本文旨在篩選干擾素（IFN）治療應答不同的慢性乙型肝炎（CHB）患者間IFN通路的差異表達基因，明確IFN療效不佳的可能宿主因素，并探索干擾素功能分類基因芯片在預測干擾素治療CHB患者療效中的應用前景。從我院干擾素治療隊列中隨機選取有應答CHB患者（Rs）、無應答CHB患者（NRs）各3例，在健康體檢者中招募受試者3例，利用IFN功能分類基因芯片檢測Peg-IFN-α 2a治療前后CHB患者及健康對照者外周血單個核細胞（PBMCs）中IFN相關基因的表達水平。結果發現，與IFN治療前相比，治療后Rs組IFN通路相關的差異表達基因數量多于NRs組。與健康對照者相比，Rs和NRs在治療前的IFNG、IL7R、IRF1和IRF8均下調；CXCL10、IFIT1、IFITM1在Rs中上調；IL13RA1和IFI35在NRs中上調，IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1和ADAR在NRs中下調。Rs組與NRs組相比，IL15、IFI35和IFI44分子的表達分別下調4.09（t = 10.58，P < 0.001）、5.59（t = 3.37，P = 0.028）和10.83（t = 2.8，P = 0.049）倍。綜上，在接受Peg-IFN-α 2a治療的CHB患者中，IFN功能分類基因芯片能通過檢測PBMC中的IFN相關基因表達水平評估治療后IFN通路的激活情況，可用于預測IFN療效；治療前CXCL10、IFIT1和IFITM1的高表達可能提示IFN療效良好；IL13RA1、IL15、IFI35和IFI44分子的高表達和IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1及ADAR分子的低表達可能提示患者IFN療效不佳。
引用本文： 王嘉毅, 盧家桀, 周宸, 杜凌遙, 唐紅. 干擾素相關基因芯片在預測干擾素治療慢乙肝患者療效中的應用探索. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(1): 79-86. doi: 10.7507/1001-5515.202301014 復制
0 引言
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個世界范圍內的重大公共衛生問題，全球約有2.96億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死于HBV感染相關疾病，如肝硬化和肝細胞癌[1]。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的有效抗病毒治療可通過最大限度地長期抑制HBV復制，減輕肝臟炎癥和壞死，從而降低并發癥的發生率并提高患者的生存率[2]。當前核苷（酸）類似物（nucleoside/nucleotide analogues，NAs）和聚乙二醇干擾素-α（peginterferon-α，Peg-IFN-α）是推薦的抗HBV藥物[3]，其中Peg-IFN-α具有療程有限、無耐藥風險、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）血清轉化率相對較高且更加持久等優點[4]。然而現有臨床數據表明，目前IFN的抗病毒有效率，尤其血清學轉化率并不令人滿意。既往研究報道，接受Peg-IFN-α治療的患者HBeAg血清轉化率較低，HBsAg血清轉化率也不佳[5-7]。因此，提高CHB患者對IFN-α的應答率是目前臨床面臨的重要問題。
生理條件下，體內IFN-α表達水平較低，病毒感染可刺激細胞產生大量Ⅰ型IFN，Ⅰ型IFN通過Ⅰ型IFN受體激活細胞內信號通路，誘導抗病毒基因的表達，這些基因被翻譯成抗病毒蛋白發揮抑制或清除病毒的作用[8-9]。導致IFN-α治療失敗的分子機制尚不清楚，但有證據表明病毒和宿主因素均在其中起到重要作用。病毒因素包括HBV基因型、HBV基因組內的突變和病毒載量的基線水平等。如感染了HBV-C和D基因型的個體、HBV在前核心和/或基礎核心啟動子區域有突變、基線病毒載量較高的患者更有可能對IFN-α治療應答不佳。除病毒因素外，宿主因素在CHB患者對IFN-α治療的應答率方面也起著同樣關鍵的作用。部分宿主因子可以通過抑制IFN產生或干擾IFN相關信號通路影響IFN-α的療效[10]，因此探明對IFN療效產生重要影響的宿主因子能夠為CHB患者接受IFN-α治療前預測療效提供一定幫助。功能分類基因芯片是一種研究功能基因表達模式的有效手段，本研究采用此方法分析并對比了IFN-α治療有應答和無應答CHB患者在治療前后，以及CHB患者治療前與健康對照者之間的IFN通路相關基因的表達水平和差異表達情況，篩選與IFN-α治療應答不佳相關的宿主因子，從而探索干擾素功能分類基因芯片在預測干擾素治療CHB患者療效中的應用前景，識別靶向干預的關鍵位點，為進一步優化干擾素療效的靶向干預策略提供理論支撐。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入在2021年1月至2022年6月間在四川大學華西醫院感染性疾病中心就診的接受干擾素治療的CHB患者，建立干擾素診療臨床隨訪隊列。隊列納入標準：① 患有乙型肝炎6個月及以上，治療前均為HBeAg陽性，診斷標準采用《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[11]中確立的臨床診斷標準；② 四川大學華西醫院為首診醫院，以確保患者就診前未接受其他抗病毒治療；③ 符合IFN-α抗病毒治療標準。排除標準：① 過去6個月內曾接受抗病毒或免疫抑制治療；② 合并自身免疫性疾病或其他類型肝炎病毒感染者；③ 曾存在血細胞減少癥或失代償性肝病。研究方案經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會批準［2019年臨床試驗（上市）審（28）號］。全部患者均簽署知情同意書。
在建立的隊列中匹配選擇對Peg-IFN-α 2a有應答的CHB男性患者、無應答的CHB男性患者各3例，在體檢中心匹配健康體檢男性3例作為對照組。CHB患者的治療方案均采用Peg-IFN-α 2a（Roche Pharma Ltd.，瑞士）180 μg，每周皮下注射一次，持續48周。根據隨訪結果，對Peg-IFN-α 2a有應答者（Rs）定義為治療結束后12周內谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）恢復正常和HBeAg發生血清學轉換，且無法檢測到HBV-DNA（最低檢測限為1 × 102 IU/mL）；無應答者（NRs）定義為未達到上述標準。為排除性別、年齡、病程及病情嚴重程度等影響，研究團隊對最終納入分析的三組參與者的年齡、性別等因素進行了匹配，保持了同質性（P > 0.05），Rs組和NRs組患者感染HBV的基因分型均為B型，治療前ALT水平和HBV-DNA水平的差異無統計學意義（P > 0.05），納入患者的臨床基線指標及病毒學指標見附表1。
表1
CHB患者治療前后的基因差異表達情況
Table1.
Differentially expressed genes in CHB patients before and after treatment
1.2 主要材料
所用芯片為美國SABioscience公司生產的功能分類基因芯片RT2 Profiler? PCR Array Human Interferons & Receptors（PAHS-064Z，Qiagen，美國），其中包括IFN基因、干擾素受體（interferon-α/β receptor，IFNAR）基因、干擾素調節因子（interferon regulatory factor，IRF）基因和干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISGs）等84個基因，每張芯片包含5個獨立的管家基因（ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH和RPLP0），用于樣本數據的標準化。
1.3 方法
1.3.1 人外周血單核細胞的分離
在無菌條件下采集入選的6例CHB患者治療前（時間編號為A）和治療48周后（時間編號為B）的外周靜脈血，以及入選的3例健康對照的外周靜脈血樣本，用Ficoll分離液分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌后取細胞沉淀，–80℃保存備用。
1.3.2 RNA的提取與純化
采用Trizol試劑（Invitrogen，美國）從PBMC樣本中提取總RNA，使用NanoDrop? ND-1000測定RNA濃度和純度，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，美國）進一步純化總RNA。通過變性瓊脂糖凝膠電泳評估樣品RNA的質量。
1.3.3 逆轉錄-多聚酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）
將變形瓊脂糖凝膠電泳評估后符合標準的RNA樣本逆轉錄合成cDNA，反應體系為20 μL。將第一鏈cDNA與2 × SuperArray PCR master mix和ddH2O混合，并將混合物加入PCR芯片中。在ABI PRISM 7900系統（Applied Biosystems，美國）上進行PCR反應，獲得每個擴增產物的Ct值。PCR反應體系20 μL，反應條件：95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，進行40個循環。
1.4 統計學方法
用管家基因的Ct值歸一目標基因的Ct值，得到芯片中每個基因的ΔCt，用2-ΔΔCt方法將芯片數據進行針對管家基因的標準化。兩樣本之間各基因表達校正值的比值 ≥ 2.0為上調基因，≤ –2.0為下調基因。采用SPSS25.0軟件進行統計學處理，經正態分布檢驗，所得數據符合正態分布，組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 不同應答組在IFN治療前后IFN通路相關基因表達分析
與Peg-IFN-α 2a治療前相比，Rs組治療后出現了6個差異表達基因，包括4個上調基因和2個下調基因，其中腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADAR）、干擾素誘導蛋白6（interferon induced protein 6，IFI6）和干擾素刺激基因15（interferon-stimulated gene，ISG15）均為ISGs，且在治療后發生上調。NRs組治療后僅有1個基因表達與治療前有差異，為干擾素調節因子2結合蛋白1（interferon regulatory factor 2 binding protein 1，IRF2BP1），下調倍數為3.48（t = 7.88，P = 0.001）（見圖1、表1）。提示無應答患者在IFN治療過程中，IFN相關通路難以被激活。
圖1
Rs組和NRs組在Peg-IFN-α 2a治療前后的差異表達基因
a. 治療后/治療前基因表達差異熱圖；b. 治療后/治療前基因表達的火山圖：黑色實線代表前后基因改變倍數為1，粉色實線表示上調/下調倍數為2，藍色實線表示
a. heat map of differential gene expression in Rs and NRs (after/before treatment); b. volcano plot of gene expression (after/before treatment): black solid liner represents a gene change fold of 1, the pink solid line represents an upregulation/downregulation fold of 2, and the blue solid line represents
2.2 不同應答者在IFN治療前的IFN相關基因表達差異分析
與健康對照者相比，在Rs組治療前樣本中篩選出7個差異表達基因，其中3個為上調基因，4個為下調基因（見圖2b、表2）。上調的基因包括CXC趨化因子配體10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10，t = –4.58，P = 0.010）、具有四肽重復序列的干擾素誘導蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，IFIT1，t = –3.94，P = 0.017）和干擾素誘導的跨膜蛋白1（interferon-induced transmembrane protein 1，IFITM1，t = –14.3，P＜0.001）基因，下調的基因包括干擾素γ（interferon-gamma，IFNG，t = 2.79，P = 0.050）、白細胞介素7受體（interleukin 7 receptor，IL7R，t = 2.96，P = 0.042）、干擾素調節因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1，t = 3.93，P = 0.017）和IRF8（t = 3.96，P = 0.017）基因。
圖2
在Peg-IFN-α 2a治療前Rs和NRs與健康對照者相比的差異表達基因
a. 與健康對照相比，治療前Rs和NRs的下調基因韋恩圖；b. 治療前患者/健康對照者基因表達差異熱圖；c. 治療前患者/健康對照者基因表達的火山圖：其中黑色實線代表前后基因改變倍數為1，粉色實線表示上調/下調倍數為2，藍色實線表示
a. Wayne plot of downregulated genes in Rs and NRs comparing to healthy controls; b. heat map of differential gene expression of patients before treatment comparing to healthy controls; c. volcano plot of gene expression of patients before treatment comparing to healthy controls: black solid line represents a gene change fold of 1, the pink solid line represents an upregulation/downregulation fold of 2, and the blue solid line represents
表2
Rs組治療前與健康對照者比較的差異表達基因
Table2.
Baseline differentially expressed genes in Rs group before treatment comparing to healthy controls
與健康對照者相比，在NRs組治療前樣本中發現了13個差異表達基因，包括了2個上調基因和11個下調基因（見圖2b、表3）。其中上調基因為白細胞介素13受體α 1亞基基因（interleukin 13 receptor subunit alpha 1，IL13RA1）和IFI35，上調倍數分別為2.65（t = –3.42，P = 0.027）和4.49倍（t = –2.79，P = 0.049）。下調基因包括IFNG、干擾素相關生長調節因子2（interferon related developmental regulator 2，IFRD2）、IL11RA、IL4R、IL7R、IRF1、IRF3、IRF4、IRF8、Pyrin和HIN域家族成員1（pyrin and HIN domain family member 1，PYHIN1）和ADAR，其中IFNG、IL7R、IRF1和IRF8分子在Rs和NRs中均下調（見圖2a），提示HBV能夠抑制IFN通路的激活，并且在無應答患者中，該抑制作用更加明顯。
表3
NRs組治療前與健康對照者比較的差異表達基因
Table3.
Baseline differentially expressed genes in NRs group comparing to healthy controls
為進一步明確Peg-IFN-α 2a治療前的有應答者與無應答者的干擾素相關基因表達差異，并明確影響IFN療效的宿主因子，我們直接對比了Rs組和NRs組治療前樣本的差異表達基因，發現Rs組的IL15、IFI35和IFI44基因的表達較NRs組低，分別下調4.09（t = 10.58，P < 0.001）、5.59（t = 3.37，P = 0.028）和10.83（t = 2.80，P = 0.049）倍（見表4），其中IFI35和IFI44均為ISGs。說明部分ISGs（IFI35、IFI44）和IL15在IFN治療前的激活與IFN療效不佳相關。
表4
IFN-α有應答（Rs）與無應答者（NRs）比較治療前的差異表達基因
Table4.
Baseline differentially expressed genes in Rs and NRs before treatment
3 討論與結論
HBV感染機體后，被宿主免疫系統識別，與靶細胞相互作用，誘導宿主細胞產生一系列抗病毒應答反應，包括內源性IFN的產生。IFN的抗病毒作用主要是通過激活JAK-STAT信號轉導通路實現的。IFN-α主要激活Ⅰ型IFN通路，通過與IFNAR1和IFNAR2組成的異二聚體跨膜受體結合，激活Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2），進而磷酸化信號轉導和轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和STAT2分子，并促進STAT1和STAT2核轉位和與IRF9連接形成IFN刺激基因因子3（interferon stimulated gene factor 3，ISGF3）。ISGF3與IFN刺激的反應元件（IFN-stimulated response elements，ISRE）結合，導致ISGs的表達。以這種方式，IFN-α誘導大量ISGs表達，從而發揮抗病毒作用[12]。因此，IFN通路中相關基因的激活水平與IFN治療療效密切相關，深入探索其表達水平對研究療效預測措施與干預優化策略有重要的指導價值。
本研究應用IFN功能分類基因芯片對CHB患者及健康對照者PBMC中IFN相關的基因進行檢測，并進行了探索性分析。研究證實該基因芯片能夠較為快速且準確地利用患者PBMC識別患者治療前后IFN通路分子的激活情況，顯示關鍵基因的表達水平。通過自身前后對比分析，我們發現IFN療效不佳者其IFN相關基因在Peg-IFN-α 2a治療前后僅有IRF2BP1基因的表達出現差異，而IFN治療有效的CHB患者在治療后出現了6個IFN通路相關基因的表達差異，其中包括了干擾素受體基因（IFNGR2）、干擾素刺激基因（ADAR、IFI6、ISG15）、瘦素受體（leptin receptor，LEPR）和IL20RB基因，從分子水平證實了IFN無應答者在外源性IFN治療后，體內IFN相關通路難以被有效激活，因此出現應答不佳。我們推測這一現象可能與治療前無應答患者的IFN通路就處于抑制狀態有關。
為探究IFN治療無應答的CHB患者在治療前IFN通路是否處于抑制狀態，并篩選可能與IFN療效相關的宿主因子，本研究對比分析了IFN治療前組間基因的表達差異，從84個IFN相關基因中篩選出了Rs組的3個上調基因（CXCL10、IFIT1、IFITM1）和4個下調基因（IFNG、IL7R、IRF1、IRF8）。從NRs篩選出了2個上調基因（IFI35、IL13RA1）和11個下調基因（IFNG、IFRD2、IL11RA、IL4R、IL7R、IRF1、IRF3、IRF4、IRF8、PYHIN1和ADAR）。其中Rs和NRs組在IFN-α治療前的IFNG、IL7R、IRF1和IRF8的水平均低于健康對照組，這表明HBV感染能夠抑制部分IFN調節因子的表達；而除以上4個分子外，NRs組的IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1和ADAR分子在治療前的表達也較低，說明與應答患者相比，在治療前無應答患者的IFN通路處于更強的抑制狀態，因此出現應答不佳。IRF家族的轉錄因子參與Ⅰ型IFN通路的作用，既往研究發現IRF3是誘導內源性IFN-α表達的最重要的轉錄因子[13]，能夠促進內源性IFN的產生。本研究發現IFN治療無應答患者的IRF3表達顯著低于健康對照，說明無應答患者的內源性IFN產生能力降低，因此我們推測，當接受外源性IFN刺激后，由于大量IRFs被抑制，無應答者內源性IFN的產生可能大幅減少，從而難以激活IFN相關下游通路，宿主清除HBV的能力降低，并且該過程與IRF3、IRF4的低表達密切相關。PYHIN1能夠調節促炎細胞因子的基因啟動子，誘導促炎細胞因子IL-6和TNF-α的產生，從而發揮抗病毒作用，然而其在HBV中的作用仍有待探究[14]。ADAR是MDA5-MAVS抗病毒反應中的正調節因子[15]，但同時有研究提示IFN-α通過促進ADAR1的表達，抑制MAVS的抗HBV作用，因此有關ADAR的作用目前尚不明確，需進一步在臨床及基礎實驗中進行驗證[16]。除此之外，研究結果也提示CXCL10、IFIT1和IFITM1在治療前的高表達能夠在一定程度上預測患者接受IFN治療后可能應答更佳。既往研究發現，CXCL10是CHB疾病進展和治療反應的有效預測指標；IFIT1和IFITM1蛋白在抑制肝炎病毒復制中都起到了重要調節作用。CXCL10在血清和組織中的較高基線值與Peg-IFN治療后HBeAg的血清學轉換相關，可用于預測IFN治療CHB的療效[17]，與本研究的結果相符。IFIT1可通過抑制HBV和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的復制來限制HBV和HCV感染[18]，并且其多態性被證明與IFN治療CHB的療效相關[19]。IFITM1蛋白能夠通過破壞HCV輔助受體CD81和occludin的相互作用，發揮抗HCV的作用[20]，在HBV中的作用有待進一步探究。
無論是患者自身前后對照，還是不同應答組間比較分析，前述研究結果均提示：CHB患者治療前部分IFN通路相關基因的基線表達水平與療效相關，可以作為療效預測的指標。因此，為了進一步明確影響療效的關鍵宿主因子，我們比較分析了IFN治療前Rs和NRs的差異表達基因，發現NRs的IL15、IFI35和IFI44基因的表達顯著增高，其中IFI35和IFI44均屬于Ⅰ型IFN通路下游的ISGs，這提示在IFN治療前IFN信號通路的基礎激活狀態可能與CHB患者對IFN治療反應差有關。有研究表明，IFI35能夠負向調節視黃酸誘導基因（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）的抗病毒信號，并促進水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）在細胞中的復制[21]。IFI44分子被發現能夠限制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染[22]，在被HCV感染的細胞中則會抑制細胞的生長分裂[23]。然而，這些因子針對HBV感染的作用，以及是否在IFN通路的負性調控環節發揮作用，仍有待進一步探究。
綜上，本研究探索了IFN功能分類基因芯片在利用患者PBMC評估患者治療后IFN通路分子激活情況的應用，并發現HBV感染能夠抑制IFNG、IL7R及干擾素轉錄因子IRF1、IRF8的表達。研究篩選出了提升IFN治療CHB療效的正性調控因子CXCL10、IFIT1和IFITM1，它們在治療前的高表達可能提示IFN療效佳；IL13RA1、IL15、IFI35和IFI44分子的高表達和IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1及ADAR分子的低表達可能提示患者IFN療效不佳。本研究以健康人群為對照，在IFN治療有應答患者和無應答患者中，利用IFN相關基因芯片，篩選出了可能與IFN治療療效相關的IFN通路差異表達基因，識別出了與療效可能密切相關的基線宿主基因，有助于完善擬行干擾素治療患者的基線評估，優化治療策略，實現CHB患者的個體化與精準化管理。但干擾素相關通路涉及復雜的信號網絡，本研究樣本例數有限，所涉及的宿主因子僅有84個關鍵基因。未來仍需要擴大樣本進行探索，深入研究機制，并對研究發現的候選因子進行驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：王嘉毅主要負責實驗操作、數據分析、論文撰寫與修改；盧家桀主要負責實驗操作、數據記錄與分析、論文撰寫；周宸主要負責數據處理與分析、協助論文撰寫；杜凌遙主要負責數據管理與分析指導、論文修訂；唐紅主要負責實驗指導與安排、論文審閱修訂并提供基金支持。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審批［批文編號：2019年臨床試驗（上市）審（28）號］。
本文附表見本刊網站的電子版本（www.china-plum.com）。
0 引言
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個世界范圍內的重大公共衛生問題，全球約有2.96億慢性HBV感染者，每年約有88.7萬人死于HBV感染相關疾病，如肝硬化和肝細胞癌[1]。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的有效抗病毒治療可通過最大限度地長期抑制HBV復制，減輕肝臟炎癥和壞死，從而降低并發癥的發生率并提高患者的生存率[2]。當前核苷（酸）類似物（nucleoside/nucleotide analogues，NAs）和聚乙二醇干擾素-α（peginterferon-α，Peg-IFN-α）是推薦的抗HBV藥物[3]，其中Peg-IFN-α具有療程有限、無耐藥風險、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）血清轉化率相對較高且更加持久等優點[4]。然而現有臨床數據表明，目前IFN的抗病毒有效率，尤其血清學轉化率并不令人滿意。既往研究報道，接受Peg-IFN-α治療的患者HBeAg血清轉化率較低，HBsAg血清轉化率也不佳[5-7]。因此，提高CHB患者對IFN-α的應答率是目前臨床面臨的重要問題。
生理條件下，體內IFN-α表達水平較低，病毒感染可刺激細胞產生大量Ⅰ型IFN，Ⅰ型IFN通過Ⅰ型IFN受體激活細胞內信號通路，誘導抗病毒基因的表達，這些基因被翻譯成抗病毒蛋白發揮抑制或清除病毒的作用[8-9]。導致IFN-α治療失敗的分子機制尚不清楚，但有證據表明病毒和宿主因素均在其中起到重要作用。病毒因素包括HBV基因型、HBV基因組內的突變和病毒載量的基線水平等。如感染了HBV-C和D基因型的個體、HBV在前核心和/或基礎核心啟動子區域有突變、基線病毒載量較高的患者更有可能對IFN-α治療應答不佳。除病毒因素外，宿主因素在CHB患者對IFN-α治療的應答率方面也起著同樣關鍵的作用。部分宿主因子可以通過抑制IFN產生或干擾IFN相關信號通路影響IFN-α的療效[10]，因此探明對IFN療效產生重要影響的宿主因子能夠為CHB患者接受IFN-α治療前預測療效提供一定幫助。功能分類基因芯片是一種研究功能基因表達模式的有效手段，本研究采用此方法分析并對比了IFN-α治療有應答和無應答CHB患者在治療前后，以及CHB患者治療前與健康對照者之間的IFN通路相關基因的表達水平和差異表達情況，篩選與IFN-α治療應答不佳相關的宿主因子，從而探索干擾素功能分類基因芯片在預測干擾素治療CHB患者療效中的應用前景，識別靶向干預的關鍵位點，為進一步優化干擾素療效的靶向干預策略提供理論支撐。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入在2021年1月至2022年6月間在四川大學華西醫院感染性疾病中心就診的接受干擾素治療的CHB患者，建立干擾素診療臨床隨訪隊列。隊列納入標準：① 患有乙型肝炎6個月及以上，治療前均為HBeAg陽性，診斷標準采用《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[11]中確立的臨床診斷標準；② 四川大學華西醫院為首診醫院，以確保患者就診前未接受其他抗病毒治療；③ 符合IFN-α抗病毒治療標準。排除標準：① 過去6個月內曾接受抗病毒或免疫抑制治療；② 合并自身免疫性疾病或其他類型肝炎病毒感染者；③ 曾存在血細胞減少癥或失代償性肝病。研究方案經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會批準［2019年臨床試驗（上市）審（28）號］。全部患者均簽署知情同意書。
在建立的隊列中匹配選擇對Peg-IFN-α 2a有應答的CHB男性患者、無應答的CHB男性患者各3例，在體檢中心匹配健康體檢男性3例作為對照組。CHB患者的治療方案均采用Peg-IFN-α 2a（Roche Pharma Ltd.，瑞士）180 μg，每周皮下注射一次，持續48周。根據隨訪結果，對Peg-IFN-α 2a有應答者（Rs）定義為治療結束后12周內谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）恢復正常和HBeAg發生血清學轉換，且無法檢測到HBV-DNA（最低檢測限為1 × 102 IU/mL）；無應答者（NRs）定義為未達到上述標準。為排除性別、年齡、病程及病情嚴重程度等影響，研究團隊對最終納入分析的三組參與者的年齡、性別等因素進行了匹配，保持了同質性（P > 0.05），Rs組和NRs組患者感染HBV的基因分型均為B型，治療前ALT水平和HBV-DNA水平的差異無統計學意義（P > 0.05），納入患者的臨床基線指標及病毒學指標見附表1。
表1
CHB患者治療前后的基因差異表達情況
Table1.
Differentially expressed genes in CHB patients before and after treatment
1.2 主要材料
所用芯片為美國SABioscience公司生產的功能分類基因芯片RT2 Profiler? PCR Array Human Interferons & Receptors（PAHS-064Z，Qiagen，美國），其中包括IFN基因、干擾素受體（interferon-α/β receptor，IFNAR）基因、干擾素調節因子（interferon regulatory factor，IRF）基因和干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISGs）等84個基因，每張芯片包含5個獨立的管家基因（ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH和RPLP0），用于樣本數據的標準化。
1.3 方法
1.3.1 人外周血單核細胞的分離
在無菌條件下采集入選的6例CHB患者治療前（時間編號為A）和治療48周后（時間編號為B）的外周靜脈血，以及入選的3例健康對照的外周靜脈血樣本，用Ficoll分離液分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌后取細胞沉淀，–80℃保存備用。
1.3.2 RNA的提取與純化
采用Trizol試劑（Invitrogen，美國）從PBMC樣本中提取總RNA，使用NanoDrop? ND-1000測定RNA濃度和純度，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，美國）進一步純化總RNA。通過變性瓊脂糖凝膠電泳評估樣品RNA的質量。
1.3.3 逆轉錄-多聚酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）
將變形瓊脂糖凝膠電泳評估后符合標準的RNA樣本逆轉錄合成cDNA，反應體系為20 μL。將第一鏈cDNA與2 × SuperArray PCR master mix和ddH2O混合，并將混合物加入PCR芯片中。在ABI PRISM 7900系統（Applied Biosystems，美國）上進行PCR反應，獲得每個擴增產物的Ct值。PCR反應體系20 μL，反應條件：95 ℃ 10 min，隨后95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，進行40個循環。
1.4 統計學方法
用管家基因的Ct值歸一目標基因的Ct值，得到芯片中每個基因的ΔCt，用2-ΔΔCt方法將芯片數據進行針對管家基因的標準化。兩樣本之間各基因表達校正值的比值 ≥ 2.0為上調基因，≤ –2.0為下調基因。采用SPSS25.0軟件進行統計學處理，經正態分布檢驗，所得數據符合正態分布，組間差異比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 不同應答組在IFN治療前后IFN通路相關基因表達分析
與Peg-IFN-α 2a治療前相比，Rs組治療后出現了6個差異表達基因，包括4個上調基因和2個下調基因，其中腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADAR）、干擾素誘導蛋白6（interferon induced protein 6，IFI6）和干擾素刺激基因15（interferon-stimulated gene，ISG15）均為ISGs，且在治療后發生上調。NRs組治療后僅有1個基因表達與治療前有差異，為干擾素調節因子2結合蛋白1（interferon regulatory factor 2 binding protein 1，IRF2BP1），下調倍數為3.48（t = 7.88，P = 0.001）（見圖1、表1）。提示無應答患者在IFN治療過程中，IFN相關通路難以被激活。
圖1
Rs組和NRs組在Peg-IFN-α 2a治療前后的差異表達基因
a. 治療后/治療前基因表達差異熱圖；b. 治療后/治療前基因表達的火山圖：黑色實線代表前后基因改變倍數為1，粉色實線表示上調/下調倍數為2，藍色實線表示
a. heat map of differential gene expression in Rs and NRs (after/before treatment); b. volcano plot of gene expression (after/before treatment): black solid liner represents a gene change fold of 1, the pink solid line represents an upregulation/downregulation fold of 2, and the blue solid line represents
2.2 不同應答者在IFN治療前的IFN相關基因表達差異分析
與健康對照者相比，在Rs組治療前樣本中篩選出7個差異表達基因，其中3個為上調基因，4個為下調基因（見圖2b、表2）。上調的基因包括CXC趨化因子配體10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10，t = –4.58，P = 0.010）、具有四肽重復序列的干擾素誘導蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，IFIT1，t = –3.94，P = 0.017）和干擾素誘導的跨膜蛋白1（interferon-induced transmembrane protein 1，IFITM1，t = –14.3，P＜0.001）基因，下調的基因包括干擾素γ（interferon-gamma，IFNG，t = 2.79，P = 0.050）、白細胞介素7受體（interleukin 7 receptor，IL7R，t = 2.96，P = 0.042）、干擾素調節因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1，t = 3.93，P = 0.017）和IRF8（t = 3.96，P = 0.017）基因。
圖2
在Peg-IFN-α 2a治療前Rs和NRs與健康對照者相比的差異表達基因
a. 與健康對照相比，治療前Rs和NRs的下調基因韋恩圖；b. 治療前患者/健康對照者基因表達差異熱圖；c. 治療前患者/健康對照者基因表達的火山圖：其中黑色實線代表前后基因改變倍數為1，粉色實線表示上調/下調倍數為2，藍色實線表示
a. Wayne plot of downregulated genes in Rs and NRs comparing to healthy controls; b. heat map of differential gene expression of patients before treatment comparing to healthy controls; c. volcano plot of gene expression of patients before treatment comparing to healthy controls: black solid line represents a gene change fold of 1, the pink solid line represents an upregulation/downregulation fold of 2, and the blue solid line represents
表2
Rs組治療前與健康對照者比較的差異表達基因
Table2.
Baseline differentially expressed genes in Rs group before treatment comparing to healthy controls
與健康對照者相比，在NRs組治療前樣本中發現了13個差異表達基因，包括了2個上調基因和11個下調基因（見圖2b、表3）。其中上調基因為白細胞介素13受體α 1亞基基因（interleukin 13 receptor subunit alpha 1，IL13RA1）和IFI35，上調倍數分別為2.65（t = –3.42，P = 0.027）和4.49倍（t = –2.79，P = 0.049）。下調基因包括IFNG、干擾素相關生長調節因子2（interferon related developmental regulator 2，IFRD2）、IL11RA、IL4R、IL7R、IRF1、IRF3、IRF4、IRF8、Pyrin和HIN域家族成員1（pyrin and HIN domain family member 1，PYHIN1）和ADAR，其中IFNG、IL7R、IRF1和IRF8分子在Rs和NRs中均下調（見圖2a），提示HBV能夠抑制IFN通路的激活，并且在無應答患者中，該抑制作用更加明顯。
表3
NRs組治療前與健康對照者比較的差異表達基因
Table3.
Baseline differentially expressed genes in NRs group comparing to healthy controls
為進一步明確Peg-IFN-α 2a治療前的有應答者與無應答者的干擾素相關基因表達差異，并明確影響IFN療效的宿主因子，我們直接對比了Rs組和NRs組治療前樣本的差異表達基因，發現Rs組的IL15、IFI35和IFI44基因的表達較NRs組低，分別下調4.09（t = 10.58，P < 0.001）、5.59（t = 3.37，P = 0.028）和10.83（t = 2.80，P = 0.049）倍（見表4），其中IFI35和IFI44均為ISGs。說明部分ISGs（IFI35、IFI44）和IL15在IFN治療前的激活與IFN療效不佳相關。
表4
IFN-α有應答（Rs）與無應答者（NRs）比較治療前的差異表達基因
Table4.
Baseline differentially expressed genes in Rs and NRs before treatment
3 討論與結論
HBV感染機體后，被宿主免疫系統識別，與靶細胞相互作用，誘導宿主細胞產生一系列抗病毒應答反應，包括內源性IFN的產生。IFN的抗病毒作用主要是通過激活JAK-STAT信號轉導通路實現的。IFN-α主要激活Ⅰ型IFN通路，通過與IFNAR1和IFNAR2組成的異二聚體跨膜受體結合，激活Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2），進而磷酸化信號轉導和轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和STAT2分子，并促進STAT1和STAT2核轉位和與IRF9連接形成IFN刺激基因因子3（interferon stimulated gene factor 3，ISGF3）。ISGF3與IFN刺激的反應元件（IFN-stimulated response elements，ISRE）結合，導致ISGs的表達。以這種方式，IFN-α誘導大量ISGs表達，從而發揮抗病毒作用[12]。因此，IFN通路中相關基因的激活水平與IFN治療療效密切相關，深入探索其表達水平對研究療效預測措施與干預優化策略有重要的指導價值。
本研究應用IFN功能分類基因芯片對CHB患者及健康對照者PBMC中IFN相關的基因進行檢測，并進行了探索性分析。研究證實該基因芯片能夠較為快速且準確地利用患者PBMC識別患者治療前后IFN通路分子的激活情況，顯示關鍵基因的表達水平。通過自身前后對比分析，我們發現IFN療效不佳者其IFN相關基因在Peg-IFN-α 2a治療前后僅有IRF2BP1基因的表達出現差異，而IFN治療有效的CHB患者在治療后出現了6個IFN通路相關基因的表達差異，其中包括了干擾素受體基因（IFNGR2）、干擾素刺激基因（ADAR、IFI6、ISG15）、瘦素受體（leptin receptor，LEPR）和IL20RB基因，從分子水平證實了IFN無應答者在外源性IFN治療后，體內IFN相關通路難以被有效激活，因此出現應答不佳。我們推測這一現象可能與治療前無應答患者的IFN通路就處于抑制狀態有關。
為探究IFN治療無應答的CHB患者在治療前IFN通路是否處于抑制狀態，并篩選可能與IFN療效相關的宿主因子，本研究對比分析了IFN治療前組間基因的表達差異，從84個IFN相關基因中篩選出了Rs組的3個上調基因（CXCL10、IFIT1、IFITM1）和4個下調基因（IFNG、IL7R、IRF1、IRF8）。從NRs篩選出了2個上調基因（IFI35、IL13RA1）和11個下調基因（IFNG、IFRD2、IL11RA、IL4R、IL7R、IRF1、IRF3、IRF4、IRF8、PYHIN1和ADAR）。其中Rs和NRs組在IFN-α治療前的IFNG、IL7R、IRF1和IRF8的水平均低于健康對照組，這表明HBV感染能夠抑制部分IFN調節因子的表達；而除以上4個分子外，NRs組的IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1和ADAR分子在治療前的表達也較低，說明與應答患者相比，在治療前無應答患者的IFN通路處于更強的抑制狀態，因此出現應答不佳。IRF家族的轉錄因子參與Ⅰ型IFN通路的作用，既往研究發現IRF3是誘導內源性IFN-α表達的最重要的轉錄因子[13]，能夠促進內源性IFN的產生。本研究發現IFN治療無應答患者的IRF3表達顯著低于健康對照，說明無應答患者的內源性IFN產生能力降低，因此我們推測，當接受外源性IFN刺激后，由于大量IRFs被抑制，無應答者內源性IFN的產生可能大幅減少，從而難以激活IFN相關下游通路，宿主清除HBV的能力降低，并且該過程與IRF3、IRF4的低表達密切相關。PYHIN1能夠調節促炎細胞因子的基因啟動子，誘導促炎細胞因子IL-6和TNF-α的產生，從而發揮抗病毒作用，然而其在HBV中的作用仍有待探究[14]。ADAR是MDA5-MAVS抗病毒反應中的正調節因子[15]，但同時有研究提示IFN-α通過促進ADAR1的表達，抑制MAVS的抗HBV作用，因此有關ADAR的作用目前尚不明確，需進一步在臨床及基礎實驗中進行驗證[16]。除此之外，研究結果也提示CXCL10、IFIT1和IFITM1在治療前的高表達能夠在一定程度上預測患者接受IFN治療后可能應答更佳。既往研究發現，CXCL10是CHB疾病進展和治療反應的有效預測指標；IFIT1和IFITM1蛋白在抑制肝炎病毒復制中都起到了重要調節作用。CXCL10在血清和組織中的較高基線值與Peg-IFN治療后HBeAg的血清學轉換相關，可用于預測IFN治療CHB的療效[17]，與本研究的結果相符。IFIT1可通過抑制HBV和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的復制來限制HBV和HCV感染[18]，并且其多態性被證明與IFN治療CHB的療效相關[19]。IFITM1蛋白能夠通過破壞HCV輔助受體CD81和occludin的相互作用，發揮抗HCV的作用[20]，在HBV中的作用有待進一步探究。
無論是患者自身前后對照，還是不同應答組間比較分析，前述研究結果均提示：CHB患者治療前部分IFN通路相關基因的基線表達水平與療效相關，可以作為療效預測的指標。因此，為了進一步明確影響療效的關鍵宿主因子，我們比較分析了IFN治療前Rs和NRs的差異表達基因，發現NRs的IL15、IFI35和IFI44基因的表達顯著增高，其中IFI35和IFI44均屬于Ⅰ型IFN通路下游的ISGs，這提示在IFN治療前IFN信號通路的基礎激活狀態可能與CHB患者對IFN治療反應差有關。有研究表明，IFI35能夠負向調節視黃酸誘導基因（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）的抗病毒信號，并促進水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）在細胞中的復制[21]。IFI44分子被發現能夠限制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染[22]，在被HCV感染的細胞中則會抑制細胞的生長分裂[23]。然而，這些因子針對HBV感染的作用，以及是否在IFN通路的負性調控環節發揮作用，仍有待進一步探究。
綜上，本研究探索了IFN功能分類基因芯片在利用患者PBMC評估患者治療后IFN通路分子激活情況的應用，并發現HBV感染能夠抑制IFNG、IL7R及干擾素轉錄因子IRF1、IRF8的表達。研究篩選出了提升IFN治療CHB療效的正性調控因子CXCL10、IFIT1和IFITM1，它們在治療前的高表達可能提示IFN療效佳；IL13RA1、IL15、IFI35和IFI44分子的高表達和IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1及ADAR分子的低表達可能提示患者IFN療效不佳。本研究以健康人群為對照，在IFN治療有應答患者和無應答患者中，利用IFN相關基因芯片，篩選出了可能與IFN治療療效相關的IFN通路差異表達基因，識別出了與療效可能密切相關的基線宿主基因，有助于完善擬行干擾素治療患者的基線評估，優化治療策略，實現CHB患者的個體化與精準化管理。但干擾素相關通路涉及復雜的信號網絡，本研究樣本例數有限，所涉及的宿主因子僅有84個關鍵基因。未來仍需要擴大樣本進行探索，深入研究機制，并對研究發現的候選因子進行驗證。
重要聲明
利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：王嘉毅主要負責實驗操作、數據分析、論文撰寫與修改；盧家桀主要負責實驗操作、數據記錄與分析、論文撰寫；周宸主要負責數據處理與分析、協助論文撰寫；杜凌遙主要負責數據管理與分析指導、論文修訂；唐紅主要負責實驗指導與安排、論文審閱修訂并提供基金支持。
倫理聲明：本研究通過了四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會審批［批文編號：2019年臨床試驗（上市）審（28）號］。
本文附表見本刊網站的電子版本（www.china-plum.com）。
