引用本文： 高凌云, 任輝, 楊恂, 劉曉俊, 陶紹華, 潘林海. 慢性阻塞性肺疾病合并2型糖尿病大鼠模型的建立. 華西醫學, 2014, 29(11): 2012-2015. doi: 10.7507/1002-0179.20140610 復制
吸煙可以導致肺癌及慢性阻塞性肺病（COPD）[1]，COPD是一種不完全可逆的氣流受阻且呈進行性發展為特征的疾病，多與肺部對有害顆粒和氣體所產生的炎癥反應相關，其本質是氣道慢性非特異性炎癥性疾病，以小氣道阻力增加、持續氣流受限為主要特點。糖尿病是慢性進行性內分泌及代謝性疾病，預計2025年將增至3億[2]。臨床工作中COPD患者合并血糖升高狀況十分常見，我院在前期研究中發現住院COPD患者中約有12%存在血糖升高，尤其急性發作期合并血糖升高狀況更為常見，深入研究發現二者有一定的聯系，COPD的急性加重常可作為誘發高血糖的因素之一，而患者本身合并的代謝紊亂更加重這一現象[3]。在前期研究中，我們采用強化血糖控制對COPD合并高血糖患者進行治療，取得了較好的效果[4]。本實驗擬采用連續被動吸煙的方式建立COPD大鼠模型[5]，用鏈脲佐菌素（STZ）誘導Sprague-Dawley（SD）大鼠的糖尿病模型[6]，兩種方法協同建立COPD合并糖尿病模型，為進一步研究COPD合并糖尿病奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
80只健康雄性無特定病原體級SD大鼠，日齡40 d，體質量（200 ± 20）g，購于四川大學實驗動物中心。
1.2 主要儀器和試劑
天下秀牌香煙（成都卷煙廠生產，煤焦油含量14 mg/支，煙氣煙堿量1.0 mg/支）；STZ（美國Sigma公司）；檸檬酸鈉、檸檬酸（上海前塵生物科技有限公司）；Sure step血糖儀（美國強生有限公司）。
1.3 動物分組和模型制備
將80只大鼠按體質量小到大依次編號為1～80號，使第1～4號為一配伍組，第5～8號為一配伍組，余類推。結合隨機數字表分成4組，即正常組、COPD組、糖尿病組和COPD+糖尿病組，每組各20只。
1.3.1 正常組大鼠的飼養
正常組大鼠在相同飼養環境下以普通飼料進行飼養。
1.3.2 糖尿病模型的制備
SD大鼠飼養1周，先建立糖尿病模型。把糖尿病組及糖尿病+COPD組SD大鼠40只飼以高脂飼料（100 g基礎飼料+20 g豬油+10 g奶粉）并加小劑量STZ腹腔注射誘導2型糖尿病大鼠模型。STZ溶解于0.1 mol/L的枸櫞酸鈉溶液中（pH值4.5），按照30 mg/kg的劑量進行腹腔注射誘導糖尿病模型，1次/周，共4周（28 d），配制好的溶液在10 min內用完。4周后鼠尾靜脈采血，用血糖儀測血糖，以血糖＞16.7 mmol/L視為造模成功[7]。
1.3.3 COPD模型的制備
COPD模型的制備采用煙熏法進行。用自制熏煙箱將COPD組大鼠分別放置于5個體積為100 cm×70 cm×70 cm熏煙箱中，將10支香煙捆綁在點煙室點燃，通過通氣裝置將香煙煙霧注入熏煙箱內，對大鼠進行被動吸煙染毒，燃燒時間為15 min，然后點燃第2批香煙，重復上述操作，依次類推，共約1 h，2次/d，每次吸煙間隔為4 h，連續90 d。
1.3.4 COPD+糖尿病模型的制備
按照COPD模型的制作方法對COPD+糖尿病組大鼠進行COPD造模，并同時進行糖尿病造模。
1.4 標本的制作及指標檢測
24、90 d后取大鼠鼠尾血進行血糖檢測。COPD造模完成后，大鼠經斷頸處死，打開胸腔，從胸腔中完整地取出支氣管和肺組織，經氣管注入4%甲醛溶液，結扎氣管，再將全肺浸泡于相同濃度的甲醛溶液中固定24 h，取右下肺組織用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察各組肺組織病理改變。每張病理切片隨機選取左、右、上、中、下5個視野用數碼相機進行采像，并用Metamorph圖像分析軟件（美國Universal Imaging Corporation）分析肺組織結構的形態學變化，測量平均肺泡面積及肺泡吸光度（舊稱光密度）值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，血糖分析采用重復測量資料的方差分析，多組間比較采用方差分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組大鼠肺組織病理學改變
正常組：肺泡結構正常連續，小支氣管未見腺體及炎性細胞浸潤，肺泡壁完整。COPD組：大鼠支氣管黏膜上皮脫落，管壁及周圍有單核細胞和淋巴細胞浸潤，肺泡結構紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡彈性減弱，呈囊狀擴張，肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰。糖尿病組：大鼠支氣管上皮纖毛有倒伏現象，基膜下有炎性細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺間質增加。COPD+糖尿病組：支氣管黏膜上皮脫落嚴重，基膜下有大量的炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞，部分融合成肺大皰。見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理切片（HE×100） a. 正常組 b. COPD組 c. 糖尿病組 d. COPD+糖尿病組
2.2 各組大鼠肺組織平均肺泡面積及吸光度值
COPD組、糖尿病組及COPD+糖尿病組中肺組織平均肺泡面積較對照組增大，吸光度值明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。
表1
肺組織平均肺泡面積與吸光度值（n=20，2.3 各組大鼠血糖的變化
正常對照組大鼠造模前后血糖差異無統計學意義（P＞0.05）。糖尿病造模后（28 d）及COPD造模成功后（90 d），糖尿病組及COPD+糖尿病組大鼠血糖較本組造模前差異均有統計學意義（P＜0.05）；尤以COPD+糖尿病組較明顯，從造模前（9.0 ± 0.4） mmol/L變為（28.9 ± 0.8） mmol/L。造模前組間差異無統計學意義，造模后糖尿病組及COPD+糖尿病組較COPD及正常組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠不同時間血糖（n=20，3 討論
COPD與糖尿病是影響人類健康且發病率較高的兩類疾病。COPD是一種以持續氣流受限為主要臨床特征、異常的氣道炎癥為主要病理特征的慢性氣道炎性疾病。它是影響人類健康的重大公共衛生難題[8]，由于其患病人數多，死亡率高，社會經濟負擔重，并使患者的生活質量明顯降低[9]，已引起世界各國的極大關注。COPD的本質特征是氣道的慢性炎癥，氣道的炎癥使管腔狹窄，形成不完全阻塞，慢性炎癥破壞小支氣管壁軟骨，失去支氣管正常的支架作用，出現咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀，目前已發現白細胞介素6等很多炎癥因子以不同的形式參與了COPD的發病機制[10]，為抗炎治療提供了理論依據。糖尿病也是嚴重影響人們健康的疾病，其發病可能與遺傳、肥胖及吸煙等有關。在臨床工作中COPD患者常常需要霧化吸入或靜脈及口服應用激素抗炎治療，而激素應用可使血糖水平升高，如何處理好二者間的矛盾，尚需進一步研究。本研究基于這個矛盾成功建立COPD并糖尿病大鼠模型，為進一步臨床研究奠定基礎。
采用單純熏香煙的方法建立COPD動物模型需3個月甚至更長時間。20世紀80年代，國外就有人運用復合的造模方法制造動物肺氣腫模型。Hoidal等[11]的實驗表明，如果同時用熏香煙的方法，給予不足以致肺氣腫劑量的蛋白酶就可以誘發金黃地鼠肺氣腫，而單獨使用煙熏誘發肺氣腫所需的時間較長。制作COPD并糖尿病的動物模型有利于進一步闡明COPD并糖尿病的遺傳背景、誘發因素、發病機制，并由此對疾病進行防治。
本實驗采用了SD雄性大鼠并利用熏香煙方法建立COPD大鼠模型；通過以高脂飼料加小劑量STZ腹腔注射誘導2型糖尿病大鼠模型；并用同樣的方法同時制造COPD合并糖尿病大鼠模型。通過對大鼠肺組織切片進行觀察發現COPD組大鼠的支氣管病理變化與人類COPD的病理變化基本一致。新近研究也發現，香煙煙霧中的水溶性成分可通過增加肌球蛋白輕鏈激酶活性引起支氣管平滑肌的高反應性，引發氣道病變，導致COPD的發生發展[12]。COPD合并糖尿病組大鼠肺組織小氣道上皮鋸齒狀增生增厚及管壁纖維性增生增厚更加明顯，肺泡氣腫更明顯。COPD的形成與氣道炎癥有關。有多種炎性細胞參與，炎癥反應會引起氣道損傷，而高血糖更加重了COPD大鼠模型的氣道炎癥反應，這主要與高血糖患者更易發生細菌感染，從而加重氣道炎癥反應有關。Baker等[13]對慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）并高血糖住院患者進行回顧性病例分析也發現，隨著血糖升高，痰G-桿菌陽性率也相應升高，約是非高血糖患者的1.8～2.4倍。Moretti等[14]對住中間監護病房的重癥AECOPD研究發現，高血糖能夠延長伴有糖尿病的AECOPD患者住院時間和增加痰液中的G-菌的檢出率。本研究中，盡管對糖尿病大鼠飼以高脂飼料，但COPD并糖尿病大鼠的炎癥反應仍較COPD組為重，這與Esquivel研究結果相似[15]。本研究通過建立COPD合并糖尿病大鼠模型，以期對臨床中遇到的具體問題，通過動物實驗的方法查找合理的治療措施，為下一步的研究夯實了基礎。
綜上，大鼠肺組織病理及血糖改變表明本實驗成功建立了大鼠COPD并糖尿病模型，故采用SD雄性大鼠熏香煙方法聯合高脂飼料加小劑量STZ腹腔注射誘導COPD合并糖尿病大鼠模型方法成功有效，為COPD并糖尿病發病機制的研究提供了一定的基礎。
吸煙可以導致肺癌及慢性阻塞性肺病（COPD）[1]，COPD是一種不完全可逆的氣流受阻且呈進行性發展為特征的疾病，多與肺部對有害顆粒和氣體所產生的炎癥反應相關，其本質是氣道慢性非特異性炎癥性疾病，以小氣道阻力增加、持續氣流受限為主要特點。糖尿病是慢性進行性內分泌及代謝性疾病，預計2025年將增至3億[2]。臨床工作中COPD患者合并血糖升高狀況十分常見，我院在前期研究中發現住院COPD患者中約有12%存在血糖升高，尤其急性發作期合并血糖升高狀況更為常見，深入研究發現二者有一定的聯系，COPD的急性加重常可作為誘發高血糖的因素之一，而患者本身合并的代謝紊亂更加重這一現象[3]。在前期研究中，我們采用強化血糖控制對COPD合并高血糖患者進行治療，取得了較好的效果[4]。本實驗擬采用連續被動吸煙的方式建立COPD大鼠模型[5]，用鏈脲佐菌素（STZ）誘導Sprague-Dawley（SD）大鼠的糖尿病模型[6]，兩種方法協同建立COPD合并糖尿病模型，為進一步研究COPD合并糖尿病奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
80只健康雄性無特定病原體級SD大鼠，日齡40 d，體質量（200 ± 20）g，購于四川大學實驗動物中心。
1.2 主要儀器和試劑
天下秀牌香煙（成都卷煙廠生產，煤焦油含量14 mg/支，煙氣煙堿量1.0 mg/支）；STZ（美國Sigma公司）；檸檬酸鈉、檸檬酸（上海前塵生物科技有限公司）；Sure step血糖儀（美國強生有限公司）。
1.3 動物分組和模型制備
將80只大鼠按體質量小到大依次編號為1～80號，使第1～4號為一配伍組，第5～8號為一配伍組，余類推。結合隨機數字表分成4組，即正常組、COPD組、糖尿病組和COPD+糖尿病組，每組各20只。
1.3.1 正常組大鼠的飼養
正常組大鼠在相同飼養環境下以普通飼料進行飼養。
1.3.2 糖尿病模型的制備
SD大鼠飼養1周，先建立糖尿病模型。把糖尿病組及糖尿病+COPD組SD大鼠40只飼以高脂飼料（100 g基礎飼料+20 g豬油+10 g奶粉）并加小劑量STZ腹腔注射誘導2型糖尿病大鼠模型。STZ溶解于0.1 mol/L的枸櫞酸鈉溶液中（pH值4.5），按照30 mg/kg的劑量進行腹腔注射誘導糖尿病模型，1次/周，共4周（28 d），配制好的溶液在10 min內用完。4周后鼠尾靜脈采血，用血糖儀測血糖，以血糖＞16.7 mmol/L視為造模成功[7]。
1.3.3 COPD模型的制備
COPD模型的制備采用煙熏法進行。用自制熏煙箱將COPD組大鼠分別放置于5個體積為100 cm×70 cm×70 cm熏煙箱中，將10支香煙捆綁在點煙室點燃，通過通氣裝置將香煙煙霧注入熏煙箱內，對大鼠進行被動吸煙染毒，燃燒時間為15 min，然后點燃第2批香煙，重復上述操作，依次類推，共約1 h，2次/d，每次吸煙間隔為4 h，連續90 d。
1.3.4 COPD+糖尿病模型的制備
按照COPD模型的制作方法對COPD+糖尿病組大鼠進行COPD造模，并同時進行糖尿病造模。
1.4 標本的制作及指標檢測
24、90 d后取大鼠鼠尾血進行血糖檢測。COPD造模完成后，大鼠經斷頸處死，打開胸腔，從胸腔中完整地取出支氣管和肺組織，經氣管注入4%甲醛溶液，結扎氣管，再將全肺浸泡于相同濃度的甲醛溶液中固定24 h，取右下肺組織用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察各組肺組織病理改變。每張病理切片隨機選取左、右、上、中、下5個視野用數碼相機進行采像，并用Metamorph圖像分析軟件（美國Universal Imaging Corporation）分析肺組織結構的形態學變化，測量平均肺泡面積及肺泡吸光度（舊稱光密度）值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，血糖分析采用重復測量資料的方差分析，多組間比較采用方差分析，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組大鼠肺組織病理學改變
正常組：肺泡結構正常連續，小支氣管未見腺體及炎性細胞浸潤，肺泡壁完整。COPD組：大鼠支氣管黏膜上皮脫落，管壁及周圍有單核細胞和淋巴細胞浸潤，肺泡結構紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡彈性減弱，呈囊狀擴張，肺泡腔擴大，部分融合成肺大皰。糖尿病組：大鼠支氣管上皮纖毛有倒伏現象，基膜下有炎性細胞浸潤，肺泡間隔增寬，肺間質增加。COPD+糖尿病組：支氣管黏膜上皮脫落嚴重，基膜下有大量的炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞，部分融合成肺大皰。見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理切片（HE×100） a. 正常組 b. COPD組 c. 糖尿病組 d. COPD+糖尿病組
2.2 各組大鼠肺組織平均肺泡面積及吸光度值
COPD組、糖尿病組及COPD+糖尿病組中肺組織平均肺泡面積較對照組增大，吸光度值明顯下降，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表 1。
表1
肺組織平均肺泡面積與吸光度值（n=20，2.3 各組大鼠血糖的變化
正常對照組大鼠造模前后血糖差異無統計學意義（P＞0.05）。糖尿病造模后（28 d）及COPD造模成功后（90 d），糖尿病組及COPD+糖尿病組大鼠血糖較本組造模前差異均有統計學意義（P＜0.05）；尤以COPD+糖尿病組較明顯，從造模前（9.0 ± 0.4） mmol/L變為（28.9 ± 0.8） mmol/L。造模前組間差異無統計學意義，造模后糖尿病組及COPD+糖尿病組較COPD及正常組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠不同時間血糖（n=20，3 討論
COPD與糖尿病是影響人類健康且發病率較高的兩類疾病。COPD是一種以持續氣流受限為主要臨床特征、異常的氣道炎癥為主要病理特征的慢性氣道炎性疾病。它是影響人類健康的重大公共衛生難題[8]，由于其患病人數多，死亡率高，社會經濟負擔重，并使患者的生活質量明顯降低[9]，已引起世界各國的極大關注。COPD的本質特征是氣道的慢性炎癥，氣道的炎癥使管腔狹窄，形成不完全阻塞，慢性炎癥破壞小支氣管壁軟骨，失去支氣管正常的支架作用，出現咳嗽、咳痰、呼吸困難等癥狀，目前已發現白細胞介素6等很多炎癥因子以不同的形式參與了COPD的發病機制[10]，為抗炎治療提供了理論依據。糖尿病也是嚴重影響人們健康的疾病，其發病可能與遺傳、肥胖及吸煙等有關。在臨床工作中COPD患者常常需要霧化吸入或靜脈及口服應用激素抗炎治療，而激素應用可使血糖水平升高，如何處理好二者間的矛盾，尚需進一步研究。本研究基于這個矛盾成功建立COPD并糖尿病大鼠模型，為進一步臨床研究奠定基礎。
采用單純熏香煙的方法建立COPD動物模型需3個月甚至更長時間。20世紀80年代，國外就有人運用復合的造模方法制造動物肺氣腫模型。Hoidal等[11]的實驗表明，如果同時用熏香煙的方法，給予不足以致肺氣腫劑量的蛋白酶就可以誘發金黃地鼠肺氣腫，而單獨使用煙熏誘發肺氣腫所需的時間較長。制作COPD并糖尿病的動物模型有利于進一步闡明COPD并糖尿病的遺傳背景、誘發因素、發病機制，并由此對疾病進行防治。
本實驗采用了SD雄性大鼠并利用熏香煙方法建立COPD大鼠模型；通過以高脂飼料加小劑量STZ腹腔注射誘導2型糖尿病大鼠模型；并用同樣的方法同時制造COPD合并糖尿病大鼠模型。通過對大鼠肺組織切片進行觀察發現COPD組大鼠的支氣管病理變化與人類COPD的病理變化基本一致。新近研究也發現，香煙煙霧中的水溶性成分可通過增加肌球蛋白輕鏈激酶活性引起支氣管平滑肌的高反應性，引發氣道病變，導致COPD的發生發展[12]。COPD合并糖尿病組大鼠肺組織小氣道上皮鋸齒狀增生增厚及管壁纖維性增生增厚更加明顯，肺泡氣腫更明顯。COPD的形成與氣道炎癥有關。有多種炎性細胞參與，炎癥反應會引起氣道損傷，而高血糖更加重了COPD大鼠模型的氣道炎癥反應，這主要與高血糖患者更易發生細菌感染，從而加重氣道炎癥反應有關。Baker等[13]對慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）并高血糖住院患者進行回顧性病例分析也發現，隨著血糖升高，痰G-桿菌陽性率也相應升高，約是非高血糖患者的1.8～2.4倍。Moretti等[14]對住中間監護病房的重癥AECOPD研究發現，高血糖能夠延長伴有糖尿病的AECOPD患者住院時間和增加痰液中的G-菌的檢出率。本研究中，盡管對糖尿病大鼠飼以高脂飼料，但COPD并糖尿病大鼠的炎癥反應仍較COPD組為重，這與Esquivel研究結果相似[15]。本研究通過建立COPD合并糖尿病大鼠模型，以期對臨床中遇到的具體問題，通過動物實驗的方法查找合理的治療措施，為下一步的研究夯實了基礎。
綜上，大鼠肺組織病理及血糖改變表明本實驗成功建立了大鼠COPD并糖尿病模型，故采用SD雄性大鼠熏香煙方法聯合高脂飼料加小劑量STZ腹腔注射誘導COPD合并糖尿病大鼠模型方法成功有效，為COPD并糖尿病發病機制的研究提供了一定的基礎。
