引用本文： 廖娟, 曾素根, 江虹, 賈勁, 左成華, 王霞, 周靜. 應用Spife Combo電泳儀進行血紅蛋白電泳的質量保證及特殊故障分析. 華西醫學, 2014, 29(5): 999-1000. doi: 10.7507/1002-0179.20140305 復制
血紅蛋白電泳分析是診斷和分離異常血紅蛋白的有效方法，是用于地中海貧血篩查的常規實驗手段[1]。美國Helena公司生產的Combo電泳儀是集電泳、染色、脫色、烘干于一體，通過掃描系統掃描，得出血紅蛋白各組分的百分比進行地中海貧血篩查。但使用該儀器進行血紅蛋白電泳操作較繁瑣，包括標本前處理、電泳儀操作、染色、掃描等步驟，且手工操作多質量控制較難，對操作者的技術要求較高：配制血紅蛋白液，點樣時間的掌握，每次電泳均應有標準質控品，另外儀器的好壞也對結果的準確性影響較大。現就我們使用Spife Combo全自動電泳儀進行血紅蛋白電泳時的質量控制及特殊故障分析處理總結如下。
1 血紅蛋白電泳的質量控制
1.1 制備血紅蛋白液的質量控制
由于血紅蛋白液濃度與電泳效果密切相關，所以，血紅蛋白液的制備是血紅蛋白電泳中質量控制最重要的環節。用生理鹽水對紅細胞進行充分洗滌后，再用Hemolysata溶血劑制備血紅蛋白液時，紅細胞與溶血劑比例為1︰7至1︰8時其電泳的效果最好；如果紅細胞與溶血劑比例高于1︰5，使血紅蛋白液濃度過高，影響各區帶的分離及發生拖尾現象；反之，如果紅細胞與溶血劑比例低于1︰11，使血紅蛋白濃度過低，將導致某些微量的異常血紅蛋白區帶消失而漏檢。同一樣本，制備成不同濃度的血紅蛋白液，紅細胞與溶血劑比例分別為1︰5、1︰8、1︰11和1︰15，其電泳效果不同，見圖 1。
圖1
同一樣本紅細胞與溶血劑不同比例堿性血紅蛋白電泳效果圖
1.2 電泳儀操作的質量控制
平鋪凝膠膜在電泳板上時，避免產生氣泡，用濾紙吸去凝膠膜上多余的緩沖液，不能吸得過干，否則電泳距離會縮短即從點樣點到血紅蛋白A之間的距離變短。點樣時間一般控制在30 s和60 s；如果點樣時間過長，可使區帶顏色過深，以及脫色時區帶出現駁脫等而影響電泳效果。電泳時運用575 V的高壓可能造成碳棒被損壞，導致電極未聯。每次電泳時要檢查碳棒和電泳槽蓋，電泳時需成一封閉體系。使用美國Helena公司提供的AFSA2定值質控品（血紅蛋白A、血紅蛋白F、血紅蛋白S、血紅蛋白A2），血紅蛋白F、血紅蛋白S是最常見的病理性血紅蛋白。質控品應貯存在2～8℃，不能稀釋使用。
1.3 染色的質量控制
在使用酸蘭染色時，按照試劑說明書，每6個月新配制1次。但我們在工作中發現，每月配制1次，其染色效果更好且背景更清晰。值得一提的是，當染色效果較差，如染色結束時凝膠片可見明顯劃痕，出現部份凝膠脫落。應檢測染色液的pH值，清洗染色槽或更換新的染液。
1.4 掃描的質量控制
當染色結束后，立即對血紅蛋白區帶進行掃描。AFSA2質控品包含已知濃度血紅蛋白A和血紅蛋白A2、血紅蛋白S、血紅蛋白F，掃描得到的血紅蛋白AFSA2質控品的曲線作為該次電泳圖譜的標準曲線，進行其他曲線切割點的增減，便于異常結果的判斷和各成分含量的劃分。當質控結果超出給定的范圍時首先檢查質控品是否在有效期內的同時檢查儀器，最后再次電泳。
2 儀器特殊故障分析處理
2.1 電泳區帶出現空斑現象
區帶出現空斑現象，見圖 2。由于儀器無報警提示，儀器工程師也未遇見該現象。我們通過對血紅蛋白濃度、點樣時間、電泳儀電壓等不同方面進行調整，最終發現該現象是由于電泳儀的程序出現故障所致。電泳儀處于正常狀態時，在電泳結束時會自動烘干凝膠膜，再進行染色；烘干的血紅蛋白與染液結合不能很好固定，洗脫時，未固定的血紅蛋白易被洗液洗脫而形成空斑。因此電泳后不必烘干，而染色后必須烘干。
圖2
出現空斑現象的堿性血紅蛋白電泳圖
2.2 電泳結束凝膠片脫色不完全，凝膠膜背景呈藍色
由于電泳儀在進行染色過程中，烘干出現異常，使凝膠膜烘干不徹底，導致脫色不完全，凝膠膜背景呈藍色（圖 3），影響血紅蛋白區帶掃描的效果。電泳儀面板顯示溫度正常，檢查電泳儀實際烘干溫度發現比面板顯示溫度低，經工程師調整儀器恢復正常。Spife Combo電泳儀有專用溫度校準儀，定時對電泳儀的溫度進行校準是必要的。
圖3
脫色不全的堿性血紅蛋白電泳圖
3 討論
血紅蛋白電泳分析是地中海貧血和其他異常血紅蛋白病診斷的常用方法，臨床常用醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、毛細血管電泳、柱層析等方法。瓊脂糖凝膠電泳血紅蛋白A2區帶清晰，血紅蛋白F區帶分辨力高[2]，是目前推薦的電泳方法。由于血紅蛋白的分子生物學檢測方法條件要求高，方法繁瑣，尚不能廣泛應用于各級醫院特別是基層醫院[1]。因此，快速、實用的血紅蛋白電泳在地中海貧血的早期篩查中起到非常重要的作用，血紅蛋白電泳時的質量控制顯得尤其重要。
我室從2007年開始使用美國Helena公司的Spife Combo全自動電泳儀發現該儀器檢測結果穩定、容易維護保養。但儀器良好的性能需要正確的使用和開展質量控制。我們對血紅蛋白電泳的質量控制積累了一定的經驗，除平時嚴格按照儀器說明書的要求，對儀器做好每日、每周、每月維護保養，以減少儀器的故障率外，還強調對操作中的各個環節進行質量控制。建立完整的標準操作程序，對人員進行培訓；建立對儀器的定期校準、室內質量控制、室間質量評價制度，使用原裝配套試劑，對儀器的電泳系統、染色系統、圖像掃描系統等進行嚴格的性能監控。通過對血紅蛋白液的制備、點樣的時間等進行標準化操作，能使血紅蛋白電泳的結果準確可靠，為臨床提供有價值的數據。
血紅蛋白電泳分析是診斷和分離異常血紅蛋白的有效方法，是用于地中海貧血篩查的常規實驗手段[1]。美國Helena公司生產的Combo電泳儀是集電泳、染色、脫色、烘干于一體，通過掃描系統掃描，得出血紅蛋白各組分的百分比進行地中海貧血篩查。但使用該儀器進行血紅蛋白電泳操作較繁瑣，包括標本前處理、電泳儀操作、染色、掃描等步驟，且手工操作多質量控制較難，對操作者的技術要求較高：配制血紅蛋白液，點樣時間的掌握，每次電泳均應有標準質控品，另外儀器的好壞也對結果的準確性影響較大。現就我們使用Spife Combo全自動電泳儀進行血紅蛋白電泳時的質量控制及特殊故障分析處理總結如下。
1 血紅蛋白電泳的質量控制
1.1 制備血紅蛋白液的質量控制
由于血紅蛋白液濃度與電泳效果密切相關，所以，血紅蛋白液的制備是血紅蛋白電泳中質量控制最重要的環節。用生理鹽水對紅細胞進行充分洗滌后，再用Hemolysata溶血劑制備血紅蛋白液時，紅細胞與溶血劑比例為1︰7至1︰8時其電泳的效果最好；如果紅細胞與溶血劑比例高于1︰5，使血紅蛋白液濃度過高，影響各區帶的分離及發生拖尾現象；反之，如果紅細胞與溶血劑比例低于1︰11，使血紅蛋白濃度過低，將導致某些微量的異常血紅蛋白區帶消失而漏檢。同一樣本，制備成不同濃度的血紅蛋白液，紅細胞與溶血劑比例分別為1︰5、1︰8、1︰11和1︰15，其電泳效果不同，見圖 1。
圖1
同一樣本紅細胞與溶血劑不同比例堿性血紅蛋白電泳效果圖
1.2 電泳儀操作的質量控制
平鋪凝膠膜在電泳板上時，避免產生氣泡，用濾紙吸去凝膠膜上多余的緩沖液，不能吸得過干，否則電泳距離會縮短即從點樣點到血紅蛋白A之間的距離變短。點樣時間一般控制在30 s和60 s；如果點樣時間過長，可使區帶顏色過深，以及脫色時區帶出現駁脫等而影響電泳效果。電泳時運用575 V的高壓可能造成碳棒被損壞，導致電極未聯。每次電泳時要檢查碳棒和電泳槽蓋，電泳時需成一封閉體系。使用美國Helena公司提供的AFSA2定值質控品（血紅蛋白A、血紅蛋白F、血紅蛋白S、血紅蛋白A2），血紅蛋白F、血紅蛋白S是最常見的病理性血紅蛋白。質控品應貯存在2～8℃，不能稀釋使用。
1.3 染色的質量控制
在使用酸蘭染色時，按照試劑說明書，每6個月新配制1次。但我們在工作中發現，每月配制1次，其染色效果更好且背景更清晰。值得一提的是，當染色效果較差，如染色結束時凝膠片可見明顯劃痕，出現部份凝膠脫落。應檢測染色液的pH值，清洗染色槽或更換新的染液。
1.4 掃描的質量控制
當染色結束后，立即對血紅蛋白區帶進行掃描。AFSA2質控品包含已知濃度血紅蛋白A和血紅蛋白A2、血紅蛋白S、血紅蛋白F，掃描得到的血紅蛋白AFSA2質控品的曲線作為該次電泳圖譜的標準曲線，進行其他曲線切割點的增減，便于異常結果的判斷和各成分含量的劃分。當質控結果超出給定的范圍時首先檢查質控品是否在有效期內的同時檢查儀器，最后再次電泳。
2 儀器特殊故障分析處理
2.1 電泳區帶出現空斑現象
區帶出現空斑現象，見圖 2。由于儀器無報警提示，儀器工程師也未遇見該現象。我們通過對血紅蛋白濃度、點樣時間、電泳儀電壓等不同方面進行調整，最終發現該現象是由于電泳儀的程序出現故障所致。電泳儀處于正常狀態時，在電泳結束時會自動烘干凝膠膜，再進行染色；烘干的血紅蛋白與染液結合不能很好固定，洗脫時，未固定的血紅蛋白易被洗液洗脫而形成空斑。因此電泳后不必烘干，而染色后必須烘干。
圖2
出現空斑現象的堿性血紅蛋白電泳圖
2.2 電泳結束凝膠片脫色不完全，凝膠膜背景呈藍色
由于電泳儀在進行染色過程中，烘干出現異常，使凝膠膜烘干不徹底，導致脫色不完全，凝膠膜背景呈藍色（圖 3），影響血紅蛋白區帶掃描的效果。電泳儀面板顯示溫度正常，檢查電泳儀實際烘干溫度發現比面板顯示溫度低，經工程師調整儀器恢復正常。Spife Combo電泳儀有專用溫度校準儀，定時對電泳儀的溫度進行校準是必要的。
圖3
脫色不全的堿性血紅蛋白電泳圖
3 討論
血紅蛋白電泳分析是地中海貧血和其他異常血紅蛋白病診斷的常用方法，臨床常用醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、毛細血管電泳、柱層析等方法。瓊脂糖凝膠電泳血紅蛋白A2區帶清晰，血紅蛋白F區帶分辨力高[2]，是目前推薦的電泳方法。由于血紅蛋白的分子生物學檢測方法條件要求高，方法繁瑣，尚不能廣泛應用于各級醫院特別是基層醫院[1]。因此，快速、實用的血紅蛋白電泳在地中海貧血的早期篩查中起到非常重要的作用，血紅蛋白電泳時的質量控制顯得尤其重要。
我室從2007年開始使用美國Helena公司的Spife Combo全自動電泳儀發現該儀器檢測結果穩定、容易維護保養。但儀器良好的性能需要正確的使用和開展質量控制。我們對血紅蛋白電泳的質量控制積累了一定的經驗，除平時嚴格按照儀器說明書的要求，對儀器做好每日、每周、每月維護保養，以減少儀器的故障率外，還強調對操作中的各個環節進行質量控制。建立完整的標準操作程序，對人員進行培訓；建立對儀器的定期校準、室內質量控制、室間質量評價制度，使用原裝配套試劑，對儀器的電泳系統、染色系統、圖像掃描系統等進行嚴格的性能監控。通過對血紅蛋白液的制備、點樣的時間等進行標準化操作，能使血紅蛋白電泳的結果準確可靠，為臨床提供有價值的數據。
