引用本文： 陳雪融, 肖軍, 薛秒. 外周血內毒素誘導產物在細菌性肺炎與肺結核鑒別中的意義. 華西醫學, 2016, 31(10): 1653-1656. doi: 10.7507/1002-0179.201600455 復制
細菌性肺炎與肺結核的鑒別診斷是臨床工作中的難點之一。雖然病原學檢查仍為金標準，但痰細菌培養陽性率通常僅為30%～40%。通過生物標志物鑒別細菌性肺炎與肺結核是可行的途徑。醫院獲得性肺炎病原體通常為革蘭陰性（G?）菌，我們通過檢測我院住院確診的50例肺結核患者和50例醫院獲得性肺炎患者內毒素誘導產生的外周血T淋巴細胞亞群及細胞因子變化情況，以及降鈣素原（PCT）水平，探討內毒素誘導產物在細菌性肺炎與肺結核鑒別診斷中的臨床意義，以期為兩者的鑒別診斷探索更多的方法。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2015年1月－8月在我院住院確診的50例醫院獲得性肺炎患者作為肺炎組，其中男28例，女22例；年齡18～75歲，平均（68.2±16.3）歲。所有患者均經痰涂片、痰培養、血常規、血生物化學和（或）胸部影像學等檢查，臨床診斷標準符合中華醫學會呼吸病學分會1999年發布的《醫院獲得性肺炎診斷和治療指南（草案）》[1]。排除標準：①孕婦或哺乳期婦女；②肺間質性疾病；③明確或高度懷疑肺結核；④肺癌、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染；⑤其他感染性疾病；⑥嚴重外傷、燒傷、較大外科手術者。同期隨機采集我院確診的50例肺結核患者作為肺結核組，其中男32例，女18例；年齡18～70歲，平均（44.5±18.9）歲。結合臨床表現、痰結核菌涂片及培養、結核菌素試驗、胸部影像學檢查及治療效果診斷。肺結核診斷標準符合中華醫學會結核分會2001年制定的《肺結核診斷及治療指南》[2]。排除標準：①孕婦或哺乳期婦女；②間質性肺疾病；③肺癌、HIV感染；④其他感染性疾病；⑤嚴重外傷、燒傷、較大外科手術等患者。兩組研究對象的性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 外周血內毒素誘導后細胞因子流式檢測
收集兩組患者的靜脈血2 mL，以乙二胺四乙酸抗凝，2 h內送至實驗室。每份樣本在24孔板中每孔加入0.5 mL，與1640培養基400 μL混合，加入內毒素5 μg/mL共100 μL刺激，終體積為1 mL，在36℃ 5%二氧化碳孵箱中培養，以佛波酯（40 ng/mL，100 μL）刺激為陽性對照。孵育12 h后加入golgi-plug（5 mg/mL布雷菲德菌素A）共孵育12 h富集細胞因子。孵育畢，取出標本離心6 min，棄上清液，余者加入ACK紅細胞裂解液溶解紅細胞，5 min后離心，棄上清液，洗滌，離心，加入CD3-V450、CD4-PE-CF594、CD8-APCCy7抗體黑暗中孵育30 min，洗滌離心，加入固定劑/破膜劑，混合后孵育20 min，洗滌離心；加入胞內抗體干擾素（IFN）-γ-PE、腫瘤壞死因子（TNF）-α-FITC、白細胞介素（IL）-2 Percp-cytm、IL-10-APC，混合后孵育30 min，最后離心，洗滌，以磷酸緩沖鹽溶液重懸后在LSR Ⅱ上機檢測，收集100 000個細胞。細胞數目以外周血白細胞計數乘以流式檢測所得百分比而得。
1.2.2 血清PCT檢測
抽取兩組患者的靜脈血3 mL用于血清PCT檢測，1 h內檢測完畢。血清PCT檢測采用免疫熒光定量檢測方法。按操作程序進行，結果以PCT≥0.25 ng/mL為PCT陽性。
1.2.3 全血C反應蛋白（CRP）、IL-6檢測
全血CRP、IL-6采用免疫熒光檢測方法，由韓國BodiTeeh Med Ine公司提供的配套試劑和儀器檢測。以CRP≥10 mg/L、IL-6≥15 pg/mL為陽性。
1.3 統計學方法
流式數據用Flowjo軟件設門分析。采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的數據采用中位數及四分位數間距表示，兩組間比較采用秩和檢驗。計數資料用例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組外周血T細胞亞群與細胞因子比較
經內毒素刺激后，肺炎組與肺結核組相比，外周血CD3+ CD4+亞群明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；CD3+ CD8+細胞亞群數目也較多，但差異無統計學意義（P＞0.05）。肺炎組兩亞群產生IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10均較結核組明顯升高，CD3+ CD4+亞群細胞分泌的細胞因子也明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
兩組外周血T細胞亞群與細胞因子比較（n=50，x±s，個/mm3）
2.2 兩組外周血PCT、CRP和IL-6活性水平比較
肺炎組PCT、CRP、IL-6活性水平均較肺結核組顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
兩組外周血PCT、CRP和IL-6活性水平比較[n=50，M（QR）]
2.3 兩組外周血PCT、IL-6、CRP陽性率比較
肺炎組PCT、IL-6、CRP陽性率均較肺結核組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
兩組外周血PCT、IL-6、CRP陽性率比較[n=50，例（%）]
3 討論
內毒素作為G?菌的重要抗原在誘導肺炎宿主體內一系列免疫反應、病理生理變化方面起著非常重要的作用。Toll樣受體（TLR）4通路不僅在固有免疫中發揮作用，通過一氧化氮依賴或非依賴途徑在細胞吞噬及直接殺滅細菌的過程中都扮演著關鍵角色；而且，TLR4激活后還能通過MyD88依賴或非依賴途徑激活巨噬細胞內蛋白激酶，最終激活核因子-κB或干擾素調節因子3，調控各細胞因子如TNF-α的釋放，影響抗原的提呈、T淋巴細胞的活化，對殺滅細菌產生重要影響。此外，近年研究表明T淋巴細胞上也有TLR4受體表達[3]。Arranz等[4]報道采用流式技術探知小鼠結腸的CD4及CD8 T細胞上有TLR4表達，且在結腸炎癥時表達上調。TLR4配體還可直接作用于T淋巴細胞影響其活化與遷徙[3]。T淋巴細胞活化后，釋放各種細胞因子，形成局部炎癥反應及免疫保護。本研究結果表明以G?菌為主要病原體的肺炎組患者外周血在內毒素刺激下T淋巴細胞分泌Th1細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2明顯增加，同時抗炎因子IL-10也明顯增加，提示Th1細胞及調節T淋巴細胞均發揮作用，維持炎癥平衡，促進病原體的消滅。肺結核組患者的外周血受刺激后則上述細胞因子明顯低于肺炎組，提示T淋巴細胞亞群（CD3+ CD4+亞群）及細胞因子可作為鑒別證據，與Su等[5]的結論一致。值得注意的是，肺結核患者外周血受刺激仍有反應，可能與患者在環境內毒素的暴露有關。
細菌內毒素還可誘導產生PCT。PCT是人類降鈣素的前體物質，為含116個氨基酸的蛋白質，相對分子質量為13 000，其穩定性好，體內半衰期為25～30 h。PCT在健康人血清中水平極低，幾乎不能檢測到[6]。當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時它在血漿中的水平升高[7-8]；自身免疫、過敏和病毒感染時PCT不會升高。PCT反映了全身炎癥反應的活躍程度。影響PCT水平的因素包括被感染器官的大小和類型、細菌的種類、炎癥的程度和免疫反應的狀況。近年來，有文獻報道PCT作為嚴重細菌感染的重要指標在非結核性肺部感染疾病中的水平明顯高于肺結核[9-10]，尤其是社區獲得性肺炎的相關研究較多[11-12]，PCT與其他細菌感染的傳統診斷指標如白細胞計數、紅細胞沉降率、CRP、細菌培養等比較，PCT具有早期、快速、靈敏度和特異性高的特點[13]，對預測感染有良好的診斷價值[14]。本研究結果表明，肺炎組患者PCT水平明顯升高，而肺結核組PCT水平接近正常，肺炎組PCT陽性檢出率94.0%，明顯高于肺結核組，差異有統計學意義（P＜0.05）。IL-6也系G?菌感染后病原體相關分子模式包括內毒素誘導巨噬細胞所分泌，肺炎組外周血IL-6明顯升高。另外，內毒素也有直接或間接調節CRP的作用[15]。所以通過觀察患者PCT、IL-6、CRP水平來區分感染的性質，鑒別醫院獲得性肺炎與肺結核，能為臨床早期確定治療方案、合理用藥提供依據。
綜上，內毒素誘導產物如T淋巴細胞亞群及細胞因子、PCT、CRP定量檢測快速簡便，結果可靠，是區分結核性與醫院獲得性肺炎有前途的篩檢指標，結合其他檢查項目，可更加準確地明確感染類型，為指導臨床制定合理診療方案、合理用藥提供依據。內毒素誘導產物對肺結核和細菌性肺炎的鑒別具有一定的診斷價值，其解讀需要參考患者的臨床癥狀和其他實驗室檢測、影像學結果。
細菌性肺炎與肺結核的鑒別診斷是臨床工作中的難點之一。雖然病原學檢查仍為金標準，但痰細菌培養陽性率通常僅為30%～40%。通過生物標志物鑒別細菌性肺炎與肺結核是可行的途徑。醫院獲得性肺炎病原體通常為革蘭陰性（G?）菌，我們通過檢測我院住院確診的50例肺結核患者和50例醫院獲得性肺炎患者內毒素誘導產生的外周血T淋巴細胞亞群及細胞因子變化情況，以及降鈣素原（PCT）水平，探討內毒素誘導產物在細菌性肺炎與肺結核鑒別診斷中的臨床意義，以期為兩者的鑒別診斷探索更多的方法。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2015年1月－8月在我院住院確診的50例醫院獲得性肺炎患者作為肺炎組，其中男28例，女22例；年齡18～75歲，平均（68.2±16.3）歲。所有患者均經痰涂片、痰培養、血常規、血生物化學和（或）胸部影像學等檢查，臨床診斷標準符合中華醫學會呼吸病學分會1999年發布的《醫院獲得性肺炎診斷和治療指南（草案）》[1]。排除標準：①孕婦或哺乳期婦女；②肺間質性疾病；③明確或高度懷疑肺結核；④肺癌、人類免疫缺陷病毒（HIV）感染；⑤其他感染性疾病；⑥嚴重外傷、燒傷、較大外科手術者。同期隨機采集我院確診的50例肺結核患者作為肺結核組，其中男32例，女18例；年齡18～70歲，平均（44.5±18.9）歲。結合臨床表現、痰結核菌涂片及培養、結核菌素試驗、胸部影像學檢查及治療效果診斷。肺結核診斷標準符合中華醫學會結核分會2001年制定的《肺結核診斷及治療指南》[2]。排除標準：①孕婦或哺乳期婦女；②間質性肺疾病；③肺癌、HIV感染；④其他感染性疾病；⑤嚴重外傷、燒傷、較大外科手術等患者。兩組研究對象的性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 外周血內毒素誘導后細胞因子流式檢測
收集兩組患者的靜脈血2 mL，以乙二胺四乙酸抗凝，2 h內送至實驗室。每份樣本在24孔板中每孔加入0.5 mL，與1640培養基400 μL混合，加入內毒素5 μg/mL共100 μL刺激，終體積為1 mL，在36℃ 5%二氧化碳孵箱中培養，以佛波酯（40 ng/mL，100 μL）刺激為陽性對照。孵育12 h后加入golgi-plug（5 mg/mL布雷菲德菌素A）共孵育12 h富集細胞因子。孵育畢，取出標本離心6 min，棄上清液，余者加入ACK紅細胞裂解液溶解紅細胞，5 min后離心，棄上清液，洗滌，離心，加入CD3-V450、CD4-PE-CF594、CD8-APCCy7抗體黑暗中孵育30 min，洗滌離心，加入固定劑/破膜劑，混合后孵育20 min，洗滌離心；加入胞內抗體干擾素（IFN）-γ-PE、腫瘤壞死因子（TNF）-α-FITC、白細胞介素（IL）-2 Percp-cytm、IL-10-APC，混合后孵育30 min，最后離心，洗滌，以磷酸緩沖鹽溶液重懸后在LSR Ⅱ上機檢測，收集100 000個細胞。細胞數目以外周血白細胞計數乘以流式檢測所得百分比而得。
1.2.2 血清PCT檢測
抽取兩組患者的靜脈血3 mL用于血清PCT檢測，1 h內檢測完畢。血清PCT檢測采用免疫熒光定量檢測方法。按操作程序進行，結果以PCT≥0.25 ng/mL為PCT陽性。
1.2.3 全血C反應蛋白（CRP）、IL-6檢測
全血CRP、IL-6采用免疫熒光檢測方法，由韓國BodiTeeh Med Ine公司提供的配套試劑和儀器檢測。以CRP≥10 mg/L、IL-6≥15 pg/mL為陽性。
1.3 統計學方法
流式數據用Flowjo軟件設門分析。采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的數據采用中位數及四分位數間距表示，兩組間比較采用秩和檢驗。計數資料用例數和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組外周血T細胞亞群與細胞因子比較
經內毒素刺激后，肺炎組與肺結核組相比，外周血CD3+ CD4+亞群明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；CD3+ CD8+細胞亞群數目也較多，但差異無統計學意義（P＞0.05）。肺炎組兩亞群產生IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10均較結核組明顯升高，CD3+ CD4+亞群細胞分泌的細胞因子也明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
兩組外周血T細胞亞群與細胞因子比較（n=50，x±s，個/mm3）
2.2 兩組外周血PCT、CRP和IL-6活性水平比較
肺炎組PCT、CRP、IL-6活性水平均較肺結核組顯著增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
兩組外周血PCT、CRP和IL-6活性水平比較[n=50，M（QR）]
2.3 兩組外周血PCT、IL-6、CRP陽性率比較
肺炎組PCT、IL-6、CRP陽性率均較肺結核組高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3。
表3
兩組外周血PCT、IL-6、CRP陽性率比較[n=50，例（%）]
3 討論
內毒素作為G?菌的重要抗原在誘導肺炎宿主體內一系列免疫反應、病理生理變化方面起著非常重要的作用。Toll樣受體（TLR）4通路不僅在固有免疫中發揮作用，通過一氧化氮依賴或非依賴途徑在細胞吞噬及直接殺滅細菌的過程中都扮演著關鍵角色；而且，TLR4激活后還能通過MyD88依賴或非依賴途徑激活巨噬細胞內蛋白激酶，最終激活核因子-κB或干擾素調節因子3，調控各細胞因子如TNF-α的釋放，影響抗原的提呈、T淋巴細胞的活化，對殺滅細菌產生重要影響。此外，近年研究表明T淋巴細胞上也有TLR4受體表達[3]。Arranz等[4]報道采用流式技術探知小鼠結腸的CD4及CD8 T細胞上有TLR4表達，且在結腸炎癥時表達上調。TLR4配體還可直接作用于T淋巴細胞影響其活化與遷徙[3]。T淋巴細胞活化后，釋放各種細胞因子，形成局部炎癥反應及免疫保護。本研究結果表明以G?菌為主要病原體的肺炎組患者外周血在內毒素刺激下T淋巴細胞分泌Th1細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2明顯增加，同時抗炎因子IL-10也明顯增加，提示Th1細胞及調節T淋巴細胞均發揮作用，維持炎癥平衡，促進病原體的消滅。肺結核組患者的外周血受刺激后則上述細胞因子明顯低于肺炎組，提示T淋巴細胞亞群（CD3+ CD4+亞群）及細胞因子可作為鑒別證據，與Su等[5]的結論一致。值得注意的是，肺結核患者外周血受刺激仍有反應，可能與患者在環境內毒素的暴露有關。
細菌內毒素還可誘導產生PCT。PCT是人類降鈣素的前體物質，為含116個氨基酸的蛋白質，相對分子質量為13 000，其穩定性好，體內半衰期為25～30 h。PCT在健康人血清中水平極低，幾乎不能檢測到[6]。當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭時它在血漿中的水平升高[7-8]；自身免疫、過敏和病毒感染時PCT不會升高。PCT反映了全身炎癥反應的活躍程度。影響PCT水平的因素包括被感染器官的大小和類型、細菌的種類、炎癥的程度和免疫反應的狀況。近年來，有文獻報道PCT作為嚴重細菌感染的重要指標在非結核性肺部感染疾病中的水平明顯高于肺結核[9-10]，尤其是社區獲得性肺炎的相關研究較多[11-12]，PCT與其他細菌感染的傳統診斷指標如白細胞計數、紅細胞沉降率、CRP、細菌培養等比較，PCT具有早期、快速、靈敏度和特異性高的特點[13]，對預測感染有良好的診斷價值[14]。本研究結果表明，肺炎組患者PCT水平明顯升高，而肺結核組PCT水平接近正常，肺炎組PCT陽性檢出率94.0%，明顯高于肺結核組，差異有統計學意義（P＜0.05）。IL-6也系G?菌感染后病原體相關分子模式包括內毒素誘導巨噬細胞所分泌，肺炎組外周血IL-6明顯升高。另外，內毒素也有直接或間接調節CRP的作用[15]。所以通過觀察患者PCT、IL-6、CRP水平來區分感染的性質，鑒別醫院獲得性肺炎與肺結核，能為臨床早期確定治療方案、合理用藥提供依據。
綜上，內毒素誘導產物如T淋巴細胞亞群及細胞因子、PCT、CRP定量檢測快速簡便，結果可靠，是區分結核性與醫院獲得性肺炎有前途的篩檢指標，結合其他檢查項目，可更加準確地明確感染類型，為指導臨床制定合理診療方案、合理用藥提供依據。內毒素誘導產物對肺結核和細菌性肺炎的鑒別具有一定的診斷價值，其解讀需要參考患者的臨床癥狀和其他實驗室檢測、影像學結果。
