靜息血小板中細絲蛋白a的17號結構域（FLNa17）可組成型結合到血小板膜糖蛋白Ibα（GPIbα）的胞質尾部（GPIbα-CT），抑制下游信號活化，而配體的結合和血流剪切力可激活血小板。為模擬來自GPIbα胞外配體向胞內傳遞的正向拉力及血小板細胞骨架形變傳遞的側向張力，本文在GPIbα-CT/FLNa17復合物上施加兩種受力模式，采用分子動力學模擬方法探究機械力對該復合物親和力及力學穩定性的調控。本研究首先識別出GPIbα-CT與FLNa17接觸面上的9對關鍵氫鍵是維持復合物結構穩定的基礎。其次，發現僅正向拉力作用下，這些氫鍵作用網絡才會發生斷裂，并導致復合物的最終解離；而側向張力下，FLNa17兩端的二級結構會解折疊以保護復合物接觸面不受機械力破壞。在0～40 pN范圍內，正向拉力的增加促使GPIbα-CT氨基酸序列中第563位的苯丙氨酸的氮原子（PHE563-N）的外旋和復合物解離概率的提高。本研究首次在原子層面揭示胞外配體傳遞的正向拉力可更有效解除FLNa17對GPIbα下游信號的抑制，為深入理解力調控的血小板胞內信號通路提供參考。
引用本文： 陶人才, 謝旭斌, 吳建華, 方穎. 力調控糖蛋白Ibα與細絲蛋白相互作用的分子動力學模擬. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(5): 876-885. doi: 10.7507/1001-5515.202302043 復制
0 引言
血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）復合物（GPIb-IX-V）由四種亞基GPIbα、GPIbβ、GPV和GPIX以2:2:1:2比例組成[1-2]，其中GPIbα是最重要的功能亞基，在介導血小板的初始黏附中發揮關鍵作用。GPIbα為單次跨膜蛋白，有一個很大的胞外結構域，包含血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）的結合位點[3]；GPIbα胞質尾部（GPIbα-cytoplasmic tail，GPIbα-CT）由96個氨基酸殘基組成，含有細絲蛋白a（filamin a，FLNa）和信號轉導接頭蛋白（14-3-3ζ）等胞質蛋白的結合位點[4-5]。在正常生理條件下，GPIbα-CT會與FLNa的17號結構域（FLNa17）結合形成GPIbα-CT/FLNa17復合物，以維持其低親和力構象，抑制血小板的活化。一旦血管受損，錨定在細胞外基質中的vWF在血流剪切力作用下伸展，暴露GPIbα的結合位點，從而特異性黏附血小板[6-8]。血小板表面受體GPIbα結合vWF后，會誘導GPIbα-CT構象變化以及和FLNa17的解離，轉而結合14-3-3ζ，并啟動下游信號分子Ras相關C3肉毒菌毒物底物1（ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）和LIM激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）的磷酸化[9]，激活血小板整合素αIIbβ3，最終導致血小板活化和聚集[10-11]。
FLNa是肌動蛋白（actin）結合蛋白家族的成員之一，一般以二聚體形式存在。單體由2 646個氨基酸組成，包括N端的actin結合結構域（actin binding domain，ABD）、由24個免疫球樣重復結構域組成的2個棒狀區域以及2個起連接作用的鉸鏈區域[12-14]。其中，ABD能夠與actin以正交方式結合，并促進其形成網狀結構[15]，以維持細胞膜和骨架結構的完整性[16-17]；棒狀區域可以與超過90種分子結合[18]，包括GPIbα和整合素αIIbβ3，其結合位點分別位于FLNa17和FLNa的21號結構域（FLNa21）[19-20]。GPIbα-CT和FLNa17的結合親和力在血小板保持生理性止血和病理性血栓之間的精細平衡中至關重要，受到GPIbα胞外域配體結合與循環血流微環境力學信號的多重影響。但是，GPIbα-CT與FLNa17相互作用的力學調控機制及分子結構基礎至今未明。
有研究表明，GPIbα是一個力敏感蛋白[21]，與vWF結合后，能夠感受加載在vWF上的血流剪切力，并以正向拉力的形式向胞內傳遞[8, 22]，有利于GPIbα-CT與14-3-3ζ的結合和胞內鈣響應的產生，促進血小板的活化。此外，體內及體外實驗均表明，僅病理性的高血流剪切應力就能誘導血小板的活化、聚集和血栓的形成[11, 23]。這些結果意味著GPIbα-CT與FLNa17的物理聯接既可能受到來自vWF的正向拉力，也可能承受來自血小板細胞骨架變形產生的側向張力，細胞骨架形變產生的力將使FLNa二聚體間的夾角由90°增大到120°[18]。由于目前缺少有效的測試手段和實驗方法研究胞內分子的相互作用和細微的構象變化，本文將采用分子動力學模擬的方法，從正向拉力和側向張力模擬真實生理條件下血小板可能的受力方式，如圖1所示，在原子水平探究機械力對GPIbα-CT/FLNa17復合物結合親和力的影響和相應的分子結構基礎，以深入理解血小板的生理性止血及病理性血栓形成過程，希望能夠為相關疾病的治療提供新思路。
圖1
GPIbα-FLNa聯接受力示意圖和GPIbα-CT/FLNa17復合物拉伸模式
Figure1.
Schematic diagram of forces on GPIbα-FLNa linkage and pulling modes of GPIbα-CT /FLNa17 complex
1 材料與方法
1.1 復合物體系的構建
GPIbα-CT/FLNa17復合物晶體結構取自蛋白數據庫（protein data bank，PDB），代碼為2BP3，分辨率為2.32 ?。其中，FLNa17（B鏈）包含1 865～1 954號殘基，GPIbα-CT（S鏈）包含562～572號殘基。使用分子可視化（visual molecular dynamics，VMD）軟件將復合物溶解到大小為62.6 ?×57.8 ?×56.3 ?的長方形水框中[24]，再加入生理濃度的氯化鈉中和系統，最終得到包含25 833個原子的模擬體系。
1.2 能量最小化與平衡
為得到較優的低能量體系，首先利用納米尺度分子動力學軟件（nanoscale molecular dynamics，NAMD）在全原子力場下，對體系進行三次能量最小化[25]。體系的靜電相互作用采用埃瓦爾德粒子網格算法（particle mesh Ewald algorithm，PME），范德華相互作用的截止值被設定為1.2 nm，采用周期性邊界條件以消除尺寸效應，迭代步長為2 fs。隨后在恒溫（37 ℃）、恒壓（101 325 pa）溶劑環境下對復合物體系進行三次100 ns的平衡分子動力學模擬，使體系達到穩定平衡狀態。
1.3 拉伸分子動力學模擬
為探究不同機械力條件對GPIbα-CT/FLNa17復合物互作的影響，對平衡后的復合物進行拉伸分子動力學模擬[26-27]。采用兩種拉伸模式，如圖1所示，固定點均為FLNa17 N端第1 865號半胱氨酸（Cysteine1865，CYS1865）的α碳原子（Cɑ）（紅色小球顯示），模式I的拉伸點為GPIbα-CT近膜端第562號蘇氨酸（Threonine562，THR562）的Cɑ（藍色小球顯示），模擬來自胞外配體vWF的正向拉力；模式II的拉伸點為FLNa17 C端第1 954號甘氨酸（Glycine1954，GLY1954）的Cɑ（藍色小球顯示），模擬來自細胞骨架重排的側向張力。對兩種拉伸模式均進行三次恒速度拉伸分子動力學模擬，虛擬彈簧系數為837.17 J/(mol·?2)，拉伸速度為3 ?/ns。最后在模式I下，選取恒速拉伸過程中受力與設定拉力（0、20、40 pN）大小相當的構象為初始構象，對各構象分別進行三次時長為100 ns的恒力拉伸分子動力學模擬。
1.4 數據分析
GPIbα-CT/FLNa17復合物的結構顯示與數據分析均借助VMD軟件完成。采用重原子位置的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）表征蛋白構象變化和結構穩定性；均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）表征局部結構變動水平；溶劑不可及表面積（buried solvent-accessible surface area，Buried SASA）表征復合物接觸面面積。
氫鍵定義如下：若供體原子與受體原子間的距離小于0.35 nm，且鍵角小于30°，則氫鍵存在[28]。根據氫鍵閾值，則定義復合物接觸面上第i個氫鍵的生存率為模擬過程該氫鍵存在時長占整個模擬時長的比值。
根據接觸面的氫鍵作用網絡和各氫鍵的生存率，還可以計算復合物的解離概率，以符號DP表示，計算公式如式（1）所示：
 |
式中，m表示接觸面上形成的氫鍵總數；Pi為接觸面上第i個氫鍵的生存率。
本研究所有數據都來自于3個獨立實驗，以平均值±標準差表示。兩個變量之間的相關性采用皮爾遜（Pearson）相關性分析進行檢驗。三組及以上數據先采用單因素方差分析，再進行多重比較檢驗，檢驗水準為0.01。
2 結果與分析
2.1 平衡過程中復合物的穩定性及接觸面關鍵殘基
在能量最小化后對復合物體系進行了三次100 ns的平衡分子動力學模擬（實驗1、實驗2、實驗3），結果如圖2所示。復合物的整體RMSD在5 ns后基本保持穩定，在2 ?附近波動；Buried SASA在10 ns前略有上升，之后經歷小幅波動（實驗2與實驗3），80 ns后趨于穩定，說明在100 ns平衡過程中復合物呈現良好的結構穩定性。三次平衡過程中接觸面氫鍵的頻數分布都符合高斯分布，說明數據點取樣完備，系統已經達到平衡，可以用于后續的拉伸分子動力學模擬。
圖2
平衡過程中復合物的穩定性及接觸面關鍵殘基
Figure2.
Stability of the complex and key residues on binding surface during equilibration
為了揭示GPIbα-CT/FLNa17呈現良好穩定性的結構基礎，本文首先觀察了GPIbα-CT/FLNa17的接觸面，結果如圖2接觸面上的氫鍵作用網絡所示，發現FLNa17在β4片層與β5片層間形成疏水溝槽，可以很好嵌入GPIbα-CT的β片層，從而形成穩定的接觸面。隨后對平衡模擬過程中接觸面的氫鍵作用網絡進行了分析，發現復合物接觸面上主要形成9對氫鍵，涉及5對氨基酸殘基為：氨基酸序列中第1 908位的丙氨酸（alanine1908，ALA1908）和第565位的絲氨酸（serine565，SER565）（ALA1908-SER565）、第1 904位的甘氨酸（glycine1904，GLY1904）和第563位的苯丙氨酸（phenylalanine563，PHE565）（GLY1904-PHE563）、第1 902位的異亮氨酸（isoleucine1902，ILE1902）和SER565（ILE1902-SER565）、第1 900位的亮氨酸（leucine1900，LEU1900）和第567位的亮氨酸（leucine567，LEU567）（LEU1900-LEU567）以及第1 898位的亮氨酸（leucine1898，LEU1898）和第569位的亮氨酸（leucine569，LEU569）（LEU1898-LEU569）。圖2氫鍵作用網格中，O和OG表示不同編號的氧原子，而N表示氮原子，其中紅色虛線為關鍵氫鍵。
各對氫鍵的生成率如表1所示，可以看出：三次平衡中這些氫鍵的生存率都高于70%，維持了復合物良好的穩定性。
表1
平衡過程中的關鍵氫鍵
Table1.
Key hydrogen bonds during equilibration
2.2 由GPIbα傳遞入胞內的正向拉力介導了復合物的解離
為探究vWF/GPIbα傳遞入胞內的正向拉力對GPIbα-CT/FLNa17復合物機械強度的影響，本文采用模式I對平衡后的復合物進行了三次30 ns的恒速度拉伸模擬（實驗1、實驗2、實驗3）。
三次正向拉伸過程中力、Buried SASA和氫鍵斷裂的時間歷程曲線如圖3所示，可知在三次獨立恒速度拉伸過程中，上述三個參數隨時間變化的趨勢基本相同：拉力首先隨著拉伸時間逐漸上升，3 ns時下降出現第一個小峰，隨后再次逐步上升，直至10 ns前后達到最大值，再陡然下降；在最大拉力峰值之前，Buried SASA均保持相對穩定，但隨著氫鍵的斷裂，Buried SASA出現下降，說明復合物開始發生解離，最終Buried SASA降為0，氫鍵全數斷裂時，復合物完全解離。其中，實驗1和實驗3的解離時間在28 ns左右，最大斷裂力在250 pN左右；實驗2的解離時間約為13 ns，最大斷裂力約為310 pN。
圖3
正向拉伸過程中力、Buried SASA和氫鍵斷裂時間歷程曲線
Figure3.
Time curses of force, Buried SASA, and rupture of hydrogen bonds under axial pull force
結合拉力作用下GPIbα-CT/FLNa17復合物的解離快照，可知在正向拉力作用下，復合物的力學強度與解離路徑相關，如圖4所示（紅色虛線框內為主要結構變化部分）。結果表明，三次拉伸過程中的復合物在前9 ns具有共同解離路徑：3 ns左右FLNa17 N端3/10螺旋發生解折疊，9 ns左右GLY1904-PHE563間氫鍵發生斷裂；隨后若是復合物接觸面氫鍵似拉鏈樣依次斷裂，并伴隨有FLNa17 N端β1片層和β2片層的解折疊（實驗1和實驗3），那么復合物具有較低的力學強度（225～260 pN）和更長的解離時間；若復合物接觸面上的氫鍵同時斷裂，且FLNa17 N端的β1片層和β2片層折疊維持完整（實驗2），那么復合物具有更高的抗拉強度（300 pN）及更短的解離時間。
圖4
正向拉力下GPIbα-CT/FLNa17的兩種解離路徑
Figure4.
Two dissociation pathways of GPIbα-CT/FLNa17 complexes under axial pull force
2.3 GPIbα介導的正向拉力正向調控復合物的解離概率
由于在正常生理條件下，GPIbα-CT/FLNa17復合物所受胞外拉力遠小于上述的200～300 pN，且拉力過快增加會遮蔽細微分子結構變化，因此在恒速拉伸的基礎上本文又進行了更加貼近生理受力條件的恒力拉伸模擬，以進一步探究正向拉力對復合物的力學穩定性的影響。一共選取了三個拉力條件：0、20、40 pN，其中0 pN的數據使用平衡數據替代。
不同拉力條件下，復合物的RMSD時間歷程曲線和Buried SASA、氫鍵數目以及解離概率隨力變化的趨勢如圖5所示。可以看出拉力的增大會減弱復合物的穩定性，但在拉伸后期都能達到平衡，并且波動范圍都不超過2 ?，說明復合物最終達到了一個穩定狀態。Pearson相關性分析表明：Buried SASA、接觸面氫鍵數與拉力間呈現負相關關系，Pearson相關系數r分別為?0.88（P<0.01）和?0.95（P<0.01），相關性具有統計學意義；解離概率與拉力之間呈現正相關關系，Pearson相關系數r為0.86（P<0.01），相關性也具有統計學意義。各項數據可相互支持和應證，表明GPIbα介導的胞外拉力能夠正向調控復合物的解離。
圖5
不同拉力條件下，復合物的RMSD時間歷程曲線和Buried SASA、氫鍵數目以及解離概率的變化情況
Figure5.
Time courses of RMSD and the changes of Buried SASA, number of hydrogen bonds, dissociation probability of the complex under different pull forces
為了深入探索上述正向調控機制的分子結構基礎，本文基于不同恒力下關鍵氫鍵生存率的變化繪制了熱圖，同時觀察分析了復合物接觸面上的細微構象變化，結果如圖6所示。不同拉力條件下關鍵氫鍵的生成率熱圖表明，正向拉力的增大會導致GLY1904-PHE563間兩個氫鍵的生存率下降； 接觸面RMSF顯示，FLNa17的構象保持有很好的力學穩定，而GPIbα-CT兩端殘基，尤其是N端構象隨力的增加變化顯著。將GLY1904和PHE563殘基所在的局部區域進行放大，觀察PHE563-Cɑ與GLY1904-Cɑ之間的連線和PHE563-Cɑ與PHE563-N的連線形成的夾角θ，可以看出正向拉力的增大會促使PHE563-N發生外旋，當拉力增大至40 pN時，θ顯著高于0 pN與20 pN時的平均值。這些結果提示：當正向拉力增大至40 pN時，PHE563-N外旋程度增大（θ增大），導致GLY1904- PHE563之間氫鍵的減弱和復合物解離概率的增大。
圖6
力對復合物接觸面氫鍵網絡和構象的影響
*
*
2.4 側向張力不影響復合物接觸面的穩定性
生理條件下，GPIbα-CT /FLNa17除了會受到上述的正向拉力外，還會受到細胞骨架重組產生的側向張力。因此本文采用模式II對復合物進行三次40 ns的恒速度拉伸模擬（實驗1、實驗2、實驗3），研究側向張力對GPIbα-CT/FLNa17復合物強度的影響。
側向拉伸過程中的力、Buried SASA、氫鍵數目的時間歷程曲線如圖7所示。三次拉伸力譜曲線的前期大體趨勢一致：從0時刻開始，拉力先逐漸增大，到12 ns左右達到峰值后快速下降。下降路徑各有不同，形成一個或多個難以區分的連續峰；30 ns后拉力均又開始攀升。其中實驗1和實驗2的最大峰值在300 pN左右，實驗3的峰值在400 pN左右。然而，Buried SASA和氫鍵數目的變化情況表明，在整個拉伸過程中，接觸面面積與氫鍵數目沒有顯著變化，說明側向張力并未影響到復合物的相互作用面，GPIbα-CT與FLNa17的結合是穩定的。
圖7
側向拉伸過程中的力、Buried SASA、氫鍵數目的時間歷程曲線和復合物的解折疊快照
Figure7.
Time courses of force, Buried SASA, number of hydrogen bonds and snapshots of the complex under lateral tension
提取拉伸過程中0、10、20、30、40 ns時刻的復合物快照，進行構象對齊后如圖7所示。可以發現：復合物中心部分和相互作用面的高度重合，而FLNa17兩端的重合性則很差，說明隨著拉伸時間的增加，FLNa17兩端結構的解折疊程度增加；解折疊區域局限于兩端的短小片層結構（β1、β2、β3、3/10螺旋、β8和β9），而組成接觸面的β4和β5兩個大片層區域以及GPIbα-CT結構并不受影響。其中，β1、β2和3/10螺旋的解折疊對應力譜曲線上的最高峰，β3、β8和β9的解折疊則形成了后續難以區分的連續峰。實驗2的第二個峰值對應β3的解折疊。
綜上所述，側向張力僅引起復合物中FLNa17兩端二級結構的解折疊與拉出，并不影響接觸面的穩定性，因此不會誘導GPIbα-CT/FLNa17復合物解離。
3 討論
血流剪切力的沖擊、血小板之間或者血小板與其他血細胞的碰撞和擠壓，會引起血小板細胞骨架的收縮和重排，細胞骨架形變產生的力將以側向張力的形式作用到FLNa上[18, 29]。同時，跨膜蛋白GPIbα又可以通過其胞外域與內皮細胞或基質中vWF分子相互作用，感受和傳遞來自胞外的力學信號[21, 30-31]。前者屬于純機械力信號，而后者則是特異性的，屬于力—化學信號耦合，涉及復雜的GPIbα變構[32]。那么，這兩種力學信號是如何影響GPIbα-CT/FLNa17的結合強度，從而介導FLNa17與GPIbα-CT的解離和激活血小板的，其效能差異是否具有統計學意義，這些均是未知的。盡管有非直接的體外研究表明，血小板欲達到同樣的活化水平（整合素的活化或P—選擇素的表達），純粹的流體剪應力需要數倍于配體介導的血流環境[23, 33]，這是否意味著非特異性的力信號比特異性的力—化學信號低效？針對上述問題，本文運用分子動力學模擬手段，采用兩種拉伸模式將力加載到GPIbα-CT/FLNa17上，試圖從原子水平揭示機械力如何解除FLNa對活化信號傳遞的抑制，解釋細胞形變產生的純機械力之所以低效的可能的分子結構基礎。
首先，平衡模擬結果顯示GPIbα-CT/FLNa17的接觸面共形成9對高生存率氫鍵，這些氫鍵保證了復合物的穩定性。恒速度拉伸模擬結果顯示，正向拉力由于直接作用在接觸面上，當拉力上升到200 pN時，GLY1904-O和PHE563-N間的氫鍵首先斷裂；隨著拉力的進一步增加，接觸面上氫鍵會依次或幾乎同時斷裂；拉力達到300 pN時，復合物均發生解離。而側向張力作用在與骨架相連的FLNa上，力的增加僅引起FLNa17兩端二級結構（β1、β2、β3、β8、β9和3/10螺旋）的解折疊；當拉力達到300 pN時，接觸面仍然是穩定的，并沒有發生GPIbα-CT與FLNa17之間的解離。這意味著FLNa17通過解折疊來抵消和緩沖外力的破壞，保護復合物接觸面的完整性，避免血小板在循環血流中的不必要活化。
另外，在0～40 pN正向拉力范圍內，GPIbα-CT/FLNa17復合物具有很好的結構穩定性和力學穩定性。隨著拉力的增加，PHE563-N在空間位置上發生外旋，從而降低其與GLY1904-O間氫鍵的生存率，導致復合物解離概率增大。與踝蛋白（Talin）/β3整合素及Talin/β1整合素的力調控的逆鎖鍵機制不同[25-26]，GPIbα-CT/FLNa17表現為滑移鍵性質，可能源于前者是為了保護血小板活化信號通路不受外力破壞，而后者是外力促進FLNa17從GPIbα-CT的脫落，誘導血小板的活化。
綜上所述，本文的研究結果表明：加載到vWF上的血流剪切力沿著GPIbα向血小板胞內傳遞，促使GPIbα-CT/FLNa17的解離，從而解除FLNa對活化信號通路的抑制作用；而細胞骨架變動所產生的非特異性側向張力不會誘導GPIbα-CT/FLNa17的解離。前者能夠保證血小板在損傷部位的特異性活化，后者則能夠防止血小板在正常生理條件下過度活化，兩者綜合保障了血小板正常的生理止血功能。由于細胞膜蛋白分子結構的特殊性以及構建合理細胞膜的困難性，本文的模擬結果尚不能得到直接實驗數據的支持，但仍然有助于深入理解力調控的血小板胞內信號通路，從分子機制和結構基礎上解析現有的實驗現象。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：陶人才全程參與資料收集、模擬實驗、數據分析以及論文撰寫；謝旭斌部分參與模擬數據分析和論文修改；吳建華與方穎設計實驗、指導數據分析和論文修改。
0 引言
血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）復合物（GPIb-IX-V）由四種亞基GPIbα、GPIbβ、GPV和GPIX以2:2:1:2比例組成[1-2]，其中GPIbα是最重要的功能亞基，在介導血小板的初始黏附中發揮關鍵作用。GPIbα為單次跨膜蛋白，有一個很大的胞外結構域，包含血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）的結合位點[3]；GPIbα胞質尾部（GPIbα-cytoplasmic tail，GPIbα-CT）由96個氨基酸殘基組成，含有細絲蛋白a（filamin a，FLNa）和信號轉導接頭蛋白（14-3-3ζ）等胞質蛋白的結合位點[4-5]。在正常生理條件下，GPIbα-CT會與FLNa的17號結構域（FLNa17）結合形成GPIbα-CT/FLNa17復合物，以維持其低親和力構象，抑制血小板的活化。一旦血管受損，錨定在細胞外基質中的vWF在血流剪切力作用下伸展，暴露GPIbα的結合位點，從而特異性黏附血小板[6-8]。血小板表面受體GPIbα結合vWF后，會誘導GPIbα-CT構象變化以及和FLNa17的解離，轉而結合14-3-3ζ，并啟動下游信號分子Ras相關C3肉毒菌毒物底物1（ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）和LIM激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）的磷酸化[9]，激活血小板整合素αIIbβ3，最終導致血小板活化和聚集[10-11]。
FLNa是肌動蛋白（actin）結合蛋白家族的成員之一，一般以二聚體形式存在。單體由2 646個氨基酸組成，包括N端的actin結合結構域（actin binding domain，ABD）、由24個免疫球樣重復結構域組成的2個棒狀區域以及2個起連接作用的鉸鏈區域[12-14]。其中，ABD能夠與actin以正交方式結合，并促進其形成網狀結構[15]，以維持細胞膜和骨架結構的完整性[16-17]；棒狀區域可以與超過90種分子結合[18]，包括GPIbα和整合素αIIbβ3，其結合位點分別位于FLNa17和FLNa的21號結構域（FLNa21）[19-20]。GPIbα-CT和FLNa17的結合親和力在血小板保持生理性止血和病理性血栓之間的精細平衡中至關重要，受到GPIbα胞外域配體結合與循環血流微環境力學信號的多重影響。但是，GPIbα-CT與FLNa17相互作用的力學調控機制及分子結構基礎至今未明。
有研究表明，GPIbα是一個力敏感蛋白[21]，與vWF結合后，能夠感受加載在vWF上的血流剪切力，并以正向拉力的形式向胞內傳遞[8, 22]，有利于GPIbα-CT與14-3-3ζ的結合和胞內鈣響應的產生，促進血小板的活化。此外，體內及體外實驗均表明，僅病理性的高血流剪切應力就能誘導血小板的活化、聚集和血栓的形成[11, 23]。這些結果意味著GPIbα-CT與FLNa17的物理聯接既可能受到來自vWF的正向拉力，也可能承受來自血小板細胞骨架變形產生的側向張力，細胞骨架形變產生的力將使FLNa二聚體間的夾角由90°增大到120°[18]。由于目前缺少有效的測試手段和實驗方法研究胞內分子的相互作用和細微的構象變化，本文將采用分子動力學模擬的方法，從正向拉力和側向張力模擬真實生理條件下血小板可能的受力方式，如圖1所示，在原子水平探究機械力對GPIbα-CT/FLNa17復合物結合親和力的影響和相應的分子結構基礎，以深入理解血小板的生理性止血及病理性血栓形成過程，希望能夠為相關疾病的治療提供新思路。
圖1
GPIbα-FLNa聯接受力示意圖和GPIbα-CT/FLNa17復合物拉伸模式
Figure1.
Schematic diagram of forces on GPIbα-FLNa linkage and pulling modes of GPIbα-CT /FLNa17 complex
1 材料與方法
1.1 復合物體系的構建
GPIbα-CT/FLNa17復合物晶體結構取自蛋白數據庫（protein data bank，PDB），代碼為2BP3，分辨率為2.32 ?。其中，FLNa17（B鏈）包含1 865～1 954號殘基，GPIbα-CT（S鏈）包含562～572號殘基。使用分子可視化（visual molecular dynamics，VMD）軟件將復合物溶解到大小為62.6 ?×57.8 ?×56.3 ?的長方形水框中[24]，再加入生理濃度的氯化鈉中和系統，最終得到包含25 833個原子的模擬體系。
1.2 能量最小化與平衡
為得到較優的低能量體系，首先利用納米尺度分子動力學軟件（nanoscale molecular dynamics，NAMD）在全原子力場下，對體系進行三次能量最小化[25]。體系的靜電相互作用采用埃瓦爾德粒子網格算法（particle mesh Ewald algorithm，PME），范德華相互作用的截止值被設定為1.2 nm，采用周期性邊界條件以消除尺寸效應，迭代步長為2 fs。隨后在恒溫（37 ℃）、恒壓（101 325 pa）溶劑環境下對復合物體系進行三次100 ns的平衡分子動力學模擬，使體系達到穩定平衡狀態。
1.3 拉伸分子動力學模擬
為探究不同機械力條件對GPIbα-CT/FLNa17復合物互作的影響，對平衡后的復合物進行拉伸分子動力學模擬[26-27]。采用兩種拉伸模式，如圖1所示，固定點均為FLNa17 N端第1 865號半胱氨酸（Cysteine1865，CYS1865）的α碳原子（Cɑ）（紅色小球顯示），模式I的拉伸點為GPIbα-CT近膜端第562號蘇氨酸（Threonine562，THR562）的Cɑ（藍色小球顯示），模擬來自胞外配體vWF的正向拉力；模式II的拉伸點為FLNa17 C端第1 954號甘氨酸（Glycine1954，GLY1954）的Cɑ（藍色小球顯示），模擬來自細胞骨架重排的側向張力。對兩種拉伸模式均進行三次恒速度拉伸分子動力學模擬，虛擬彈簧系數為837.17 J/(mol·?2)，拉伸速度為3 ?/ns。最后在模式I下，選取恒速拉伸過程中受力與設定拉力（0、20、40 pN）大小相當的構象為初始構象，對各構象分別進行三次時長為100 ns的恒力拉伸分子動力學模擬。
1.4 數據分析
GPIbα-CT/FLNa17復合物的結構顯示與數據分析均借助VMD軟件完成。采用重原子位置的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）表征蛋白構象變化和結構穩定性；均方根波動（root mean square fluctuation，RMSF）表征局部結構變動水平；溶劑不可及表面積（buried solvent-accessible surface area，Buried SASA）表征復合物接觸面面積。
氫鍵定義如下：若供體原子與受體原子間的距離小于0.35 nm，且鍵角小于30°，則氫鍵存在[28]。根據氫鍵閾值，則定義復合物接觸面上第i個氫鍵的生存率為模擬過程該氫鍵存在時長占整個模擬時長的比值。
根據接觸面的氫鍵作用網絡和各氫鍵的生存率，還可以計算復合物的解離概率，以符號DP表示，計算公式如式（1）所示：
|
式中，m表示接觸面上形成的氫鍵總數；Pi為接觸面上第i個氫鍵的生存率。
本研究所有數據都來自于3個獨立實驗，以平均值±標準差表示。兩個變量之間的相關性采用皮爾遜（Pearson）相關性分析進行檢驗。三組及以上數據先采用單因素方差分析，再進行多重比較檢驗，檢驗水準為0.01。
2 結果與分析
2.1 平衡過程中復合物的穩定性及接觸面關鍵殘基
在能量最小化后對復合物體系進行了三次100 ns的平衡分子動力學模擬（實驗1、實驗2、實驗3），結果如圖2所示。復合物的整體RMSD在5 ns后基本保持穩定，在2 ?附近波動；Buried SASA在10 ns前略有上升，之后經歷小幅波動（實驗2與實驗3），80 ns后趨于穩定，說明在100 ns平衡過程中復合物呈現良好的結構穩定性。三次平衡過程中接觸面氫鍵的頻數分布都符合高斯分布，說明數據點取樣完備，系統已經達到平衡，可以用于后續的拉伸分子動力學模擬。
圖2
平衡過程中復合物的穩定性及接觸面關鍵殘基
Figure2.
Stability of the complex and key residues on binding surface during equilibration
為了揭示GPIbα-CT/FLNa17呈現良好穩定性的結構基礎，本文首先觀察了GPIbα-CT/FLNa17的接觸面，結果如圖2接觸面上的氫鍵作用網絡所示，發現FLNa17在β4片層與β5片層間形成疏水溝槽，可以很好嵌入GPIbα-CT的β片層，從而形成穩定的接觸面。隨后對平衡模擬過程中接觸面的氫鍵作用網絡進行了分析，發現復合物接觸面上主要形成9對氫鍵，涉及5對氨基酸殘基為：氨基酸序列中第1 908位的丙氨酸（alanine1908，ALA1908）和第565位的絲氨酸（serine565，SER565）（ALA1908-SER565）、第1 904位的甘氨酸（glycine1904，GLY1904）和第563位的苯丙氨酸（phenylalanine563，PHE565）（GLY1904-PHE563）、第1 902位的異亮氨酸（isoleucine1902，ILE1902）和SER565（ILE1902-SER565）、第1 900位的亮氨酸（leucine1900，LEU1900）和第567位的亮氨酸（leucine567，LEU567）（LEU1900-LEU567）以及第1 898位的亮氨酸（leucine1898，LEU1898）和第569位的亮氨酸（leucine569，LEU569）（LEU1898-LEU569）。圖2氫鍵作用網格中，O和OG表示不同編號的氧原子，而N表示氮原子，其中紅色虛線為關鍵氫鍵。
各對氫鍵的生成率如表1所示，可以看出：三次平衡中這些氫鍵的生存率都高于70%，維持了復合物良好的穩定性。
表1
平衡過程中的關鍵氫鍵
Table1.
Key hydrogen bonds during equilibration
2.2 由GPIbα傳遞入胞內的正向拉力介導了復合物的解離
為探究vWF/GPIbα傳遞入胞內的正向拉力對GPIbα-CT/FLNa17復合物機械強度的影響，本文采用模式I對平衡后的復合物進行了三次30 ns的恒速度拉伸模擬（實驗1、實驗2、實驗3）。
三次正向拉伸過程中力、Buried SASA和氫鍵斷裂的時間歷程曲線如圖3所示，可知在三次獨立恒速度拉伸過程中，上述三個參數隨時間變化的趨勢基本相同：拉力首先隨著拉伸時間逐漸上升，3 ns時下降出現第一個小峰，隨后再次逐步上升，直至10 ns前后達到最大值，再陡然下降；在最大拉力峰值之前，Buried SASA均保持相對穩定，但隨著氫鍵的斷裂，Buried SASA出現下降，說明復合物開始發生解離，最終Buried SASA降為0，氫鍵全數斷裂時，復合物完全解離。其中，實驗1和實驗3的解離時間在28 ns左右，最大斷裂力在250 pN左右；實驗2的解離時間約為13 ns，最大斷裂力約為310 pN。
圖3
正向拉伸過程中力、Buried SASA和氫鍵斷裂時間歷程曲線
Figure3.
Time curses of force, Buried SASA, and rupture of hydrogen bonds under axial pull force
結合拉力作用下GPIbα-CT/FLNa17復合物的解離快照，可知在正向拉力作用下，復合物的力學強度與解離路徑相關，如圖4所示（紅色虛線框內為主要結構變化部分）。結果表明，三次拉伸過程中的復合物在前9 ns具有共同解離路徑：3 ns左右FLNa17 N端3/10螺旋發生解折疊，9 ns左右GLY1904-PHE563間氫鍵發生斷裂；隨后若是復合物接觸面氫鍵似拉鏈樣依次斷裂，并伴隨有FLNa17 N端β1片層和β2片層的解折疊（實驗1和實驗3），那么復合物具有較低的力學強度（225～260 pN）和更長的解離時間；若復合物接觸面上的氫鍵同時斷裂，且FLNa17 N端的β1片層和β2片層折疊維持完整（實驗2），那么復合物具有更高的抗拉強度（300 pN）及更短的解離時間。
圖4
正向拉力下GPIbα-CT/FLNa17的兩種解離路徑
Figure4.
Two dissociation pathways of GPIbα-CT/FLNa17 complexes under axial pull force
2.3 GPIbα介導的正向拉力正向調控復合物的解離概率
由于在正常生理條件下，GPIbα-CT/FLNa17復合物所受胞外拉力遠小于上述的200～300 pN，且拉力過快增加會遮蔽細微分子結構變化，因此在恒速拉伸的基礎上本文又進行了更加貼近生理受力條件的恒力拉伸模擬，以進一步探究正向拉力對復合物的力學穩定性的影響。一共選取了三個拉力條件：0、20、40 pN，其中0 pN的數據使用平衡數據替代。
不同拉力條件下，復合物的RMSD時間歷程曲線和Buried SASA、氫鍵數目以及解離概率隨力變化的趨勢如圖5所示。可以看出拉力的增大會減弱復合物的穩定性，但在拉伸后期都能達到平衡，并且波動范圍都不超過2 ?，說明復合物最終達到了一個穩定狀態。Pearson相關性分析表明：Buried SASA、接觸面氫鍵數與拉力間呈現負相關關系，Pearson相關系數r分別為?0.88（P<0.01）和?0.95（P<0.01），相關性具有統計學意義；解離概率與拉力之間呈現正相關關系，Pearson相關系數r為0.86（P<0.01），相關性也具有統計學意義。各項數據可相互支持和應證，表明GPIbα介導的胞外拉力能夠正向調控復合物的解離。
圖5
不同拉力條件下，復合物的RMSD時間歷程曲線和Buried SASA、氫鍵數目以及解離概率的變化情況
Figure5.
Time courses of RMSD and the changes of Buried SASA, number of hydrogen bonds, dissociation probability of the complex under different pull forces
為了深入探索上述正向調控機制的分子結構基礎，本文基于不同恒力下關鍵氫鍵生存率的變化繪制了熱圖，同時觀察分析了復合物接觸面上的細微構象變化，結果如圖6所示。不同拉力條件下關鍵氫鍵的生成率熱圖表明，正向拉力的增大會導致GLY1904-PHE563間兩個氫鍵的生存率下降； 接觸面RMSF顯示，FLNa17的構象保持有很好的力學穩定，而GPIbα-CT兩端殘基，尤其是N端構象隨力的增加變化顯著。將GLY1904和PHE563殘基所在的局部區域進行放大，觀察PHE563-Cɑ與GLY1904-Cɑ之間的連線和PHE563-Cɑ與PHE563-N的連線形成的夾角θ，可以看出正向拉力的增大會促使PHE563-N發生外旋，當拉力增大至40 pN時，θ顯著高于0 pN與20 pN時的平均值。這些結果提示：當正向拉力增大至40 pN時，PHE563-N外旋程度增大（θ增大），導致GLY1904- PHE563之間氫鍵的減弱和復合物解離概率的增大。
圖6
力對復合物接觸面氫鍵網絡和構象的影響
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2.4 側向張力不影響復合物接觸面的穩定性
生理條件下，GPIbα-CT /FLNa17除了會受到上述的正向拉力外，還會受到細胞骨架重組產生的側向張力。因此本文采用模式II對復合物進行三次40 ns的恒速度拉伸模擬（實驗1、實驗2、實驗3），研究側向張力對GPIbα-CT/FLNa17復合物強度的影響。
側向拉伸過程中的力、Buried SASA、氫鍵數目的時間歷程曲線如圖7所示。三次拉伸力譜曲線的前期大體趨勢一致：從0時刻開始，拉力先逐漸增大，到12 ns左右達到峰值后快速下降。下降路徑各有不同，形成一個或多個難以區分的連續峰；30 ns后拉力均又開始攀升。其中實驗1和實驗2的最大峰值在300 pN左右，實驗3的峰值在400 pN左右。然而，Buried SASA和氫鍵數目的變化情況表明，在整個拉伸過程中，接觸面面積與氫鍵數目沒有顯著變化，說明側向張力并未影響到復合物的相互作用面，GPIbα-CT與FLNa17的結合是穩定的。
圖7
側向拉伸過程中的力、Buried SASA、氫鍵數目的時間歷程曲線和復合物的解折疊快照
Figure7.
Time courses of force, Buried SASA, number of hydrogen bonds and snapshots of the complex under lateral tension
提取拉伸過程中0、10、20、30、40 ns時刻的復合物快照，進行構象對齊后如圖7所示。可以發現：復合物中心部分和相互作用面的高度重合，而FLNa17兩端的重合性則很差，說明隨著拉伸時間的增加，FLNa17兩端結構的解折疊程度增加；解折疊區域局限于兩端的短小片層結構（β1、β2、β3、3/10螺旋、β8和β9），而組成接觸面的β4和β5兩個大片層區域以及GPIbα-CT結構并不受影響。其中，β1、β2和3/10螺旋的解折疊對應力譜曲線上的最高峰，β3、β8和β9的解折疊則形成了后續難以區分的連續峰。實驗2的第二個峰值對應β3的解折疊。
綜上所述，側向張力僅引起復合物中FLNa17兩端二級結構的解折疊與拉出，并不影響接觸面的穩定性，因此不會誘導GPIbα-CT/FLNa17復合物解離。
3 討論
血流剪切力的沖擊、血小板之間或者血小板與其他血細胞的碰撞和擠壓，會引起血小板細胞骨架的收縮和重排，細胞骨架形變產生的力將以側向張力的形式作用到FLNa上[18, 29]。同時，跨膜蛋白GPIbα又可以通過其胞外域與內皮細胞或基質中vWF分子相互作用，感受和傳遞來自胞外的力學信號[21, 30-31]。前者屬于純機械力信號，而后者則是特異性的，屬于力—化學信號耦合，涉及復雜的GPIbα變構[32]。那么，這兩種力學信號是如何影響GPIbα-CT/FLNa17的結合強度，從而介導FLNa17與GPIbα-CT的解離和激活血小板的，其效能差異是否具有統計學意義，這些均是未知的。盡管有非直接的體外研究表明，血小板欲達到同樣的活化水平（整合素的活化或P—選擇素的表達），純粹的流體剪應力需要數倍于配體介導的血流環境[23, 33]，這是否意味著非特異性的力信號比特異性的力—化學信號低效？針對上述問題，本文運用分子動力學模擬手段，采用兩種拉伸模式將力加載到GPIbα-CT/FLNa17上，試圖從原子水平揭示機械力如何解除FLNa對活化信號傳遞的抑制，解釋細胞形變產生的純機械力之所以低效的可能的分子結構基礎。
首先，平衡模擬結果顯示GPIbα-CT/FLNa17的接觸面共形成9對高生存率氫鍵，這些氫鍵保證了復合物的穩定性。恒速度拉伸模擬結果顯示，正向拉力由于直接作用在接觸面上，當拉力上升到200 pN時，GLY1904-O和PHE563-N間的氫鍵首先斷裂；隨著拉力的進一步增加，接觸面上氫鍵會依次或幾乎同時斷裂；拉力達到300 pN時，復合物均發生解離。而側向張力作用在與骨架相連的FLNa上，力的增加僅引起FLNa17兩端二級結構（β1、β2、β3、β8、β9和3/10螺旋）的解折疊；當拉力達到300 pN時，接觸面仍然是穩定的，并沒有發生GPIbα-CT與FLNa17之間的解離。這意味著FLNa17通過解折疊來抵消和緩沖外力的破壞，保護復合物接觸面的完整性，避免血小板在循環血流中的不必要活化。
另外，在0～40 pN正向拉力范圍內，GPIbα-CT/FLNa17復合物具有很好的結構穩定性和力學穩定性。隨著拉力的增加，PHE563-N在空間位置上發生外旋，從而降低其與GLY1904-O間氫鍵的生存率，導致復合物解離概率增大。與踝蛋白（Talin）/β3整合素及Talin/β1整合素的力調控的逆鎖鍵機制不同[25-26]，GPIbα-CT/FLNa17表現為滑移鍵性質，可能源于前者是為了保護血小板活化信號通路不受外力破壞，而后者是外力促進FLNa17從GPIbα-CT的脫落，誘導血小板的活化。
綜上所述，本文的研究結果表明：加載到vWF上的血流剪切力沿著GPIbα向血小板胞內傳遞，促使GPIbα-CT/FLNa17的解離，從而解除FLNa對活化信號通路的抑制作用；而細胞骨架變動所產生的非特異性側向張力不會誘導GPIbα-CT/FLNa17的解離。前者能夠保證血小板在損傷部位的特異性活化，后者則能夠防止血小板在正常生理條件下過度活化，兩者綜合保障了血小板正常的生理止血功能。由于細胞膜蛋白分子結構的特殊性以及構建合理細胞膜的困難性，本文的模擬結果尚不能得到直接實驗數據的支持，但仍然有助于深入理解力調控的血小板胞內信號通路，從分子機制和結構基礎上解析現有的實驗現象。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：陶人才全程參與資料收集、模擬實驗、數據分析以及論文撰寫；謝旭斌部分參與模擬數據分析和論文修改；吳建華與方穎設計實驗、指導數據分析和論文修改。
