引用本文： 曹貴華, 閆永吉, 陳戩, 張海燕, 王光, 李沛, 石鑫. Fibulin-5 基因沉默對人膀胱癌細胞 5637 增殖活力及遷移力的影響. 華西醫學, 2018, 33(4): 417-422. doi: 10.7507/1002-0179.201701037 復制
膀胱癌以其較高的發病率和死亡率居于泌尿系統惡性腫瘤首位，其中，浸潤性膀胱尿路上皮癌最易發生侵襲和轉移，惡性程度較高，而膀胱癌一旦侵及周圍組織或發生遠處轉移，患者生存率就會顯著下降[1-3]。阻止膀胱癌侵襲和轉移是早期防治膀胱癌的關鍵，目前，膀胱癌侵襲和轉移的分子機制尚不完全清楚。
Fibulin-5 是細胞外基質蛋白 Fibulin 家族的一員，可以結合整合素，進而參與細胞內信號傳導以影響細胞的增殖、遷移及黏附[4-5]。據報道，Fibulin-5 在腎臟、乳腺、卵巢、子宮內膜、結腸、肺、前列腺及膀胱等組織器官的惡性腫瘤中，尤其是在發生轉移的惡性腫瘤中表達下調[6-10]，研究還表明，Fibulin-5 高表達具有抑制肺癌和乳腺癌細胞遠處轉移灶形成的作用[11-13]，提示 Fibulin-5 具有抑制腫瘤轉移的作用。近年研究顯示，Fibulin-5 在發育過程尤其是血管形成時表達活躍，但在大部分成體組織中表達顯著下調。然而在血管損傷或是其他病理條件下，如惡性腫瘤，Fibulin-5 的表達會被重新激活而上調[14]。Lee 等[15]報道，Fibulin-5 可以誘導乳腺癌上皮細胞基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表達并促進乳腺癌細胞上皮-間質轉化，且還在鼻咽癌和胰腺膽管癌的形成過程中起促進作用[16-17]，另外，Fibulin-5 基因沉默可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力[18]，這似乎又與前述 Fibulin-5 抑制腫瘤發生發展的作用存在矛盾，但研究表明，Fibulin-5 在腫瘤發生發展過程中可能存在時期特異性[6]和情境特異性[7]。Fibulin-5 在膀胱癌組織中表達下調，并且已有研究表明，過表達 Fibulin-5 可抑制膀胱癌細胞 5637 的生長和遷移[9]，但其具體機制尚不完全清楚。
本研究擬從另一角度入手，利用膀胱癌細胞 5637 建立 Fibulin-5 基因沉默的穩定細胞株，以觀測其生長和遷移情況，并篩選和檢測 Fibulin-5 沉默后受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的表達情況，以期闡明 Fibulin-5 基因表達對膀胱癌細胞增殖與遷移的影響及其機制，為后期膀胱癌發生發展的機制研究和臨床防治提供實驗數據與理論支持。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞、慢病毒、試劑盒及分組
人膀胱癌細胞 5637（上海細胞生物所）；Fibulin-5 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；PathScan? RTK 信號通路抗體芯片試劑盒（美國細胞信號技術公司）。實驗分為陰性對照病毒感染的細胞組（NC 組）和 Fibulin-5 RNAi 慢病毒［Fibulin-5 基因短發夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）病毒］感染的細胞組（F5 組）。
1.2 實驗方法
1.2.1 Fibulin-5 RNAi 載體構建
人 Fibulin-5 基因，序列號 NM_006329，shRNA 靶序列：AGCAGACGTGCTACAATTT，載體為 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。采用重組體 DNA 技術制備包含 shRNA 靶序列的重組載體，在 293T 細胞中包裝為慢病毒 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-shRNA-puromycin。
1.2.2 Fibulin-5 基因沉默細胞株的建立及 Fibulin-5 mRNA 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測
將對數生長期的 5637 細胞胰酶消化，用完全培養基 RPMI-1640+10% 胎牛血清制成 5×104 個/mL 細胞懸液，2 mL/孔接種到 6 孔板中，培養到鋪板率為 30% 時感染，感染復數為 10，感染 16 h 后更換為完全培養基，72 h 后觀察感染細胞的熒光，同時添加 1 μg/mL 的 puromysin 進行篩選，48 h 后收集細胞標本，提取總 RNA，使用 Promega M-MLV 試劑盒獲得互補 DNA，分別采用引物對 5’-CATTGCAGTGATATGGACGAGT-3’、5’-CGTGTGGTTCCTGTGCTCACAT-3’ 檢測 Fibulin-5 mRNA 表達，采用引物對 5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’、5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’ 檢測 ACTB mRNA 表達，并利用 SYBR premix ex taq 行（95℃-5 s，60℃-30 s）兩步法 qPCR，且進行相對定量分析，相對定量 F=2–ΔΔCt（–ΔΔCt=NC 組 ΔCt 平均值–各樣品 ΔCt 值，ΔCt=目的基因 Fibulin-5 Ct 值–內參基因 ACTB Ct 值）
1.2.3 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］檢測生長曲線的變化
將 NC 組 5637 細胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞分別接于 96 孔板，2 000 個細胞/孔，每組設 5 個重復，分別于培養 1、2、3、4、5 d 行 MTT 檢測，培養終止前 4 h 加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 于孔中，4 h 后完全吸去培養液，加 100 μL 二甲基亞砜，振蕩器振蕩 5 min，酶標儀 490 nm 檢測各個培養孔的吸光度值，繪制 NC 組 5637 細胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞的生長曲線，并計算生長抑制率。
1.2.4 細胞劃痕檢測細胞遷移率的變化
將 NC 組 5637 細胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞接種于 96 孔板，3×104 個細胞/孔，每組設 5 個重復，劃痕時更換低濃度血清培養基（0.5% 胎牛血清），使用劃痕儀向上輕推形成劃痕。使用無血清培養基輕輕漂洗細胞 2 遍，加入低濃度血清培養基，在 37℃、5%二氧化碳培養箱培養，并分別于劃痕處理后 0、4、8 h 拍照，測量劃痕的寬度，計算各組細胞遷移率。
1.2.5 Pathscan RTK 檢測
分別將 NC 組 5637 細胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞提取總蛋白，每組設 3 個重復，按照 PathScan? RTK 信號通路抗體芯片試劑盒說明書操作檢測各個目的蛋白的相對表達量。
1.3 統計學方法
實驗數據應用 SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光檢測
感染后 72 h，F5 組和 NC 組細胞于熒光顯微鏡下觀察 GFP 表達情況，熒光細胞陽性率均達 70% 以上（圖 1），可進行后續篩選實驗。
圖1
慢病毒感染 72 h 后 5637 細胞的 GFP 熒光
轉染后兩組細胞的熒光細胞陽性率均達 70% 以上。a. NC 組（GFP×200）；b. F5 組（GFP×200）；c. NC 組（明視野×200）；d. F5 組（明視野×200）
2.2 qPCR 檢測 Fibulin-5 mRNA 的表達
采用 qPCR 技術對兩組細胞檢測的結果顯示，F5 組較 NC 組 5637 細胞 Fibulin-5 mRNA 表達水平顯著下降（0.067±0.013 vs. 1.001±0.000），敲減效率達到 93.3%（圖 2），Fibulin-5 基因 shRNA 沉默效果顯著。
圖2
慢病毒感染后 5637 細胞 Fibulin-5 mRNA 的表達水平變化
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞 Fibulin-5 mRNA 相對表達量差異有統計學意義（
2.3 MTT 檢測 5637 細胞的增殖活性
利用 MTT 法連續 5 d 檢測 NC 組和 F5 組的 5637 細胞活性，統計結果表明，與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞在各個時間點增殖活力都有降低，其中在第 3、4、5 天顯著下降，增殖速度減緩明顯。見圖 3、表 1。
表1
慢病毒感染后 5637 細胞相對吸光度值（
）
圖3
慢病毒感染后 5637 細胞增殖活性的變化
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞相對吸光度值差異有統計學意義（
2.4 細胞劃痕檢測 5637 細胞的遷移率
細胞劃痕檢測顯示，F5 組 5637 細胞在 4、8 h 的相對遷移率分別為 0.14±0.06、0.26±0.04，顯著低于 NC 組細胞 4、8 h 的相對遷移率（0.47±0.05、1.00±0.00），與 NC 組比較，F5 組 5637 細胞遷移速度明顯減緩（圖 4）。
圖4
慢病毒感染后 5637 細胞相對遷移率變化
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞相對遷移率差異有統計學意義（
2.5 Pathscan RTK 檢測
Fibulin-5 基因沉默后，檢測 5637 細胞 RTK 信號通路相關蛋白的表達變化，數據結果見圖 5、表 2。相較于 NC 組，F5 組 5637 細胞間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、Axl、p44/42 絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK)［胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2］、Src 蛋白水平顯著升高，表達上調百分比分別為 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。
表2
Pathscan 檢測 ALK、Axl、p44/42 MAPK （ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
圖5
Pathscan 檢測 ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞蛋白灰度值差異有統計學意義（
3 討論
Fibulin-5 是一種定位于細胞外基質的分泌性糖蛋白，為包括血管平滑肌細胞、成纖維細胞及內皮細胞等多種細胞所分泌，并在彈性纖維形成過程中發揮重要的作用。近年來研究表明，Fibulin-5 對腫瘤發生發展有重要作用，其作用機制研究也逐漸成為研究的熱點。Fibulin-5 可通過 RGD 依賴的整合素信號來抑制 ERK 活性，從而導致 MMP-7 轉錄抑制，而后者在肺癌浸潤過程中至關重要[11]；Fibulin-5 亦可通過抑制 MMP-9 的產生來降低成纖維細胞的侵襲能力以抑制遠處轉移灶的形成[12, 19]；Fibulin-5 可消除 ERK 對 GSK3β 的激活作用，來阻止 MMP-7 和 c-Myc 的表達，從而阻斷了 Wnt/β-catenin 信號通路，后者在腫瘤發生發展及遠處轉移過程中起到關鍵作用[13, 20]。上述研究業已闡述了 Fibulin-5 抑制腫瘤生長和轉移的作用機制。然而，Fibulin-5 還存在促進腫瘤生長及運動能力的作用。據報道，在特定環境下，Fibulin-5 可作為轉化生因子-β 的靶基因來激活 ERK1/2 和 p38 MAPK 以控制細胞的生長和運動[7]，并可作為分子變阻器來調節細胞基質相互作用以降低活性氧的產生，從而促進胰腺膽管癌的發生發展[17]；另外，Fibulin-5 在胃癌組織中表達上調，其基因沉默可降低胃癌細胞株 MGC-803 的增殖和侵襲能力[18, 21]。由此可見，Fibulin-5 在腫瘤發生發展和轉移過程中的功能可能存在組織和環境特異性，以致其作用存在差異甚至截然相反。膀胱癌細胞 5637 的 Fibulin-5 過表達細胞株細胞的增殖和遷移能力明顯降低[9]，但其機制尚不清楚。
本研究利用 Fibulin-5 RNAi 慢病毒感染膀胱癌細胞 5637 建立了 Fibulin-5 基因沉默細胞株，并對其增殖活性和遷移能力進行了探究，結果顯示，Fibulin-5 基因沉默后，5637 細胞的增殖活性和遷移能力較 NC 組顯著降低，提示 Fibulin-5 基因的沉默對膀胱癌細胞的增殖活性有抑制作用，這與 Hu 等[9]的研究結果似乎存在一些矛盾。為探究了這一現象的原因，我們還對 Fibulin-5 基因沉默細胞株 RTK 信號通路中 39 種主要的蛋白進行了 PathScan 檢測，結果顯示，ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白水平顯著高于 NC 組細胞，表達上調百分比分別為 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。眾所周知，這些蛋白與細胞的增殖、黏附、遷移密切相關，且相互之間聯系緊密，它們的表達上調意涵細胞生長和轉移能力的增強。Fibulin-5 基因的沉默，使 ERK 及與其激活密切相關的 ALK、Axl、Src 蛋白表達均有所上調，提示 Fibulin-5 可能具有抑制 ERK 及其通路蛋白的作用，這與以往研究倒也相一致[13, 20]，但此時細胞增殖活力和轉移能力本應該提高，然而本研究結果表明，Fibulin-5 基因的沉默使膀胱癌細胞 5637 增殖活力和遷移力較 NC 組均有所降低。我們猜測，Fibulin-5 與彈性纖維形成密切相關，其基因的沉默勢必會影響彈性纖維的組裝及正常功能的發揮，繼而使細胞骨架及形態處于非正常狀態，生理結構及功能的改變使細胞活力、黏附及遷移能力均受到不同程度的影響，而細胞處在這種狀態下，即使 ERK 得到激活可能也很難提高細胞的增殖和遷移能力。
本研究僅初步探討了 Fibulin-5 基因沉默對膀胱癌細胞株 5637 的影響，由于實驗樣本數量和研究范圍有限，致使研究還存在很多問題尚未解決，如 Fibulin-5 的存在是否使 ERK 處于被抑制狀態而沉默后表達激活、Fibulin-5 沉默后細胞活力的下降是否因為生理狀態的改變、Fibulin-5 過表達時 ERK 等 RTK 表達水平及活力處于何種狀態等，因此，Fibulin-5 在膀胱癌組織細胞中的作用及其機制研究還有待進一步的探究和闡明。
膀胱癌以其較高的發病率和死亡率居于泌尿系統惡性腫瘤首位，其中，浸潤性膀胱尿路上皮癌最易發生侵襲和轉移，惡性程度較高，而膀胱癌一旦侵及周圍組織或發生遠處轉移，患者生存率就會顯著下降[1-3]。阻止膀胱癌侵襲和轉移是早期防治膀胱癌的關鍵，目前，膀胱癌侵襲和轉移的分子機制尚不完全清楚。
Fibulin-5 是細胞外基質蛋白 Fibulin 家族的一員，可以結合整合素，進而參與細胞內信號傳導以影響細胞的增殖、遷移及黏附[4-5]。據報道，Fibulin-5 在腎臟、乳腺、卵巢、子宮內膜、結腸、肺、前列腺及膀胱等組織器官的惡性腫瘤中，尤其是在發生轉移的惡性腫瘤中表達下調[6-10]，研究還表明，Fibulin-5 高表達具有抑制肺癌和乳腺癌細胞遠處轉移灶形成的作用[11-13]，提示 Fibulin-5 具有抑制腫瘤轉移的作用。近年研究顯示，Fibulin-5 在發育過程尤其是血管形成時表達活躍，但在大部分成體組織中表達顯著下調。然而在血管損傷或是其他病理條件下，如惡性腫瘤，Fibulin-5 的表達會被重新激活而上調[14]。Lee 等[15]報道，Fibulin-5 可以誘導乳腺癌上皮細胞基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表達并促進乳腺癌細胞上皮-間質轉化，且還在鼻咽癌和胰腺膽管癌的形成過程中起促進作用[16-17]，另外，Fibulin-5 基因沉默可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲能力[18]，這似乎又與前述 Fibulin-5 抑制腫瘤發生發展的作用存在矛盾，但研究表明，Fibulin-5 在腫瘤發生發展過程中可能存在時期特異性[6]和情境特異性[7]。Fibulin-5 在膀胱癌組織中表達下調，并且已有研究表明，過表達 Fibulin-5 可抑制膀胱癌細胞 5637 的生長和遷移[9]，但其具體機制尚不完全清楚。
本研究擬從另一角度入手，利用膀胱癌細胞 5637 建立 Fibulin-5 基因沉默的穩定細胞株，以觀測其生長和遷移情況，并篩選和檢測 Fibulin-5 沉默后受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的表達情況，以期闡明 Fibulin-5 基因表達對膀胱癌細胞增殖與遷移的影響及其機制，為后期膀胱癌發生發展的機制研究和臨床防治提供實驗數據與理論支持。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 細胞、慢病毒、試劑盒及分組
人膀胱癌細胞 5637（上海細胞生物所）；Fibulin-5 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）慢病毒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；PathScan? RTK 信號通路抗體芯片試劑盒（美國細胞信號技術公司）。實驗分為陰性對照病毒感染的細胞組（NC 組）和 Fibulin-5 RNAi 慢病毒［Fibulin-5 基因短發夾 RNA（short hairpin RNA，shRNA）病毒］感染的細胞組（F5 組）。
1.2 實驗方法
1.2.1 Fibulin-5 RNAi 載體構建
人 Fibulin-5 基因，序列號 NM_006329，shRNA 靶序列：AGCAGACGTGCTACAATTT，載體為 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。采用重組體 DNA 技術制備包含 shRNA 靶序列的重組載體，在 293T 細胞中包裝為慢病毒 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-shRNA-puromycin。
1.2.2 Fibulin-5 基因沉默細胞株的建立及 Fibulin-5 mRNA 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）檢測
將對數生長期的 5637 細胞胰酶消化，用完全培養基 RPMI-1640+10% 胎牛血清制成 5×104 個/mL 細胞懸液，2 mL/孔接種到 6 孔板中，培養到鋪板率為 30% 時感染，感染復數為 10，感染 16 h 后更換為完全培養基，72 h 后觀察感染細胞的熒光，同時添加 1 μg/mL 的 puromysin 進行篩選，48 h 后收集細胞標本，提取總 RNA，使用 Promega M-MLV 試劑盒獲得互補 DNA，分別采用引物對 5’-CATTGCAGTGATATGGACGAGT-3’、5’-CGTGTGGTTCCTGTGCTCACAT-3’ 檢測 Fibulin-5 mRNA 表達，采用引物對 5’-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3’、5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3’ 檢測 ACTB mRNA 表達，并利用 SYBR premix ex taq 行（95℃-5 s，60℃-30 s）兩步法 qPCR，且進行相對定量分析，相對定量 F=2–ΔΔCt（–ΔΔCt=NC 組 ΔCt 平均值–各樣品 ΔCt 值，ΔCt=目的基因 Fibulin-5 Ct 值–內參基因 ACTB Ct 值）
1.2.3 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］檢測生長曲線的變化
將 NC 組 5637 細胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞分別接于 96 孔板，2 000 個細胞/孔，每組設 5 個重復，分別于培養 1、2、3、4、5 d 行 MTT 檢測，培養終止前 4 h 加入 20 μL 5 mg/mL 的 MTT 于孔中，4 h 后完全吸去培養液，加 100 μL 二甲基亞砜，振蕩器振蕩 5 min，酶標儀 490 nm 檢測各個培養孔的吸光度值，繪制 NC 組 5637 細胞及 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞的生長曲線，并計算生長抑制率。
1.2.4 細胞劃痕檢測細胞遷移率的變化
將 NC 組 5637 細胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞接種于 96 孔板，3×104 個細胞/孔，每組設 5 個重復，劃痕時更換低濃度血清培養基（0.5% 胎牛血清），使用劃痕儀向上輕推形成劃痕。使用無血清培養基輕輕漂洗細胞 2 遍，加入低濃度血清培養基，在 37℃、5%二氧化碳培養箱培養，并分別于劃痕處理后 0、4、8 h 拍照，測量劃痕的寬度，計算各組細胞遷移率。
1.2.5 Pathscan RTK 檢測
分別將 NC 組 5637 細胞和 Fibulin-5 基因沉默后的 5637 細胞提取總蛋白，每組設 3 個重復，按照 PathScan? RTK 信號通路抗體芯片試劑盒說明書操作檢測各個目的蛋白的相對表達量。
1.3 統計學方法
實驗數據應用 SPSS 13.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）熒光檢測
感染后 72 h，F5 組和 NC 組細胞于熒光顯微鏡下觀察 GFP 表達情況，熒光細胞陽性率均達 70% 以上（圖 1），可進行后續篩選實驗。
圖1
慢病毒感染 72 h 后 5637 細胞的 GFP 熒光
轉染后兩組細胞的熒光細胞陽性率均達 70% 以上。a. NC 組（GFP×200）；b. F5 組（GFP×200）；c. NC 組（明視野×200）；d. F5 組（明視野×200）
2.2 qPCR 檢測 Fibulin-5 mRNA 的表達
采用 qPCR 技術對兩組細胞檢測的結果顯示，F5 組較 NC 組 5637 細胞 Fibulin-5 mRNA 表達水平顯著下降（0.067±0.013 vs. 1.001±0.000），敲減效率達到 93.3%（圖 2），Fibulin-5 基因 shRNA 沉默效果顯著。
圖2
慢病毒感染后 5637 細胞 Fibulin-5 mRNA 的表達水平變化
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞 Fibulin-5 mRNA 相對表達量差異有統計學意義（
2.3 MTT 檢測 5637 細胞的增殖活性
利用 MTT 法連續 5 d 檢測 NC 組和 F5 組的 5637 細胞活性，統計結果表明，與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞在各個時間點增殖活力都有降低，其中在第 3、4、5 天顯著下降，增殖速度減緩明顯。見圖 3、表 1。
表1
慢病毒感染后 5637 細胞相對吸光度值（
）
圖3
慢病毒感染后 5637 細胞增殖活性的變化
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞相對吸光度值差異有統計學意義（
2.4 細胞劃痕檢測 5637 細胞的遷移率
細胞劃痕檢測顯示，F5 組 5637 細胞在 4、8 h 的相對遷移率分別為 0.14±0.06、0.26±0.04，顯著低于 NC 組細胞 4、8 h 的相對遷移率（0.47±0.05、1.00±0.00），與 NC 組比較，F5 組 5637 細胞遷移速度明顯減緩（圖 4）。
圖4
慢病毒感染后 5637 細胞相對遷移率變化
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞相對遷移率差異有統計學意義（
2.5 Pathscan RTK 檢測
Fibulin-5 基因沉默后，檢測 5637 細胞 RTK 信號通路相關蛋白的表達變化，數據結果見圖 5、表 2。相較于 NC 組，F5 組 5637 細胞間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、Axl、p44/42 絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK)［胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2］、Src 蛋白水平顯著升高，表達上調百分比分別為 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。
表2
Pathscan 檢測 ALK、Axl、p44/42 MAPK （ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
圖5
Pathscan 檢測 ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白的灰度值
*與 NC 組相比，F5 組 5637 細胞蛋白灰度值差異有統計學意義（
3 討論
Fibulin-5 是一種定位于細胞外基質的分泌性糖蛋白，為包括血管平滑肌細胞、成纖維細胞及內皮細胞等多種細胞所分泌，并在彈性纖維形成過程中發揮重要的作用。近年來研究表明，Fibulin-5 對腫瘤發生發展有重要作用，其作用機制研究也逐漸成為研究的熱點。Fibulin-5 可通過 RGD 依賴的整合素信號來抑制 ERK 活性，從而導致 MMP-7 轉錄抑制，而后者在肺癌浸潤過程中至關重要[11]；Fibulin-5 亦可通過抑制 MMP-9 的產生來降低成纖維細胞的侵襲能力以抑制遠處轉移灶的形成[12, 19]；Fibulin-5 可消除 ERK 對 GSK3β 的激活作用，來阻止 MMP-7 和 c-Myc 的表達，從而阻斷了 Wnt/β-catenin 信號通路，后者在腫瘤發生發展及遠處轉移過程中起到關鍵作用[13, 20]。上述研究業已闡述了 Fibulin-5 抑制腫瘤生長和轉移的作用機制。然而，Fibulin-5 還存在促進腫瘤生長及運動能力的作用。據報道，在特定環境下，Fibulin-5 可作為轉化生因子-β 的靶基因來激活 ERK1/2 和 p38 MAPK 以控制細胞的生長和運動[7]，并可作為分子變阻器來調節細胞基質相互作用以降低活性氧的產生，從而促進胰腺膽管癌的發生發展[17]；另外，Fibulin-5 在胃癌組織中表達上調，其基因沉默可降低胃癌細胞株 MGC-803 的增殖和侵襲能力[18, 21]。由此可見，Fibulin-5 在腫瘤發生發展和轉移過程中的功能可能存在組織和環境特異性，以致其作用存在差異甚至截然相反。膀胱癌細胞 5637 的 Fibulin-5 過表達細胞株細胞的增殖和遷移能力明顯降低[9]，但其機制尚不清楚。
本研究利用 Fibulin-5 RNAi 慢病毒感染膀胱癌細胞 5637 建立了 Fibulin-5 基因沉默細胞株，并對其增殖活性和遷移能力進行了探究，結果顯示，Fibulin-5 基因沉默后，5637 細胞的增殖活性和遷移能力較 NC 組顯著降低，提示 Fibulin-5 基因的沉默對膀胱癌細胞的增殖活性有抑制作用，這與 Hu 等[9]的研究結果似乎存在一些矛盾。為探究了這一現象的原因，我們還對 Fibulin-5 基因沉默細胞株 RTK 信號通路中 39 種主要的蛋白進行了 PathScan 檢測，結果顯示，ALK、Axl、p44/42 MAPK（ERK1/2）、Src 蛋白水平顯著高于 NC 組細胞，表達上調百分比分別為 26.63%、35.05%、34.76%、16.25%。眾所周知，這些蛋白與細胞的增殖、黏附、遷移密切相關，且相互之間聯系緊密，它們的表達上調意涵細胞生長和轉移能力的增強。Fibulin-5 基因的沉默，使 ERK 及與其激活密切相關的 ALK、Axl、Src 蛋白表達均有所上調，提示 Fibulin-5 可能具有抑制 ERK 及其通路蛋白的作用，這與以往研究倒也相一致[13, 20]，但此時細胞增殖活力和轉移能力本應該提高，然而本研究結果表明，Fibulin-5 基因的沉默使膀胱癌細胞 5637 增殖活力和遷移力較 NC 組均有所降低。我們猜測，Fibulin-5 與彈性纖維形成密切相關，其基因的沉默勢必會影響彈性纖維的組裝及正常功能的發揮，繼而使細胞骨架及形態處于非正常狀態，生理結構及功能的改變使細胞活力、黏附及遷移能力均受到不同程度的影響，而細胞處在這種狀態下，即使 ERK 得到激活可能也很難提高細胞的增殖和遷移能力。
本研究僅初步探討了 Fibulin-5 基因沉默對膀胱癌細胞株 5637 的影響，由于實驗樣本數量和研究范圍有限，致使研究還存在很多問題尚未解決，如 Fibulin-5 的存在是否使 ERK 處于被抑制狀態而沉默后表達激活、Fibulin-5 沉默后細胞活力的下降是否因為生理狀態的改變、Fibulin-5 過表達時 ERK 等 RTK 表達水平及活力處于何種狀態等，因此，Fibulin-5 在膀胱癌組織細胞中的作用及其機制研究還有待進一步的探究和闡明。
