糖尿病以胰島素絕對或相對不足導致血糖水平升高為特點，其發生發展與胰島 β 細胞的衰亡密切相關。研究分析人類胰腺活檢標本，發現導致糖尿病患者胰島 β 細胞衰竭的主要機制是 β 細胞的凋亡。但凋亡不能完全解釋在 2 型糖尿病發展的過程中 β 細胞量的減少，也不能解釋在 2 型糖尿病早期的干預對 β 細胞的保護作用。最近有研究者提出，凋亡可能并不是 β 細胞量丟失的唯一機制，可能還存在其他導致 β 細胞功能紊亂的機制，其中胰島 β 細胞的去分化引起相關研究者的關注。該文將對胰島 β 細胞去分化在人類和嚙齒類動物模型中的證據，以及去分化相關轉錄因子作一簡單綜述。
引用本文： 劉鈺琪, 童南偉. 2 型糖尿病 β 細胞去分化的證據及相關轉錄因子. 華西醫學, 2018, 33(5): 598-604. doi: 10.7507/1002-0179.201803163 復制
根據國際糖尿病聯盟統計，2015 年全球糖尿病患者約有 4.15 億人。預測到 2040 年，全球將會有 6.42 億人患有糖尿病，中國糖尿病患者也將達到 1.51 億人。糖尿病是以胰島素絕對或相對不足導致血糖水平升高為特點的慢性疾病，胰島素由胰島 β 細胞合成并分泌，因此糖尿病的發生發展與胰島 β 細胞的衰亡（β cells failure）密切相關。從人類胰腺活檢結果來看，β 細胞衰竭是由 β 細胞的凋亡導致[1-3]，但仍不能完全解釋在 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）發展的過程中 β 細胞量的減少，也不能解釋在 T2DM 早期的干預對 β 細胞的保護作用。所以最近有學者提出，凋亡并不是導致胰島 β 細胞量丟失的唯一機制，可能還存在其他導致 β 細胞功能紊亂的機制[3]。
T2DM 患者的胰島 β 細胞功能紊亂，并表現出成熟 β 細胞身份丟失（loss of identity）和（或）成熟分化狀態的改變（通常是退化為內分泌前體樣細胞），可能是造成胰島 β 細胞衰亡的原因之一。這種 β 細胞身份的丟失或分化狀態的退化，被認為是去分化。因此，我們將對胰島 β 細胞去分化在人類和嚙齒類動物模型中的證據，以及去分化相關轉錄因子作一綜述。
1 去分化的證據
White 等[4]在 3 位人類 T2DM 患者捐獻的胰腺中，通過免疫熒光染色發現了數量可觀的胰島素和胰高血糖素共陽性，或胰島素與波形間質細胞標記共陽性的細胞。同樣，Spijker 等[5]也在人類和非人類靈長類動物的 T2DM 病例的胰腺樣本中，發現了這種胰島素與胰高血糖素共表達的細胞。哥倫比亞大學的 Cinti 團隊通過對 β 細胞系相關轉錄因子變化的研究，發現了人類糖尿病患者胰島 β 細胞去分化的證據[6]。
目前并非所有學者認同這一理論。有學者發現，在人類 T2DM 患者的胰島細胞中確實存在 β 細胞特異性轉錄因子的變化，但未在嚙齒類動物模型發現去分化機制中典型的內分泌前體細胞或祖細胞的特征性轉錄因子［如神經元素 3 （neurogenin-3，Ngn3）、Nanog、L-Myc］的表達[7]。另一項研究分析了人類胰島單細胞轉錄組，也未發現去分化的明確證據[8-9]。
在胰腺中，胃泌素僅在胚胎時期表達，因此是一種典型的胚胎胰腺標記。在 T2DM 患者高血糖狀態下，小鼠和人類 β 細胞都誘導表達出胃泌素[10]。Talchai 等[11]通過譜系示蹤技術，證明了 FOXO1 基因敲除小鼠在多產或老齡等環境壓力增大的情況下發生糖尿病，且此時其胰島 β 細胞發生了去分化。此外，還有兩個團隊在同一年獨立證明了，KATP 通道突變導致的糖尿病小鼠，其胰島 β 細胞的 Ngn3 表達增加，胰島素表達減少，且經過胰島素治療，糖尿病小鼠不僅可以維持糖代謝穩態，還可讓去分化的 β 細胞重新分化成為胰島素陽性細胞[12-13]。
雖然在人類和動物（尤其是鼠類）中已有一定去分化的證據，但是細胞水平證據的缺乏以及少量反對證據，使得去分化是糖尿病患者胰島 β 細胞衰竭的機制這一理論還需要進一步探索和證實。
2 檢測去分化的方法
2.1 譜系示蹤技術
細胞譜系示蹤（cell lineage tracing）是指利用各種方式標記細胞，并對包括其后代所有細胞的增殖、分化以及遷移等活動進行追蹤觀察。目前最常用且較優的細胞譜系示蹤技術是誘導性重組酶 Cre/loxp 系統。其原理為構建兩種轉基因小鼠，一種是在 Rosa26 等重組影響較小的基因位點插入標記基因（如表達熒光蛋白的基因），該標記基因的表達被一段由同向 Loxp（locus of X-over P1，位于 P1 噬菌體中的識別序列）鉚定的“Stop”序列所干擾，暫時不能表達。另一種小鼠則是在特定基因（如 INS2 基因）啟動子后插入 Cre 重組酶基因。當這兩種轉基因品系的小鼠雜交，其后代就能在表達特定基因（如 INS2）的細胞中產生 Cre 酶，從而切除“Stop”序列，成功表達標記基因（如熒光蛋白）。而這些表達標記基因的細胞，則是有特定基因表達的細胞（如 β 細胞）
在 Cre/loxp 系統的基礎上，另一種可以實現對敲除時間進行時間上的控制的細胞譜系示蹤模型產生。雌激素受體為核受體，利用此性質可以調控 Cre 入核時間。經過修飾的人類雌激素受體與 Cre 結合后，不結合雌二醇，而對他莫昔芬有親和性。在沒有他莫昔芬時，Cre 與雌激素受體的結合體停留在細胞質中，Cre 無法進入細胞核發揮剪切作用。當外源性他莫昔芬存在時，Cre 隨雌激素受體進入細胞核，實現對 loxp 片段的重組修飾。因此，通過控制他莫昔芬的注射時間，就可以控制敲除時間發生的時間（圖 1）。
圖1
他莫昔芬誘導 Cre-loxp 系統原理圖
ER：雌激素受體；Rosa26：小鼠基因中廣泛存在的啟動子
2.2 去分化相關轉錄因子表達變化
通過免疫熒光染色、蛋白質印跡以及定量實時多聚酶鏈式反應等方法，檢測胰島 β 細胞相關轉錄因子的變化，從而證明 β 細胞的去分化。理論上，若成熟 β 細胞的特異性標記降低甚至消失，而代表著內分泌前體細胞的標記同時增加，則說明 β 細胞發生了去分化。
3 去分化相關轉錄因子
能在根據不同環境下作出相應反應，合成并分泌正常胰島素，是成熟的胰島 β 細胞的特點。去分化的胰島 β 細胞雖未死亡，但因去分化為原始 β 細胞，從而不能分泌胰島素。與胰島 β 細胞的分化調控、功能相關的轉錄因子眾多，以下將對與胰島 β 細胞去分化密切相關的轉錄因子作一簡單介紹。
3.1 肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物 A （musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，MafA）
MafA 是一種堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）結構的轉錄因子，結合于胰島素基因的啟動子，啟動胰島素基因的表達[14]。對人類胰島細胞進行單細胞 RNA 分析，發現 MafA 具有 β 細胞特異性[9]。不僅如此，MafA 還具有時間上的特異性。在胰腺發育過程中，只有胰島 β 細胞開始產生胰島素時，MafA 才能被檢測到，而一些其他的胰島 β 細胞重要轉錄因子［如胰-十二指腸同源框-1（pancreas/duodenum homeobox protein 1，Pdx1）和神經分化因子（neurogenic differentiation，NeuroD）］在胰腺發育早期就已經出現并發揮重要作用[15]。而在胰腺內分泌前體細胞內，增加 MafA 的表達將可逆性地抑制該細胞繼續分化[16]。此外，Nishimura 等[17]使用譜系示蹤技術，在小鼠體內證明了 MafA 對維持 β 細胞的成熟狀態至關重要，MafA 的丟失將使原來表達胰島素的成熟 β 細胞不再表達胰島素。以上研究都說明了 MafA 的表達可以作為成熟 β 細胞的可靠標記。
3.2 Pdx1
Pdx1 是胰島素基因表達的關鍵調節子，結合于胰島素基因的 A3 元件，調節胰島素基因的表達[15, 18]，Pdx1 在成人胰腺中的表達基本局限于胰島 β 細胞（高達 91%）[18]。
Pdx1 對胰腺的正常發育也有重要作用，這個作用主要是決定胰腺前體細胞在發育過程中的分化方向[19-20]。Pdx1 是在胰腺發育中第 1 個產生的轉錄因子，在發育過程中 Pdx 確定了內分泌前體細胞分化為 β 細胞的方向[21-22]。Pdx1 對于 α 細胞和 β 細胞的分化都有重要作用，對二者之間的轉分化也可能具有密切聯系。在敲除小鼠 β 細胞的 Pdx1 后，采用譜系示蹤技術發現，許多原產生胰島素的 β 細胞轉變成表達胰高血糖素的 α 細胞[23]。因此有學者認為，Pdx1 掌控調節胰島內分泌細胞分化為 β 細胞的方向，主要通過抑制 α 細胞分化相關的 MafB 的表達，從而抑制胰島內分泌前體細胞往 α 細胞的方向分化[24-26]。
3.3 Ngn3
Ngn3 是一種堿性螺旋-環-螺旋家族的轉錄因子，同樣對胰島內分泌細胞的發育有重要作用。Ngn3 的功能主要是作為內分泌前體細胞基因轉錄的激活子[27-28]。在小鼠的胚胎胰腺中，胰島素和 Ngn3 的免疫熒光共染色發現，Ngn3 不與胰島素共表達。但在胰腺發育的各個時期，以及多種內分泌細胞中，Ngn3 都可檢測到（圖 2）。
圖2
小鼠胰腺發育過程中 Ngn3 表達和翻譯的 3 個階段
從圖 2 可以看出小鼠胰腺的發育從胚胎的第 8.5 天（E8.5）開始。在初次翻譯期間 E9.5～E12.5，最早的內分泌細胞開始表達胰高血糖素，此時 Ngn3 的第 1 個表達峰出現。第 2 次 Ngn3 表達高峰出現在 E13～E16.5 階段，此時分化的內分泌細胞系是產生胰島素的 β 細胞和表達胰腺多肽的 PP 細胞。第 2 個表達峰過后，表達生長抑素的 δ 細胞出現（E14～E16）。隨之 Ngn3 表達降低，出生時幾乎不再表達[29]。因此，Ngn3 可以作為內分泌前體細胞的標記，也可以作為 β 細胞去分化的標記。在糖尿病小鼠的胰島中，發現 β 細胞丟失了成熟的 β 細胞標記，去分化形成胰島素陰性的前體細胞并表達 Ngn3[13]，類似的結果在其他關于胰島 β 細胞去分化的研究[11, 30-31]中也得到了證實。
3.4 乙醛脫氫酶家族 1 成員 A3（aldehyde dehydrogenase 1 family member A3，Aldh1a3）
糖尿病小鼠的基因表達分析研究表明 Aldh1a3 是一種前體細胞標記[32]，在胰腺內分泌細胞中含量豐富[33]。雖然還不確定 Aldh1a3 僅僅是一種標記，還是分化過程中的一種重要因子，但是已有研究證明了 Aldh1 的活性和胰腺分化的關系。在小鼠中，Aldh1 在胰腺腺泡中心細胞[34]——一種潛在的內分泌前體細胞[35]中含量很高，人類胎兒胰腺中，Aldh1 在胰腺的內分泌前體細胞中也含量很豐富，并且功能性抑制其酶促產物維 A 酸，這一過程將會損害 β 細胞的最終分化[36]。
Aldh1a3 的升高在糖尿病患者的 β 細胞中是常見特征，它的過表達雖然不會損害胰島素分泌，但會導致 β 細胞的線粒體功能紊亂，表現出前體樣細胞的特征[37]，因此 Aldh1a3 可能可以作為去分化的標記。目前也有眾多研究已將 Aldh1a3 作為去分化的重要標記[6, 30, 38-39]，或者至少是胰島 β 細胞異質性的標記。但是需要注意的是，Segerstolpe 等[8]對人類 T2DM 患者的胰島進行 RNA 序列分析結果后，并未發現該因子高表達。
3.5 叉頭蛋白轉錄因子（forkhead box protein，Fox）O1
Fox 家族含量和種類豐富，在機體內發揮不同的作用，其中與激素活動密切相關的是 FoxO 亞家族[40]。哺乳動物的細胞表達 4 種 FoxO，分別是 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6[41]。FoxO1 在肝臟、脂肪和胰島 β 細胞中含量最高[42-43]。正常情況下，foxO1 定位于胰島 β 細胞的細胞質，在輕度高血糖條件下，foxO1 可以轉位至細胞核以應對氧化壓力[44-45]。FoxO1 通過上調細胞周期抑制因子以及抑制 Pdx1 的轉錄，來抑制 β 細胞的復制[42]。特異性敲除了胰腺中的 FoxO1 轉基因小鼠，其血糖、胰島素和糖耐量無明顯變化，但是當環境壓力增加，如老年鼠和經歷多產的雌鼠，出現明顯高血糖，此時其胰島 β 細胞數量也大大減少，β 細胞出現去分化而非凋亡[11]。在另一項研究中發現，胰腺特異性 FoxO1 敲除小鼠的胰腺中，胰島素陽性的胰腺導管細胞（被認為是 β 細胞前體）數量增加，并且 FoxO1 可能是通過 Notch 信號途徑的相互作用以及抑制 Ngn3 的表達，從而抑制了 β 細胞的新生和分化[11, 46]。
總之，FoxO1 對胰島 β 細胞的作用復雜，FoxO1 抑制 β 細胞復制和新生，但是同時對在壓力條件下維持 β 細胞的成熟和身份又十分重要。目前的研究多為動物研究，還需要更多更可靠的人類研究，進一步確定其功能和價值。
3.6 NeuroD
NeuroD 是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族成員，也稱作 BETA2，在胰腺和小腸內分泌細胞和神經組織中表達。NeuroD 在胰腺發育過程中十分重要，NeuroD 缺失小鼠的胰島 β 細胞數量急劇減少，導致糖尿病，并最終在圍產期死亡[47]。臨床上 NeuroD 突變可導致成年起病型青少年糖尿病[48]。
胰島素基因加強元件 E-box 和 A-box 在調節胰島素基因表達中扮演著重要角色[49-50]，NeuroD 結合于 E-box、Pdx1 結合于 A-box 對胰島素的表達進行調節。NeuroD 結合并激活胰島素啟動子（圖 3）。NEUROD 基因敲除小鼠，在早期分化胰腺內分泌細胞死亡，導致了胰腺的胰島細胞缺乏[51]。
圖3
胰島素基因轉錄的關鍵轉錄因子
A3-box：胰島素基因中的 A3 盒；C1-box：胰島素基因中的 C1 盒；E1-box：胰島素基因中的 E1 盒
MafA 結合于胰島素基因啟動子區域的順式作用元件 RIPE3b（即C1-box），作為胰島基因的反式激活因子發揮作用（圖 3）。Pdx1 和 NeuroD 都是在胰腺發育早期就開始出現，而且在胰腺的多種細胞中都有表達[15]。
3.7 核轉錄因子 Kappa 同源盒 6（nuclear kappa homeobox 6，Nkx6）
已有研究在多種動物模型中證明了 Nkx6 對 α 和 β 細胞的分化具有重要作用[52]。Nkx6.1 是 β 細胞特異性轉錄因子，T2DM 患者中可以觀察到 Nkx6.1 的降低[53]。進一步研究發現，Nkx6.1 可抑制與 α 細胞的分化密切相關的轉錄因子 Arx，從而維持成熟 β 細胞的身份[53-54]。Nkx6.2 則是在胚胎發育階段表達的轉錄因子，缺乏 Nkx6.1 的小鼠不能表達不同的細胞類型，而 Nkx6.1/6.2 雙敲除小鼠表現出胰島素陽性 β 比數量的下降[55]。這種 Nkx6 時間空間上的分歧可能是理解 β 和 α 細胞譜系的關鍵[55]。
3.8 Nanog 和 八聚體結合蛋白-4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）
胚胎干細胞核心轉錄因子 Nanog、Oct4 和性別決定區 Y 框蛋白 2（SRY-related high-mobility-group box 2，Sox2）是多能干細胞網絡通路中的核心，它們的相互作用和調節可以影響其他多能因子的表達[56]。Nanog 阻止多能干細胞的分化[56]。Oct4 屬于 POU（Pit-Oct-Unc）家族轉錄因子[57]，在胰腺發育過程中的胰腺初級細胞就開始表達 Oct4[58]。Oct4 水平正常的胚胎干細胞保有多能性[59]，因此 Oct4 是干細胞保持多能性和分化的一個關鍵因子[60]。
Nanog 和 Oct4 都是反映細胞多能性的經典標記，若胰島 β 細胞表達了正常成熟細胞不表達的 Nanog 和 Oct4，則可以說明其分化狀態可能有了改變。
4 總結和討論
正如前文提到的，糖尿病患者的胰島 β 細胞出現衰竭可能不能由 β 細胞的凋亡完全解釋，去分化可能是導致其功能紊亂但細胞仍存活的一個重要機制。但去分化的檢測和證明方法困難，最有力的證據應來源于細胞譜系示蹤技術。對轉基因小鼠的 β 細胞進行譜系示蹤，明確了部分關鍵轉錄因子與糖尿病的可能的關系，但這些研究缺乏人類數據的證明。通過免疫熒光染色、蛋白質印跡法等方法可以側面了解細胞去分化的狀態，此時選擇恰當的可以證明胰島 β 細胞身份和反映其去分化狀態的特異性標記就顯得尤為重要。
根據國際糖尿病聯盟統計，2015 年全球糖尿病患者約有 4.15 億人。預測到 2040 年，全球將會有 6.42 億人患有糖尿病，中國糖尿病患者也將達到 1.51 億人。糖尿病是以胰島素絕對或相對不足導致血糖水平升高為特點的慢性疾病，胰島素由胰島 β 細胞合成并分泌，因此糖尿病的發生發展與胰島 β 細胞的衰亡（β cells failure）密切相關。從人類胰腺活檢結果來看，β 細胞衰竭是由 β 細胞的凋亡導致[1-3]，但仍不能完全解釋在 2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）發展的過程中 β 細胞量的減少，也不能解釋在 T2DM 早期的干預對 β 細胞的保護作用。所以最近有學者提出，凋亡并不是導致胰島 β 細胞量丟失的唯一機制，可能還存在其他導致 β 細胞功能紊亂的機制[3]。
T2DM 患者的胰島 β 細胞功能紊亂，并表現出成熟 β 細胞身份丟失（loss of identity）和（或）成熟分化狀態的改變（通常是退化為內分泌前體樣細胞），可能是造成胰島 β 細胞衰亡的原因之一。這種 β 細胞身份的丟失或分化狀態的退化，被認為是去分化。因此，我們將對胰島 β 細胞去分化在人類和嚙齒類動物模型中的證據，以及去分化相關轉錄因子作一綜述。
1 去分化的證據
White 等[4]在 3 位人類 T2DM 患者捐獻的胰腺中，通過免疫熒光染色發現了數量可觀的胰島素和胰高血糖素共陽性，或胰島素與波形間質細胞標記共陽性的細胞。同樣，Spijker 等[5]也在人類和非人類靈長類動物的 T2DM 病例的胰腺樣本中，發現了這種胰島素與胰高血糖素共表達的細胞。哥倫比亞大學的 Cinti 團隊通過對 β 細胞系相關轉錄因子變化的研究，發現了人類糖尿病患者胰島 β 細胞去分化的證據[6]。
目前并非所有學者認同這一理論。有學者發現，在人類 T2DM 患者的胰島細胞中確實存在 β 細胞特異性轉錄因子的變化，但未在嚙齒類動物模型發現去分化機制中典型的內分泌前體細胞或祖細胞的特征性轉錄因子［如神經元素 3 （neurogenin-3，Ngn3）、Nanog、L-Myc］的表達[7]。另一項研究分析了人類胰島單細胞轉錄組，也未發現去分化的明確證據[8-9]。
在胰腺中，胃泌素僅在胚胎時期表達，因此是一種典型的胚胎胰腺標記。在 T2DM 患者高血糖狀態下，小鼠和人類 β 細胞都誘導表達出胃泌素[10]。Talchai 等[11]通過譜系示蹤技術，證明了 FOXO1 基因敲除小鼠在多產或老齡等環境壓力增大的情況下發生糖尿病，且此時其胰島 β 細胞發生了去分化。此外，還有兩個團隊在同一年獨立證明了，KATP 通道突變導致的糖尿病小鼠，其胰島 β 細胞的 Ngn3 表達增加，胰島素表達減少，且經過胰島素治療，糖尿病小鼠不僅可以維持糖代謝穩態，還可讓去分化的 β 細胞重新分化成為胰島素陽性細胞[12-13]。
雖然在人類和動物（尤其是鼠類）中已有一定去分化的證據，但是細胞水平證據的缺乏以及少量反對證據，使得去分化是糖尿病患者胰島 β 細胞衰竭的機制這一理論還需要進一步探索和證實。
2 檢測去分化的方法
2.1 譜系示蹤技術
細胞譜系示蹤（cell lineage tracing）是指利用各種方式標記細胞，并對包括其后代所有細胞的增殖、分化以及遷移等活動進行追蹤觀察。目前最常用且較優的細胞譜系示蹤技術是誘導性重組酶 Cre/loxp 系統。其原理為構建兩種轉基因小鼠，一種是在 Rosa26 等重組影響較小的基因位點插入標記基因（如表達熒光蛋白的基因），該標記基因的表達被一段由同向 Loxp（locus of X-over P1，位于 P1 噬菌體中的識別序列）鉚定的“Stop”序列所干擾，暫時不能表達。另一種小鼠則是在特定基因（如 INS2 基因）啟動子后插入 Cre 重組酶基因。當這兩種轉基因品系的小鼠雜交，其后代就能在表達特定基因（如 INS2）的細胞中產生 Cre 酶，從而切除“Stop”序列，成功表達標記基因（如熒光蛋白）。而這些表達標記基因的細胞，則是有特定基因表達的細胞（如 β 細胞）
在 Cre/loxp 系統的基礎上，另一種可以實現對敲除時間進行時間上的控制的細胞譜系示蹤模型產生。雌激素受體為核受體，利用此性質可以調控 Cre 入核時間。經過修飾的人類雌激素受體與 Cre 結合后，不結合雌二醇，而對他莫昔芬有親和性。在沒有他莫昔芬時，Cre 與雌激素受體的結合體停留在細胞質中，Cre 無法進入細胞核發揮剪切作用。當外源性他莫昔芬存在時，Cre 隨雌激素受體進入細胞核，實現對 loxp 片段的重組修飾。因此，通過控制他莫昔芬的注射時間，就可以控制敲除時間發生的時間（圖 1）。
圖1
他莫昔芬誘導 Cre-loxp 系統原理圖
ER：雌激素受體；Rosa26：小鼠基因中廣泛存在的啟動子
2.2 去分化相關轉錄因子表達變化
通過免疫熒光染色、蛋白質印跡以及定量實時多聚酶鏈式反應等方法，檢測胰島 β 細胞相關轉錄因子的變化，從而證明 β 細胞的去分化。理論上，若成熟 β 細胞的特異性標記降低甚至消失，而代表著內分泌前體細胞的標記同時增加，則說明 β 細胞發生了去分化。
3 去分化相關轉錄因子
能在根據不同環境下作出相應反應，合成并分泌正常胰島素，是成熟的胰島 β 細胞的特點。去分化的胰島 β 細胞雖未死亡，但因去分化為原始 β 細胞，從而不能分泌胰島素。與胰島 β 細胞的分化調控、功能相關的轉錄因子眾多，以下將對與胰島 β 細胞去分化密切相關的轉錄因子作一簡單介紹。
3.1 肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物 A （musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，MafA）
MafA 是一種堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）結構的轉錄因子，結合于胰島素基因的啟動子，啟動胰島素基因的表達[14]。對人類胰島細胞進行單細胞 RNA 分析，發現 MafA 具有 β 細胞特異性[9]。不僅如此，MafA 還具有時間上的特異性。在胰腺發育過程中，只有胰島 β 細胞開始產生胰島素時，MafA 才能被檢測到，而一些其他的胰島 β 細胞重要轉錄因子［如胰-十二指腸同源框-1（pancreas/duodenum homeobox protein 1，Pdx1）和神經分化因子（neurogenic differentiation，NeuroD）］在胰腺發育早期就已經出現并發揮重要作用[15]。而在胰腺內分泌前體細胞內，增加 MafA 的表達將可逆性地抑制該細胞繼續分化[16]。此外，Nishimura 等[17]使用譜系示蹤技術，在小鼠體內證明了 MafA 對維持 β 細胞的成熟狀態至關重要，MafA 的丟失將使原來表達胰島素的成熟 β 細胞不再表達胰島素。以上研究都說明了 MafA 的表達可以作為成熟 β 細胞的可靠標記。
3.2 Pdx1
Pdx1 是胰島素基因表達的關鍵調節子，結合于胰島素基因的 A3 元件，調節胰島素基因的表達[15, 18]，Pdx1 在成人胰腺中的表達基本局限于胰島 β 細胞（高達 91%）[18]。
Pdx1 對胰腺的正常發育也有重要作用，這個作用主要是決定胰腺前體細胞在發育過程中的分化方向[19-20]。Pdx1 是在胰腺發育中第 1 個產生的轉錄因子，在發育過程中 Pdx 確定了內分泌前體細胞分化為 β 細胞的方向[21-22]。Pdx1 對于 α 細胞和 β 細胞的分化都有重要作用，對二者之間的轉分化也可能具有密切聯系。在敲除小鼠 β 細胞的 Pdx1 后，采用譜系示蹤技術發現，許多原產生胰島素的 β 細胞轉變成表達胰高血糖素的 α 細胞[23]。因此有學者認為，Pdx1 掌控調節胰島內分泌細胞分化為 β 細胞的方向，主要通過抑制 α 細胞分化相關的 MafB 的表達，從而抑制胰島內分泌前體細胞往 α 細胞的方向分化[24-26]。
3.3 Ngn3
Ngn3 是一種堿性螺旋-環-螺旋家族的轉錄因子，同樣對胰島內分泌細胞的發育有重要作用。Ngn3 的功能主要是作為內分泌前體細胞基因轉錄的激活子[27-28]。在小鼠的胚胎胰腺中，胰島素和 Ngn3 的免疫熒光共染色發現，Ngn3 不與胰島素共表達。但在胰腺發育的各個時期，以及多種內分泌細胞中，Ngn3 都可檢測到（圖 2）。
圖2
小鼠胰腺發育過程中 Ngn3 表達和翻譯的 3 個階段
從圖 2 可以看出小鼠胰腺的發育從胚胎的第 8.5 天（E8.5）開始。在初次翻譯期間 E9.5～E12.5，最早的內分泌細胞開始表達胰高血糖素，此時 Ngn3 的第 1 個表達峰出現。第 2 次 Ngn3 表達高峰出現在 E13～E16.5 階段，此時分化的內分泌細胞系是產生胰島素的 β 細胞和表達胰腺多肽的 PP 細胞。第 2 個表達峰過后，表達生長抑素的 δ 細胞出現（E14～E16）。隨之 Ngn3 表達降低，出生時幾乎不再表達[29]。因此，Ngn3 可以作為內分泌前體細胞的標記，也可以作為 β 細胞去分化的標記。在糖尿病小鼠的胰島中，發現 β 細胞丟失了成熟的 β 細胞標記，去分化形成胰島素陰性的前體細胞并表達 Ngn3[13]，類似的結果在其他關于胰島 β 細胞去分化的研究[11, 30-31]中也得到了證實。
3.4 乙醛脫氫酶家族 1 成員 A3（aldehyde dehydrogenase 1 family member A3，Aldh1a3）
糖尿病小鼠的基因表達分析研究表明 Aldh1a3 是一種前體細胞標記[32]，在胰腺內分泌細胞中含量豐富[33]。雖然還不確定 Aldh1a3 僅僅是一種標記，還是分化過程中的一種重要因子，但是已有研究證明了 Aldh1 的活性和胰腺分化的關系。在小鼠中，Aldh1 在胰腺腺泡中心細胞[34]——一種潛在的內分泌前體細胞[35]中含量很高，人類胎兒胰腺中，Aldh1 在胰腺的內分泌前體細胞中也含量很豐富，并且功能性抑制其酶促產物維 A 酸，這一過程將會損害 β 細胞的最終分化[36]。
Aldh1a3 的升高在糖尿病患者的 β 細胞中是常見特征，它的過表達雖然不會損害胰島素分泌，但會導致 β 細胞的線粒體功能紊亂，表現出前體樣細胞的特征[37]，因此 Aldh1a3 可能可以作為去分化的標記。目前也有眾多研究已將 Aldh1a3 作為去分化的重要標記[6, 30, 38-39]，或者至少是胰島 β 細胞異質性的標記。但是需要注意的是，Segerstolpe 等[8]對人類 T2DM 患者的胰島進行 RNA 序列分析結果后，并未發現該因子高表達。
3.5 叉頭蛋白轉錄因子（forkhead box protein，Fox）O1
Fox 家族含量和種類豐富，在機體內發揮不同的作用，其中與激素活動密切相關的是 FoxO 亞家族[40]。哺乳動物的細胞表達 4 種 FoxO，分別是 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6[41]。FoxO1 在肝臟、脂肪和胰島 β 細胞中含量最高[42-43]。正常情況下，foxO1 定位于胰島 β 細胞的細胞質，在輕度高血糖條件下，foxO1 可以轉位至細胞核以應對氧化壓力[44-45]。FoxO1 通過上調細胞周期抑制因子以及抑制 Pdx1 的轉錄，來抑制 β 細胞的復制[42]。特異性敲除了胰腺中的 FoxO1 轉基因小鼠，其血糖、胰島素和糖耐量無明顯變化，但是當環境壓力增加，如老年鼠和經歷多產的雌鼠，出現明顯高血糖，此時其胰島 β 細胞數量也大大減少，β 細胞出現去分化而非凋亡[11]。在另一項研究中發現，胰腺特異性 FoxO1 敲除小鼠的胰腺中，胰島素陽性的胰腺導管細胞（被認為是 β 細胞前體）數量增加，并且 FoxO1 可能是通過 Notch 信號途徑的相互作用以及抑制 Ngn3 的表達，從而抑制了 β 細胞的新生和分化[11, 46]。
總之，FoxO1 對胰島 β 細胞的作用復雜，FoxO1 抑制 β 細胞復制和新生，但是同時對在壓力條件下維持 β 細胞的成熟和身份又十分重要。目前的研究多為動物研究，還需要更多更可靠的人類研究，進一步確定其功能和價值。
3.6 NeuroD
NeuroD 是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族成員，也稱作 BETA2，在胰腺和小腸內分泌細胞和神經組織中表達。NeuroD 在胰腺發育過程中十分重要，NeuroD 缺失小鼠的胰島 β 細胞數量急劇減少，導致糖尿病，并最終在圍產期死亡[47]。臨床上 NeuroD 突變可導致成年起病型青少年糖尿病[48]。
胰島素基因加強元件 E-box 和 A-box 在調節胰島素基因表達中扮演著重要角色[49-50]，NeuroD 結合于 E-box、Pdx1 結合于 A-box 對胰島素的表達進行調節。NeuroD 結合并激活胰島素啟動子（圖 3）。NEUROD 基因敲除小鼠，在早期分化胰腺內分泌細胞死亡，導致了胰腺的胰島細胞缺乏[51]。
圖3
胰島素基因轉錄的關鍵轉錄因子
A3-box：胰島素基因中的 A3 盒；C1-box：胰島素基因中的 C1 盒；E1-box：胰島素基因中的 E1 盒
MafA 結合于胰島素基因啟動子區域的順式作用元件 RIPE3b（即C1-box），作為胰島基因的反式激活因子發揮作用（圖 3）。Pdx1 和 NeuroD 都是在胰腺發育早期就開始出現，而且在胰腺的多種細胞中都有表達[15]。
3.7 核轉錄因子 Kappa 同源盒 6（nuclear kappa homeobox 6，Nkx6）
已有研究在多種動物模型中證明了 Nkx6 對 α 和 β 細胞的分化具有重要作用[52]。Nkx6.1 是 β 細胞特異性轉錄因子，T2DM 患者中可以觀察到 Nkx6.1 的降低[53]。進一步研究發現，Nkx6.1 可抑制與 α 細胞的分化密切相關的轉錄因子 Arx，從而維持成熟 β 細胞的身份[53-54]。Nkx6.2 則是在胚胎發育階段表達的轉錄因子，缺乏 Nkx6.1 的小鼠不能表達不同的細胞類型，而 Nkx6.1/6.2 雙敲除小鼠表現出胰島素陽性 β 比數量的下降[55]。這種 Nkx6 時間空間上的分歧可能是理解 β 和 α 細胞譜系的關鍵[55]。
3.8 Nanog 和 八聚體結合蛋白-4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）
胚胎干細胞核心轉錄因子 Nanog、Oct4 和性別決定區 Y 框蛋白 2（SRY-related high-mobility-group box 2，Sox2）是多能干細胞網絡通路中的核心，它們的相互作用和調節可以影響其他多能因子的表達[56]。Nanog 阻止多能干細胞的分化[56]。Oct4 屬于 POU（Pit-Oct-Unc）家族轉錄因子[57]，在胰腺發育過程中的胰腺初級細胞就開始表達 Oct4[58]。Oct4 水平正常的胚胎干細胞保有多能性[59]，因此 Oct4 是干細胞保持多能性和分化的一個關鍵因子[60]。
Nanog 和 Oct4 都是反映細胞多能性的經典標記，若胰島 β 細胞表達了正常成熟細胞不表達的 Nanog 和 Oct4，則可以說明其分化狀態可能有了改變。
4 總結和討論
正如前文提到的，糖尿病患者的胰島 β 細胞出現衰竭可能不能由 β 細胞的凋亡完全解釋，去分化可能是導致其功能紊亂但細胞仍存活的一個重要機制。但去分化的檢測和證明方法困難，最有力的證據應來源于細胞譜系示蹤技術。對轉基因小鼠的 β 細胞進行譜系示蹤，明確了部分關鍵轉錄因子與糖尿病的可能的關系，但這些研究缺乏人類數據的證明。通過免疫熒光染色、蛋白質印跡法等方法可以側面了解細胞去分化的狀態，此時選擇恰當的可以證明胰島 β 細胞身份和反映其去分化狀態的特異性標記就顯得尤為重要。
