循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）是指從實體腫瘤原發或轉移病灶脫落并侵入外周血循環的腫瘤細胞，是惡性腫瘤遠處轉移的主要原因。目前 CTC 檢測技術發展迅速，但由于外周血中 CTC 個數稀少且存在較大的異質性，限制了許多檢測技術的應用。SE-iFISH 技術將差相富集、瘤標免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交（immunostaining-fluorescence in situ hybridization，i-FISH）結合，不依賴腫瘤上皮細胞表面標示物的表達，對 CTC 同時進行瘤標染色與 i-FISH 染色體計數的雙重檢測，具有高靈敏性和高特異性。現就 CTC 檢測方法及 SE-iFISH 技術檢測 CTC 的臨床應用作一綜述。
引用本文： 張靜, 蔣婷婷, 陳念永. 循環腫瘤細胞檢測及 SE-iFISH 技術檢測循環腫瘤細胞的臨床應用. 華西醫學, 2017, 32(7): 1100-1103. doi: 10.7507/1002-0179.201607140 復制
1 CTC 概述
惡性腫瘤的復發和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因。越來越多的分子生物學和臨床研究結果表明，腫瘤轉移很可能在腫瘤發生的早期就已經出現，而目前傳統的影像學及血清標志物的檢查，難以早期發現腫瘤的轉移或復發，使患者可能錯過最佳的治療選擇[1]。因此，早期發現腫瘤的微轉移不僅可以判斷腫瘤的復發轉移，對指導臨床治療也具有重要意義。早在 1869 年，Ashworth 觀察到 1 例死于轉移瘤患者的外周血中存在一種血細胞，同尸檢發現的原發腫瘤細胞相似，首次提出了循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）這一概念[2]。脫落入血的腫瘤細胞即 CTC，可在某一特定器官處黏附、浸潤并穿出血管，形成新的腫瘤轉移灶，最終導致癌癥患者的死亡[3]。
Cristofanilli 等[4]在一項多中心、前瞻性臨床試驗中檢測了 177 例轉移性乳腺癌患者 7.5 mL 外周血中 的CTC 數量，結果發現治療前外周血中 CTC≥5 個/7.5 mL的患者與 <5 個/7.5 mL的患者相比，預后較差。同樣，分別在結直腸癌、胃癌、前列腺癌和肺癌的研究中也得出 CTC 可作為癌癥患者預后評估的獨立預測因素[5-8]。2007 年美國臨床腫瘤學會已認可 CTC 計數可作為乳腺癌一種新的腫瘤標志物[9]。且 CTC 作為一種非侵入性實時的腫瘤生物動力學標志物，可快速評估腫瘤的治療反應與監測腫瘤耐藥性的產生[10]。因此，CTC 在腫瘤的早期診斷、預后評估、復發轉移監測、療效評價及腫瘤的個體化治療等方面有重要意義。與傳統的組織學及影像學檢查相比，CTC 檢測有更高的可重復性和敏感度，且侵襲性小、可連續多次檢測，并作為一種腫瘤的“液態活檢”手段被廣泛認可[11]。所以 CTC 檢測技術具有廣闊的臨床應用前景。
目前，雖 CTC 檢測技術眾多，但各種檢測技術在靈敏度、特異性和可重復性等方面還存在較多問題，隨著人們對癌癥轉移機制研究的深入，CTC 檢測開始面臨諸多困難與挑戰。因此，使 CTC 檢測技術廣泛應用于臨床，發展高特異性、高敏感性以及重復性好的 CTC 檢測技術顯得尤為重要。
2 CTC 檢測技術
由于外周血中 CTC 數量極稀少，通常腫瘤患者外周血中 CTC 濃度只有 1～10 個/10 mL[12]。因此，為提高檢測敏感性，CTC 檢測通常需對外周血中的腫瘤細胞分離富集處理后再進行識別。
2.1 CTC 的分離和富集
目前 CTC 的分離和富集技術按其原理主要分為生物化學方法和物理方法兩大類[13-14]。
2.1.1 生物化學分離法 基于生物化學原理的 CTC 分離法主要是利用抗原-抗體特異性結合原理捕獲 CTC，是目前 CTC 檢測分離的主要方法。其依賴于腫瘤細胞表面上皮性抗原的表達，而正常人血液中不存在表達上皮性抗原的細胞，從而使腫瘤細胞得以分離，有較高的特異性；主要使用免疫磁珠、納米基質和微流體芯片等作為載體。
2004 年首先通過美國食品藥品監督管理局認證的 CTC 檢測技術 CellSearch 系統，就是利用偶聯了抗上皮細胞黏附分子/表皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體的免疫磁珠去捕獲表達 EpCAM 抗原的腫瘤細胞，從而實現 CTC 的分離，并后續利用細胞表面細胞角蛋白（cytokeratins，CK）染色識別檢測 CTC，已被用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的 CTC 檢測計數[15]。但有研究表明，不是所有的 CTC 均表達 EpCAM。Gires 等[16]指出 EpCAM 高表達于上皮性腫瘤的原發灶或者轉移灶，但從實體腫瘤脫落入血的 CTC 中表達率低，不同組織來源的腫瘤細胞甚至同一種腫瘤細胞在治療前后 EpCAM 的表達情況均可能存在很大差異，甚至有的腫瘤細胞完全不表達 EpCAM（如黑色素瘤）。而且，腫瘤細胞發生上皮間質性轉化過程中，可能造成 CK 大量降解，從而引起假陰性。Li 等[17]利用 CellSearch 技術對 49 例治療前后進展期胃癌患者 7.5 mL 外周血進行檢測，其 CTC 陽性率只有 54.8%。因此，由于腫瘤細胞表面標志物表達的異質性及不穩定性可導致捕獲率的降低，同時亦不適用于檢測所有腫瘤來源的 CTC。此外，由于 CTC 表達的 EpCAM 被抗體結合并交聯，導致了細胞內信號傳導通路的激活，使得 CTC 原有的生物特性發生改變而不再適于后續一系列的研究。上述問題都極大地限制了 CTC 生物化學分離法的應用。
2.1.2 物理分離法 密度梯度離心法和膜濾過分離法是目前常用的 2 種 CTC 物理分離法。其中，依賴于腫瘤細胞尺寸大小的膜過濾法是應用最廣泛的物理分離方法，其基于 CTC 體積偏大且絕大多數血細胞均小于 CTC 的假說，通過一定孔徑的聚碳酸酯膜過濾分離出 CTC，此方法可操作性強，保持了腫瘤細胞活性。但血液中 CTC 的大小亦有異質性，可能存在與白細胞體積相似甚至小于白細胞的 CTC，導致該項技術的敏感性降低[18]。
密度梯度離心法是目前常用的一種簡便、有效的 CTC 物理分離法，該方法利用血液中各種細胞密度不同的原理，離心后將單個核細胞（其中包含 CTC）從粒細胞、紅細胞中分離出來。傳統的 Ficoll 分離法，以及在此基礎上發展的新的 OncoQuick 分離法，雖然已成功分離出術后結直腸癌患者外周血中的 CTC，但分離過程中會丟失少量腫瘤細胞，腫瘤細胞的回收率低，導致 CTC 檢測的靈敏性和穩定性低[19]。此外，Harouaka 等[14]還介紹了利用細胞不同變形性、不同帶電特性等物理性質分離 CTC，這些物理分離技術缺乏高特異性和高敏感性，目前還在繼續研究中。
2.2 CTC 的識別
識別分離富集后的 CTC 的方法較多，目前主要包括核酸分析、免疫染色、熒光原位雜交等分析技術。
核酸分析主要是利用聚合酶鏈反應、逆轉錄聚合酶鏈反應、下一代測序以及最近的 RNA 原位雜交等技術對血液中腫瘤細胞來源的游離 DNA 或者 mRNA 進行檢測，該類方法靈敏性高，可重復性好。但由于血液中的核酸可能直接來源于壞死脫落的腫瘤細胞、腫瘤相關的外來體、細胞碎片或外周血中溶解的 CTC 等，可導致檢測結果假陽性。此外，由于檢測的是游離核酸，經過細胞內 DNA 表達或轉錄后修飾作用，該方法不能對 CTC 進行形態學、分子特性等分析，也不能計數 CTC[13, 20]。
免疫細胞化學法或免疫熒光染色技術是目前常用的 CTC 檢測技術，是在細胞富集的基礎上，針對腫瘤細胞表達的特異蛋白或基因進行原位檢測，并對篩選后的細胞完成鑒定。該方法可對 CTC 進行形態學分析，特異性好，但由于腫瘤細胞表面蛋白表達的異質性和不穩定性，該方法敏感性低，且不通用于不同腫瘤[21]。因此，發展一種與腫瘤類型、狀態及細胞表面標志物表達情況無關，可有效識別有異質性的 CTC 的檢測技術是非常重要的。
3 SE-iFISH 技術檢測 CTC 的臨床應用
3.1 SE-iFISH 技術的優勢
SE-iFISH 技術即差相富集-瘤標免疫熒光染色-染色體原位雜交技術，該技術將差相富集、瘤標免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交（immunostaining-fluorescence in situ hybridization，i-FISH）技術結合，是一種新型的 CTC 檢測技術，使用差相富集法分離富集 CTC，再將富集后的 CTC 同時進行瘤標免疫熒光染色及染色體熒光原位雜交，具有高靈敏性和高特異性。
3.1.1 差相富集分離 CTC 差相富集法是一種新的 CTC 陰性富集法，該方法利用免疫磁珠偶聯多種抗白細胞抗體使去白細胞達 4～5 log，并使用非低滲溶破法去除紅細胞，保證了 CTC 的完整性以用于后續研究，包括原代細胞培養、單細胞測序等。該技術不依賴于腫瘤上皮細胞表面標志物的表達，不限于上皮來源的腫瘤細胞，可通用于多種腫瘤細胞的分離[13]。與傳統的陰性富集法相比，該方法敏感性高、可重復性強。
3.1.2 i-FISH 識別 染色體非整倍性改變是細胞遺傳學染色體不穩定性的表現之一，與腫瘤的發生密切相關，研究表明幾乎所有惡性腫瘤中均發現有染色體非整倍性改變，呈現異倍體，但并非所有腫瘤細胞內染色體數目都顯現異常[22]。i-FISH 技術將富集后的 CTC 同時進行瘤標免疫熒光染色（EpCAM、CK 等）與 8 號染色體著絲粒探針（centromere probe 8，CEP8）標記計數染色體，同時檢測 CTC 免疫瘤標表型及染色體核型。有研究報道，CTC 為有核細胞，其 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染色陽性，而不表達白細胞共同抗原，即白細胞分化抗體群 45（cluster of differentiation 45，CD45）表達陰性，故將 EpCAM 或 CK+/CD45－/DAPI+/CEP8 =2、EpCAM 或 CK+/CD45－/DAPI+/CEP8>2、EpCAM 或 CK－/CD45－/DAPI+/CEP8>2 的細胞定義為 CTC 細胞[23]。該方法不依賴于 EpCAM/CK 的表達，可通用于所有實體腫瘤。此外，還可以加入其他相關瘤標抗體進行同步染色，根據特定瘤標表達情況及染色體異常特點，識別 CTC 亞型細胞進而探索 CTC 亞型在腫瘤臨床上的應用價值[24]。
3.2 SE-iFISH 技術的臨床應用
SE-iFISH 技術作為一種新型的 CTC 檢測技術，與傳統的 CTC 檢測技術相比具有更高的特異性和敏感性。Li 等[17]研究對比了 SE-iFISH 技術與經典的 CellSearch 系統在 49 例進展期胃癌患者外周血中 CTC 檢測結果，SE-iFISH 技術檢測 CTC 陽性率為 90.5%，而 CellSearch 系統檢測的陽性率只有 54.8%。Ge 等[18]利用 SE-iFISH 技術檢測肺癌和食管癌患者外周血中的 CTC 仍獲得了較高的檢出率，分別是 92% 和 87%。Ge 等[18]研究中還對比了 SE-iFISH 技術與 CellSearch 技術對不同腫瘤細胞系的 CTC 檢出率，其中高表達 EpCAM 的乳腺癌 SK-BR-3 細胞的 CTC 檢出率分別是 88% 和 87%，而低表達 EpCAM 的膀胱癌 T24 細胞 CTC 檢出率分別是 77% 和 48%。更有意義的是，不表達 EpCAM 的黑色素瘤 SK-Mel-28 細胞外周血中沒有被 CellSearch 系統檢測出 CTC，而 SE-iFISH 技術對其 CTC 檢出率高達 70%，表明了 SE-iFISH 技術在 CTC 檢測中的優勢。同樣，Gao 等[23]在一項關于 CTC 對胰腺癌預后影響研究中，利用 SE-iFISH 技術檢測 25 例治療前的胰腺癌患者 7.5 mL 外周血中 CTC，并對健康人群進行陰性對照，發現以 CTC 個數 2 個/7.5 mL 外周血作為計數節點，SE-iFISH 技術檢測胰腺癌 CTC 的敏感性和特異性分別是 88% 和 90%，并表明外周血 CTC 檢測結合血清學糖類抗原 19-9 檢查，對胰腺癌的發現率可達 100%，而外周血中 CTC 水平高低與胰腺癌患者總生存期呈負相關。而 利用 CellSearch 系統對胰腺癌外周血 CTC 的檢出率只有 11%[25]。以上研究都表明了 SE-iFISH 技術在 CTC 檢測中的優勢，具有重復性好、敏感性和特異性高的特點。
隨著對腫瘤研究的深入，CTC 的簡單計數將不再滿足臨床及實驗研究的需求。SE-iFISH 技術還可對不同腫瘤進行瘤標免疫染色及利用染色體探針對 CTC 進行染色體核型分析，進一步研究 CTC 亞型在腫瘤療效評估、復發轉移檢測及預后方面的臨床意義。 Li 等[17]利用 i-FISH 技術研究胃癌患者 CTC 表面人類表皮生長因子受體 2（human epidermalgrowth factor receptor-2，Her-2）表達狀態與曲妥珠單抗靶向治療療效的關系，發現 Her-2 表達陽性的 CTC 清除率與腫瘤靶向治療療效密切相關。并報道胃癌患者對化療的原發性耐藥可能與三倍體 CTC（8 號染色體數目=3）相關，而四倍體或多倍體（8 號染色體數目≥5）CTC 可能與腫瘤的獲得性耐藥相關。Jiang 等[26]構建了胃神經內分泌癌的小鼠動物模型 GA0087 并研究 CTC 亞型與腫瘤化療療效之間的關系，利用 SE-iFISH 技術動態監測接受順鉑化療的 GA0087 小鼠外周血中的 35 個 CTC（只要表達人類 CK18 或 CEP8 均為 CTC），其中 27 個 CTC 在治療 62 d 后被清除，表現為對化療敏感，另外未被清除的 8 個 CTC 表現為對化療不敏感。進一步對 CTC 亞型進行分析，發現 27 個對化療敏感的 CTC 中，7 個 CTC 表型為 CK18 陰性且均為二倍體，其余 20 個 CK18 陽性的 CTC 中，15 個 CTC 為二倍體，另外 5 個 CTC 為多倍體。而 8 個對化療表現不敏感的 CTC 表型均為 CK18 陽性，包括 3 個二倍體和 5 個多倍體。表示 CK18 陰性的 CTC 均為二倍體且對化療敏感，而 CK18 陽性的 CTC 對化療的敏感性取決于 8 號染色體倍性，其中二倍體 CTC 占化療敏感的多數（75%），多倍體 CTC 占化療不敏感的大多數（63%）。上述研究表明 SE-iFISH 技術在鑒別 CTC 亞型并研究其臨床意義方面可發揮重要作用。
此外，SE-iFISH 技術分離后的 CTC 免受低滲裂解破壞及抗體捕獲的干擾，維持了 CTC 自然的細胞形態和分子特性，可用于后續系列形態學與功能性的相關研究，如單細胞測序，藥物靶向基因的表達，藥物耐受相關基因突變的檢測等，亦可行 CTC 原代細胞培養及構建腫瘤動物模型，在精準醫學時代，有望為腫瘤患者提供個體化治療依據。
4 結語
CTC 作為一種新的腫瘤“液態活檢”手段在腫瘤研究中越來越受到關注，有良好的應用前景。由于 CTC 表面標志物的異質性及不穩定性，不依賴腫瘤細胞表面標志物表達的 SE-iFISH 檢測技術表現出了明顯優勢，其有高度的敏感性和特異性，并可檢測不同組織來源的 CTC。并能將瘤標免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交整合在一起，可根據腫瘤細胞表型及染色體核型探索 CTC 亞類在腫瘤治療中的臨床意義。此外，將 SE-iFISH 技術分離后的單個 CTC 進行基因測序、細胞培養及動物模型構建，可在探索腫瘤復發轉移機制及腫瘤患者個體化治療過程中發揮重要意義。但目前 SE-iFISH 技術在 CTC 臨床檢測中的應用，有待后續高質量、多中心、大樣本的數據予以說明。且 SE-iFISH 技術檢測 CTC 費用昂貴，要將此技術廣泛應用于臨床，還需更多的后續研究以降低檢測成本。
1 CTC 概述
惡性腫瘤的復發和轉移是導致腫瘤患者死亡的主要原因。越來越多的分子生物學和臨床研究結果表明，腫瘤轉移很可能在腫瘤發生的早期就已經出現，而目前傳統的影像學及血清標志物的檢查，難以早期發現腫瘤的轉移或復發，使患者可能錯過最佳的治療選擇[1]。因此，早期發現腫瘤的微轉移不僅可以判斷腫瘤的復發轉移，對指導臨床治療也具有重要意義。早在 1869 年，Ashworth 觀察到 1 例死于轉移瘤患者的外周血中存在一種血細胞，同尸檢發現的原發腫瘤細胞相似，首次提出了循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）這一概念[2]。脫落入血的腫瘤細胞即 CTC，可在某一特定器官處黏附、浸潤并穿出血管，形成新的腫瘤轉移灶，最終導致癌癥患者的死亡[3]。
Cristofanilli 等[4]在一項多中心、前瞻性臨床試驗中檢測了 177 例轉移性乳腺癌患者 7.5 mL 外周血中 的CTC 數量，結果發現治療前外周血中 CTC≥5 個/7.5 mL的患者與 <5 個/7.5 mL的患者相比，預后較差。同樣，分別在結直腸癌、胃癌、前列腺癌和肺癌的研究中也得出 CTC 可作為癌癥患者預后評估的獨立預測因素[5-8]。2007 年美國臨床腫瘤學會已認可 CTC 計數可作為乳腺癌一種新的腫瘤標志物[9]。且 CTC 作為一種非侵入性實時的腫瘤生物動力學標志物，可快速評估腫瘤的治療反應與監測腫瘤耐藥性的產生[10]。因此，CTC 在腫瘤的早期診斷、預后評估、復發轉移監測、療效評價及腫瘤的個體化治療等方面有重要意義。與傳統的組織學及影像學檢查相比，CTC 檢測有更高的可重復性和敏感度，且侵襲性小、可連續多次檢測，并作為一種腫瘤的“液態活檢”手段被廣泛認可[11]。所以 CTC 檢測技術具有廣闊的臨床應用前景。
目前，雖 CTC 檢測技術眾多，但各種檢測技術在靈敏度、特異性和可重復性等方面還存在較多問題，隨著人們對癌癥轉移機制研究的深入，CTC 檢測開始面臨諸多困難與挑戰。因此，使 CTC 檢測技術廣泛應用于臨床，發展高特異性、高敏感性以及重復性好的 CTC 檢測技術顯得尤為重要。
2 CTC 檢測技術
由于外周血中 CTC 數量極稀少，通常腫瘤患者外周血中 CTC 濃度只有 1～10 個/10 mL[12]。因此，為提高檢測敏感性，CTC 檢測通常需對外周血中的腫瘤細胞分離富集處理后再進行識別。
2.1 CTC 的分離和富集
目前 CTC 的分離和富集技術按其原理主要分為生物化學方法和物理方法兩大類[13-14]。
2.1.1 生物化學分離法 基于生物化學原理的 CTC 分離法主要是利用抗原-抗體特異性結合原理捕獲 CTC，是目前 CTC 檢測分離的主要方法。其依賴于腫瘤細胞表面上皮性抗原的表達，而正常人血液中不存在表達上皮性抗原的細胞，從而使腫瘤細胞得以分離，有較高的特異性；主要使用免疫磁珠、納米基質和微流體芯片等作為載體。
2004 年首先通過美國食品藥品監督管理局認證的 CTC 檢測技術 CellSearch 系統，就是利用偶聯了抗上皮細胞黏附分子/表皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體的免疫磁珠去捕獲表達 EpCAM 抗原的腫瘤細胞，從而實現 CTC 的分離，并后續利用細胞表面細胞角蛋白（cytokeratins，CK）染色識別檢測 CTC，已被用于轉移性乳腺癌、結直腸癌和前列腺癌患者的 CTC 檢測計數[15]。但有研究表明，不是所有的 CTC 均表達 EpCAM。Gires 等[16]指出 EpCAM 高表達于上皮性腫瘤的原發灶或者轉移灶，但從實體腫瘤脫落入血的 CTC 中表達率低，不同組織來源的腫瘤細胞甚至同一種腫瘤細胞在治療前后 EpCAM 的表達情況均可能存在很大差異，甚至有的腫瘤細胞完全不表達 EpCAM（如黑色素瘤）。而且，腫瘤細胞發生上皮間質性轉化過程中，可能造成 CK 大量降解，從而引起假陰性。Li 等[17]利用 CellSearch 技術對 49 例治療前后進展期胃癌患者 7.5 mL 外周血進行檢測，其 CTC 陽性率只有 54.8%。因此，由于腫瘤細胞表面標志物表達的異質性及不穩定性可導致捕獲率的降低，同時亦不適用于檢測所有腫瘤來源的 CTC。此外，由于 CTC 表達的 EpCAM 被抗體結合并交聯，導致了細胞內信號傳導通路的激活，使得 CTC 原有的生物特性發生改變而不再適于后續一系列的研究。上述問題都極大地限制了 CTC 生物化學分離法的應用。
2.1.2 物理分離法 密度梯度離心法和膜濾過分離法是目前常用的 2 種 CTC 物理分離法。其中，依賴于腫瘤細胞尺寸大小的膜過濾法是應用最廣泛的物理分離方法，其基于 CTC 體積偏大且絕大多數血細胞均小于 CTC 的假說，通過一定孔徑的聚碳酸酯膜過濾分離出 CTC，此方法可操作性強，保持了腫瘤細胞活性。但血液中 CTC 的大小亦有異質性，可能存在與白細胞體積相似甚至小于白細胞的 CTC，導致該項技術的敏感性降低[18]。
密度梯度離心法是目前常用的一種簡便、有效的 CTC 物理分離法，該方法利用血液中各種細胞密度不同的原理，離心后將單個核細胞（其中包含 CTC）從粒細胞、紅細胞中分離出來。傳統的 Ficoll 分離法，以及在此基礎上發展的新的 OncoQuick 分離法，雖然已成功分離出術后結直腸癌患者外周血中的 CTC，但分離過程中會丟失少量腫瘤細胞，腫瘤細胞的回收率低，導致 CTC 檢測的靈敏性和穩定性低[19]。此外，Harouaka 等[14]還介紹了利用細胞不同變形性、不同帶電特性等物理性質分離 CTC，這些物理分離技術缺乏高特異性和高敏感性，目前還在繼續研究中。
2.2 CTC 的識別
識別分離富集后的 CTC 的方法較多，目前主要包括核酸分析、免疫染色、熒光原位雜交等分析技術。
核酸分析主要是利用聚合酶鏈反應、逆轉錄聚合酶鏈反應、下一代測序以及最近的 RNA 原位雜交等技術對血液中腫瘤細胞來源的游離 DNA 或者 mRNA 進行檢測，該類方法靈敏性高，可重復性好。但由于血液中的核酸可能直接來源于壞死脫落的腫瘤細胞、腫瘤相關的外來體、細胞碎片或外周血中溶解的 CTC 等，可導致檢測結果假陽性。此外，由于檢測的是游離核酸，經過細胞內 DNA 表達或轉錄后修飾作用，該方法不能對 CTC 進行形態學、分子特性等分析，也不能計數 CTC[13, 20]。
免疫細胞化學法或免疫熒光染色技術是目前常用的 CTC 檢測技術，是在細胞富集的基礎上，針對腫瘤細胞表達的特異蛋白或基因進行原位檢測，并對篩選后的細胞完成鑒定。該方法可對 CTC 進行形態學分析，特異性好，但由于腫瘤細胞表面蛋白表達的異質性和不穩定性，該方法敏感性低，且不通用于不同腫瘤[21]。因此，發展一種與腫瘤類型、狀態及細胞表面標志物表達情況無關，可有效識別有異質性的 CTC 的檢測技術是非常重要的。
3 SE-iFISH 技術檢測 CTC 的臨床應用
3.1 SE-iFISH 技術的優勢
SE-iFISH 技術即差相富集-瘤標免疫熒光染色-染色體原位雜交技術，該技術將差相富集、瘤標免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交（immunostaining-fluorescence in situ hybridization，i-FISH）技術結合，是一種新型的 CTC 檢測技術，使用差相富集法分離富集 CTC，再將富集后的 CTC 同時進行瘤標免疫熒光染色及染色體熒光原位雜交，具有高靈敏性和高特異性。
3.1.1 差相富集分離 CTC 差相富集法是一種新的 CTC 陰性富集法，該方法利用免疫磁珠偶聯多種抗白細胞抗體使去白細胞達 4～5 log，并使用非低滲溶破法去除紅細胞，保證了 CTC 的完整性以用于后續研究，包括原代細胞培養、單細胞測序等。該技術不依賴于腫瘤上皮細胞表面標志物的表達，不限于上皮來源的腫瘤細胞，可通用于多種腫瘤細胞的分離[13]。與傳統的陰性富集法相比，該方法敏感性高、可重復性強。
3.1.2 i-FISH 識別 染色體非整倍性改變是細胞遺傳學染色體不穩定性的表現之一，與腫瘤的發生密切相關，研究表明幾乎所有惡性腫瘤中均發現有染色體非整倍性改變，呈現異倍體，但并非所有腫瘤細胞內染色體數目都顯現異常[22]。i-FISH 技術將富集后的 CTC 同時進行瘤標免疫熒光染色（EpCAM、CK 等）與 8 號染色體著絲粒探針（centromere probe 8，CEP8）標記計數染色體，同時檢測 CTC 免疫瘤標表型及染色體核型。有研究報道，CTC 為有核細胞，其 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染色陽性，而不表達白細胞共同抗原，即白細胞分化抗體群 45（cluster of differentiation 45，CD45）表達陰性，故將 EpCAM 或 CK+/CD45－/DAPI+/CEP8 =2、EpCAM 或 CK+/CD45－/DAPI+/CEP8>2、EpCAM 或 CK－/CD45－/DAPI+/CEP8>2 的細胞定義為 CTC 細胞[23]。該方法不依賴于 EpCAM/CK 的表達，可通用于所有實體腫瘤。此外，還可以加入其他相關瘤標抗體進行同步染色，根據特定瘤標表達情況及染色體異常特點，識別 CTC 亞型細胞進而探索 CTC 亞型在腫瘤臨床上的應用價值[24]。
3.2 SE-iFISH 技術的臨床應用
SE-iFISH 技術作為一種新型的 CTC 檢測技術，與傳統的 CTC 檢測技術相比具有更高的特異性和敏感性。Li 等[17]研究對比了 SE-iFISH 技術與經典的 CellSearch 系統在 49 例進展期胃癌患者外周血中 CTC 檢測結果，SE-iFISH 技術檢測 CTC 陽性率為 90.5%，而 CellSearch 系統檢測的陽性率只有 54.8%。Ge 等[18]利用 SE-iFISH 技術檢測肺癌和食管癌患者外周血中的 CTC 仍獲得了較高的檢出率，分別是 92% 和 87%。Ge 等[18]研究中還對比了 SE-iFISH 技術與 CellSearch 技術對不同腫瘤細胞系的 CTC 檢出率，其中高表達 EpCAM 的乳腺癌 SK-BR-3 細胞的 CTC 檢出率分別是 88% 和 87%，而低表達 EpCAM 的膀胱癌 T24 細胞 CTC 檢出率分別是 77% 和 48%。更有意義的是，不表達 EpCAM 的黑色素瘤 SK-Mel-28 細胞外周血中沒有被 CellSearch 系統檢測出 CTC，而 SE-iFISH 技術對其 CTC 檢出率高達 70%，表明了 SE-iFISH 技術在 CTC 檢測中的優勢。同樣，Gao 等[23]在一項關于 CTC 對胰腺癌預后影響研究中，利用 SE-iFISH 技術檢測 25 例治療前的胰腺癌患者 7.5 mL 外周血中 CTC，并對健康人群進行陰性對照，發現以 CTC 個數 2 個/7.5 mL 外周血作為計數節點，SE-iFISH 技術檢測胰腺癌 CTC 的敏感性和特異性分別是 88% 和 90%，并表明外周血 CTC 檢測結合血清學糖類抗原 19-9 檢查，對胰腺癌的發現率可達 100%，而外周血中 CTC 水平高低與胰腺癌患者總生存期呈負相關。而 利用 CellSearch 系統對胰腺癌外周血 CTC 的檢出率只有 11%[25]。以上研究都表明了 SE-iFISH 技術在 CTC 檢測中的優勢，具有重復性好、敏感性和特異性高的特點。
隨著對腫瘤研究的深入，CTC 的簡單計數將不再滿足臨床及實驗研究的需求。SE-iFISH 技術還可對不同腫瘤進行瘤標免疫染色及利用染色體探針對 CTC 進行染色體核型分析，進一步研究 CTC 亞型在腫瘤療效評估、復發轉移檢測及預后方面的臨床意義。 Li 等[17]利用 i-FISH 技術研究胃癌患者 CTC 表面人類表皮生長因子受體 2（human epidermalgrowth factor receptor-2，Her-2）表達狀態與曲妥珠單抗靶向治療療效的關系，發現 Her-2 表達陽性的 CTC 清除率與腫瘤靶向治療療效密切相關。并報道胃癌患者對化療的原發性耐藥可能與三倍體 CTC（8 號染色體數目=3）相關，而四倍體或多倍體（8 號染色體數目≥5）CTC 可能與腫瘤的獲得性耐藥相關。Jiang 等[26]構建了胃神經內分泌癌的小鼠動物模型 GA0087 并研究 CTC 亞型與腫瘤化療療效之間的關系，利用 SE-iFISH 技術動態監測接受順鉑化療的 GA0087 小鼠外周血中的 35 個 CTC（只要表達人類 CK18 或 CEP8 均為 CTC），其中 27 個 CTC 在治療 62 d 后被清除，表現為對化療敏感，另外未被清除的 8 個 CTC 表現為對化療不敏感。進一步對 CTC 亞型進行分析，發現 27 個對化療敏感的 CTC 中，7 個 CTC 表型為 CK18 陰性且均為二倍體，其余 20 個 CK18 陽性的 CTC 中，15 個 CTC 為二倍體，另外 5 個 CTC 為多倍體。而 8 個對化療表現不敏感的 CTC 表型均為 CK18 陽性，包括 3 個二倍體和 5 個多倍體。表示 CK18 陰性的 CTC 均為二倍體且對化療敏感，而 CK18 陽性的 CTC 對化療的敏感性取決于 8 號染色體倍性，其中二倍體 CTC 占化療敏感的多數（75%），多倍體 CTC 占化療不敏感的大多數（63%）。上述研究表明 SE-iFISH 技術在鑒別 CTC 亞型并研究其臨床意義方面可發揮重要作用。
此外，SE-iFISH 技術分離后的 CTC 免受低滲裂解破壞及抗體捕獲的干擾，維持了 CTC 自然的細胞形態和分子特性，可用于后續系列形態學與功能性的相關研究，如單細胞測序，藥物靶向基因的表達，藥物耐受相關基因突變的檢測等，亦可行 CTC 原代細胞培養及構建腫瘤動物模型，在精準醫學時代，有望為腫瘤患者提供個體化治療依據。
4 結語
CTC 作為一種新的腫瘤“液態活檢”手段在腫瘤研究中越來越受到關注，有良好的應用前景。由于 CTC 表面標志物的異質性及不穩定性，不依賴腫瘤細胞表面標志物表達的 SE-iFISH 檢測技術表現出了明顯優勢，其有高度的敏感性和特異性，并可檢測不同組織來源的 CTC。并能將瘤標免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交整合在一起，可根據腫瘤細胞表型及染色體核型探索 CTC 亞類在腫瘤治療中的臨床意義。此外，將 SE-iFISH 技術分離后的單個 CTC 進行基因測序、細胞培養及動物模型構建，可在探索腫瘤復發轉移機制及腫瘤患者個體化治療過程中發揮重要意義。但目前 SE-iFISH 技術在 CTC 臨床檢測中的應用，有待后續高質量、多中心、大樣本的數據予以說明。且 SE-iFISH 技術檢測 CTC 費用昂貴，要將此技術廣泛應用于臨床，還需更多的后續研究以降低檢測成本。