同時維持室壁穩定。既往研究發現，心梗后給予心臟微針貼片（microneedle，MN）治療可使梗死區室壁厚度增加，從而預防心室不良擴張，避免心臟破裂的發生[13] 。所以，本研究開發了一種負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）微針貼片，靶向局部心肌遞送抗纖維化藥物，期望最終可以實現為梗死區心肌提供一定強度機械支持的同時，有效抑制心肌纖維化，從而改善心梗后心功能惡化。
1 方法和材料
1.1 實驗動物
本研究經南京醫科大學鼓樓臨床醫學院倫理委員會審核批準，可開展全文實驗（批準號20201015）。首先，于斯貝福（北京）生物技術有限公司購得15只雄性斯潑累格·多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠（200～220 g，6～7周齡），每個籠子飼養5只SD大鼠，均在標準條件下飼養（溫度22～24 °C，濕度（50 ± 5）%，光照時刻為8：00～20：00），可自由進食和飲水。
1.2 載藥微針貼片制備
1.2.1 甲基丙烯酰化明膠制備
明膠經過甲基丙烯酸改性合成GelMA，其合成步驟如下：首先將10 g 明膠［購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］加入100 mL磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），并在60 ℃下持續攪拌直至完全溶解，然后將10 mL甲基丙烯酸酐［購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］逐滴加入到明膠溶液中，并在60 ℃下加熱2 h后，加入預熱的PBS（60 ℃），隨后繼續攪拌1～2 h。之后將所得溶液倒入透析袋中，在60 ℃下透析7 d以除去過量的甲基丙烯酸酐，最后冷凍干燥后得到的GelMA保存于?20 ℃備用。
1.2.2 負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠微針貼片制備
將1 mg尼洛替尼固體原料藥（購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司）溶于GelMA預聚物質量濃度為30%、2—羥基—2—甲基苯丙酮［購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］體積濃度為1%的溶液中，然后滴入聚二甲基硅氧烷微針貼片模具（385個錐形陣列，直徑17.5 mm，每個錐形微針針尖長度570 μm），之后通過離心除去錐形微針針尖腔中的空氣，并將混合溶液填充入腔內。隨后，將GelMA質量濃度為30% 不含尼洛替尼的預聚物溶液作為背襯材料加入模具中。最終，復合預聚物溶液經紫外光（365 nm）固化，干燥脫模后可得到負載尼洛替尼的GelMA微針貼片。微針貼片的電鏡圖像由掃描電子顯微鏡JSM-IT200[捷歐路（北京）科貿有限公司，中國]拍攝得到。
1.2.3 負載羅丹明B的甲基丙烯酰化明膠微針貼片制備
同樣地，將0.5 mg的羅丹明B固體原料藥（購于巴斯夫生物科技有限公司）溶于GelMA預聚物質量濃度為30%、2—羥基—2—甲基苯丙酮體積濃度為1%的溶液中，然后滴入聚二甲基硅氧烷微針貼片模具，除去錐形微針針尖腔中的空氣后，加入質量濃度為30% 的GelMA預聚物溶液作為微針貼片背襯溶液。最后，通過固化、干燥和脫模獲得負載羅丹明B的GelMA 微針貼片。微針貼片的電鏡圖像由掃描電子顯微鏡JSM-IT200［捷歐路（北京）科貿有限公司，中國］拍攝得到。
1.3 大鼠心梗模型制備
用戊巴比妥將SD大鼠麻醉后，行氣管插管并連接到呼吸機輔助通氣。SD大鼠取仰臥位固定，常規備皮、消毒、鋪巾后，從SD大鼠左胸第四肋間間隙做橫形切口打開胸腔，撕開心包膜充分暴露心臟，用6-0縫合線結扎近端冠狀動脈左前降支，通過觀察結扎部位下方心肌顏色由紅色變為蒼白和隨后的超聲心動圖檢測來確認心梗模型造模成功。
1.4 分組及載藥微針貼片治療
心梗造模成功的15只SD大鼠隨機分為：心梗對照（MI對照）組、空白微針貼片（MI+MN）組和載藥微針貼片（MI+MN-Ni）組，每組5只。①（MI對照）組：心梗造模后不予任何處理；②（MI+MN）組：心梗造模后10 d給予空白微針貼片治療；③（MI+MN-Ni）組：心梗造模后10 d給予負載尼洛替尼的微針貼片治療。在心梗造模后7 d對所有大鼠進行超聲心動圖檢查。在心梗造模后10 d，即心梗疤痕基本成熟后，于（MI+MN）組和（MI+MN-Ni）組再次行開胸手術，將GelMA微針貼片貼附于梗死區及梗死周圍區的心外膜表面。在心梗造模后28 d，所有大鼠完成最后一次超聲心動圖檢查后，通過腹主動脈收集大鼠外周血，完整取下大鼠的心臟并稱重，之后分別用于蘇木精—伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining，HE）染色、天狼星紅染色、小麥胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色。脛骨和肺也被取下用于測量脛骨長度、肺濕重及肺干重。所有大鼠行安樂死處理。
1.5 心功能評估
在心梗造模前、心梗造模后7 d和心梗造模后28 d行超聲心動圖檢查，通過二維超聲檢測左心室短軸斷面，M型超聲檢測觀察左心室的運動情況以評估心臟功能。采用盲法分析和評估所有超聲心動圖結果，即不考慮每只動物給予的處理。收集的外周血在3 000 g下離心15 min以獲得血漿，之后通過酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒［購于艾博抗（上海）貿易有限公司］測定血漿腦型利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平。
1.6 心肌纖維化染色觀察
將本文1.4小節摘取的心臟組織部分用石蠟包埋后切片行HE染色，部分石蠟包埋后切片用天狼星紅染色試劑盒[購于艾博抗（上海）貿易有限公司]進行天狼星紅染色。天狼星紅染色在光學顯微鏡下觀察可見：膠原纖維被染成紅色、心肌纖維染成粉紅色。
1.7 相關蛋白纖維化檢測
取本文1.4小節摘取的各組心臟組織的梗死區及梗死周圍區冰凍標本勻漿，隨后加入裂解液提取總蛋白，經過聚丙烯酰胺凝膠（10%～12%分離膠，5%濃縮膠）電泳分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜。之后將聚偏二氟乙烯膜放置于5%脫脂奶中封閉2 h，加入1：1 000稀釋的α—平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）一抗、骨膜蛋白（periostin，POSTN）一抗、Ⅰ型TGF-β（TGF-β1）一抗，4 ℃孵育過夜，加入三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液和吐溫-20緩沖液洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，常溫孵育2 h。聚偏二氟乙烯膜使用蛋白免疫印跡（western blot，WB）增強化學發光試劑盒［購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司］染色并發光成像，通過計算α-SMA、POSTN、TGF-β1分別與β—肌動蛋白（β-actin）條帶的平均灰度比值來評定相對蛋白表達水平。WB圖像由全自動化學發光成像系統Tanon 5200（上海天能生命科學有限公司，中國）拍攝。
1.8 免疫熒光觀察心肌細胞改變
將本文1.4小節摘取的心臟組織冰凍切片用于WGA染色。室溫下將切片用4%的多聚甲醛固定液固定10 min，隨后在PBS中洗滌切片3次，每次5 min。將WGA[購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司]在PBS中稀釋至濃度為5.0 μg/mL，于室溫下避光孵育10 min。再次洗滌后，將4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在PBS中稀釋至濃度為0.1 μg/mL，于室溫下染色15 min，最后通過共聚焦激光掃描顯微鏡SP5（Leica microsystems Inc.，德國）拍攝免疫熒光的圖像。
1.9 心肌組織中核糖核酸的表達檢測比較
取本文1.4小節摘取的各組梗死區及梗死周圍區心臟組織少許，用新型總核糖核酸（RNA）提取試劑（購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司）提取總RNA，之后用分光光度計NanoDrop2000（Thermo Fisher Scientific Inc.，美國 ）測定RNA濃度，使用HiScript Q RT SuperMix試劑盒(購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司)逆轉錄為互補脫氧核糖核酸。最后使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒(購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR），并使用RT-qPCR檢測系統Q5（Applied Biosystems Inc.，德國）進行檢測編碼α-SMA、TGF-β1、POSTN、Ⅰ型膠原α1（collagen type I alpha 1，COL1a1）、白介素1β（Interleukin 1 beta，IL1β）、白介素6（Interleukin 6，IL6）、白介素10（Interleukin 10，IL10）、腫瘤壞死因子—α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）的基因相對于甘油醛—3—磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的基因表達，如表1所示。
表1
RT-qPCR合成的引物序列
Table1.
Primer sequences for RT-qPCR synthesis
1.10 統計學方法
2 結果
2.1 負載尼洛替尼的甲基丙烯酰化明膠微針貼片的表型特征
GelMA微針貼片通過脫模獲得，如圖1所示，其在干燥過程中逐漸自然彎曲成弧形，有利于其在治療過程中更加貼合心臟表面。每個微針貼片尖端均以圓錐形整齊排列，總共約有385個微針排列成直徑為17.5 mm的均勻圓形貼片，單個針尖的高度約為570 μm。
圖1
微針貼片圖片、針尖長度及微針貼片負載羅丹明B隨時間釋放率曲線
Figure1.
The images of microneedle，microneedle tips size and release performance of loaded Rhodamine B
為了檢測GelMA 微針貼片的藥物負載和釋放性能，本研究使用羅丹明B作為模型藥物將其載入微針針尖中，隨后將負載羅丹明B的GelMA微針貼片浸入PBS中，定量PBS中隨著時間推移釋放的羅丹明B濃度變化，如圖1所示，負載的羅丹明B可以從GelMA 微針貼片持續釋放至少15 d。
2.2 載藥微針貼片治療改善心梗后心功能惡化
本研究通過超聲心動圖評估心梗大鼠治療前后心功能變化，如圖2所示，在心梗造模后7 d，三組大鼠的心功能均較心梗造模前明顯下降，且給予治療前各組間大鼠心梗程度無明顯差異。在心梗造模后10 d再次開胸，給予（MI+MN）組、（MI+MN-Ni）組心臟微針貼片治療。如圖2所示，心梗造模后28 d，在（MI+MN）組及（MI+MN-Ni）組中，兩組大鼠的左室射血分數（left ventricular ejection fractions，LVEF）和左室短軸縮短率（left vascular farction shortening，LVFS）不再下降，與（MI對照）組相比呈上升趨勢，且（MI+MN-Ni）組的上升趨勢優于（MI+MN）組。此外，本研究還檢測了與心衰嚴重程度相關的指標血漿BNP，如圖2所示，在治療結束時（MI+MN-Ni）組BNP水平明顯低于（MI對照）組或（MI+MN）組。
圖2
（MI對照）組、（MI+MN）組、（MI+MN-Ni）組LVFS和LVEF及各組BNP *P<0.05
Figure2.
LVFS, LVEF and BNP of MI control group, MI+MN group and MI+MN-Ni group *P<0.05
2.3 載藥微針貼片治療改善心梗后心肌細胞肥大
本研究通過測量并計算心重/體重比（heart weight to body weight ratio，HW/BW）、心重/脛骨長度比（heart weight to tibial length ratio，HW/TL）（單位：g/mm）及肺濕重/肺干重比（lung wet-to-dry weight ratio，lung wet/dry）來評價治療后左室重構的情況。如圖3所示，與（MI對照）組、（MI+MN）組相比，給予負載尼洛替尼的微針貼片治療后，（MI+MN-Ni）組心臟肥厚明顯改善。
圖3
各組HW/BW、HW/TL及肺濕重/肺干重比
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此外，本研究還通過DAPI和WGA染色來進一步觀察心肌細胞肥大情況，并定量心肌細胞橫截面積（cross section area，CSA），如圖4所示，空白微針貼片治療可以減少CSA，而負載尼洛替尼的微針貼片可使CSA進一步減少。
圖4
各組WGA染色及CSA結果
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2.4 載藥微針貼片治療減少心梗后心肌纖維化
本研究通過HE染色和天狼星紅染色來評估各組心肌纖維化程度。如圖5所示，與（MI對照）組相比，（MI+MN）組纖維化面積更少，而給予載藥微針貼片治療的（MI+MN-Ni）組纖維化面積顯著下降。此外，通過WB實驗可以觀察到，（MI+MN）組及（MI+MN-Ni）組梗死周圍區心肌中POSTN、TGF-β1的蛋白表達水平較（MI對照）組相比均有下降，且（MI+MN-Ni）組比（MI+MN）組下降更明顯。而α-SMA的蛋白表達水平在三組間未見明顯差異，這可能與α-SMA不僅在肌成纖維細胞中表達，而且也在血管平滑肌細胞以及周細胞中都有表達有關[14]。
圖5
各組心臟HE染色、天狼星紅染色及WB結果
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此外，本研究還通過RT-qPCR 分析了各組心臟組織中 POSTN、CoL1a1、TGF-β1、α-SMA的mRNA 表達。如圖6所示，相較于其他兩組，（MI+MN-Ni）組中與纖維化相關的POSTN、CoL1a1、TGF-β1的 mRNA表達水平顯著降低。然而各組間與炎癥相關的TNF-α、IL6、IL10、IL1β的mRNA表達水平并無明顯差異，這說明本研究中的微針貼片具有良好生物相容性，通過微針貼片局部遞送抗纖維化藥物的治療策略安全有效，不會加重局部組織的炎癥反應。
圖6
各組纖維化相關因子及炎癥因子RT-qPCR檢測結果
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3 討論
心梗后大量心肌細胞缺血壞死，梗死區心肌細胞最終被成纖維細胞產生的纖維疤痕所取代。雖然最初的修復性纖維化對于預防心室壁破裂至關重要，但持續過度的纖維化使得心室壁的機械應力增加，最終導致心室腔順應性的改變和心衰的發生[15-16]。本研究構建了一種負載尼洛替尼的GelMA微針貼片，在心梗后心臟修復的疤痕成熟期將其貼附于受損心肌表面，局部遞送抗纖維化藥物至梗死及梗死周圍區。本研究結果表明，載藥微針貼片治療可有效抑制心梗后心肌纖維化擴張，減輕心肌肥大，從而改善預后。
尼洛替尼是一種新型酪氨酸激酶抑制劑，最初主要用于治療慢性粒細胞性白血病。然而越來越多的研究發現，尼洛替尼還可以用于治療纖維化相關疾病，其主要是通過阻斷MAPKs、血小板衍生生長因子等信號通路來阻止纖維化的發生及發展[17-20]。但是，既往臨床試驗發現，全身給藥的治療方式常常引起骨髓抑制、皮疹及肝功能受損等不良反應[21]。因此，本研究選擇了一種更安全高效的給藥策略，將含有尼洛替尼的GelMA預聚物溶液制成微針貼片的針尖，不含尼洛替尼的GelMA預聚物溶液制成微針貼片的背襯層，借助合成的微針貼片作為局部給藥的載藥平臺。微針貼片的針尖插入局部心臟組織后能夠吸收組織間液并發生溶脹、降解、釋放藥物分子，從而實現抗纖維化藥物的局部給藥治療，避免了全身給藥帶來的藥物不良反應。
微針貼片治療作為一種新興且微創的給藥方式，其針尖可以穿透表皮層進入深部組織，靶向局部組織釋放藥物，目前已應用于創面愈合、疫苗注射、表面麻醉等方面[22-23]。微針貼片用于治療時的材料安全性和藥物遞送持續性是其作為良好載藥平臺的關鍵，本研究選擇了GelMA作為微針貼片的合成材料，其具有以下優勢：藥物釋放行為的可控性，可通過改變交聯度調整藥物釋放速率，實現緩慢持續給藥；生物可降解性，釋放藥物后可自行溶脹或降解；生物相容性，不會引起組織排異反應[24-26]。在心梗后抗纖維化治療中，負載尼洛替尼的微針貼片不僅可以為受損心肌提供機械支持[13]，還可以向梗死區及周圍區局部遞送藥物長達至少15 d，具有抑制心肌纖維化、改善心室重構、預防心功能惡化的治療潛能。
在細胞水平，TGF-β信號通路在心梗后心肌纖維化修復過程中起著重要作用，可調節多種生物過程，如細胞外基質的合成、細胞的生長分化和炎癥的浸潤[27-28]。既往研究證據表明，心肌損傷后，TGF-β1可以通過TGF-β1/Smad經典途徑和MAPKs的非經典途徑來調控心肌纖維化[29-31]。在肝纖維化模型中，給予尼洛替尼治療后，血液中纖維化相關標志物降低，結果顯示其主要是通過抑制TGF-β1激活下游的胞外蛋白激酶和蛋白激酶B來減少纖維化的[32]。在本研究中，WB結果同樣觀察到（MI+MN-Ni）組TGF-β1的表達顯著低于（MI對照）組及（MI+MN）組。因此，本文推測給予尼洛替尼治療可抑制酪氨酸激酶活化，從而下調TGF-β1的表達，減少心肌纖維化，預防不良心室重構。
4 結論
本研究構建了一種負載尼洛替尼的生物相容性GelMA微針貼片，該微針貼片可提供一定強度的機械支持，避免心臟破裂的發生，同時還可實現靶向梗死心肌及周圍區的局部藥物遞送。結果表明該治療策略可有效抑制心梗后心肌纖維化擴張，減輕心肌肥大，改善心功能。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：彭寧馨為本研究執行人，完成論文初稿的寫作與修改；謝峻指導研究設計和論文寫作，提出修改意見。
倫理聲明：本研究通過了南京醫科大學鼓樓臨床醫學院倫理委員會的審批（批文編號：20201015）
