引用本文： 謝詠梅, 汪志凌, 王麗媛, 蔡曉唐, 高珊. 抗菌藥物使用對兒童幽門螺桿菌檢測方法的干擾. 華西醫學, 2018, 33(12): 1513-1518. doi: 10.7507/1002-0179.201806126 復制
幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是消化性潰瘍及胃癌等疾病的重要病因。50% 的 Hp 感染始發于兒童期[1]，因此兒童期 Hp 感染的篩查、確診及根除有著重要意義。目前所有的 Hp 檢測方法均建議在檢測前盡量規避相關藥物影響 1 個月以上，尤其是抗生素使用，因其對各種檢測方法的靈敏度及特異度有較大干擾[2]。但兒童期是上呼吸道感染、肺炎、腹瀉等感染性疾病的高發期，很多兒童的消化道癥狀與呼吸道疾患同時發生。加之家屬心情焦慮、醫患關系緊張等因素，兒童抗菌藥物過度使用已是我國臨床普遍存在的問題。我們在臨床工作中發現，許多兒童在疑診 Hp 感染需進行 Hp 檢測時，常常有近期抗菌藥物使用病史，且多數患兒的抗菌藥物使用目的并非為了根除 Hp。由于家長焦慮、時間有限、要求盡快檢測、盡快用藥等具體情況，很多患兒常在有藥物干擾的情況下進行 Hp 檢測。“非根除 Hp 為目的”的抗菌藥物使用已經嚴重干擾了 Hp 檢測的準確性。這是兒科醫生常常面對的現狀。在抗菌藥物影響下，如何判讀 Hp 檢測結果、分辨檢測結果真偽，是消化兒科醫生常要面對的棘手問題。本研究將針對這一常見臨床問題，了解在抗菌藥物干擾下，不同 Hp 感染檢測方法的靈敏度變化，以期提出合理臨床建議，減少誤診及漏診。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
按以下標準前瞻性收集我院 2015 年 6 月—2017 年 12 月門診及住院部患兒，抗菌藥物組與對照組各 200 例。
1.1.1 抗菌藥物組納入標準
① 我院門診及住院部患兒，臨床高度疑診 Hp 感染相關疾病，因臨床診療需要，必須完善胃鏡檢查者；② 胃鏡檢查前 4 周內，因各種原因使用過各種抗生素；③ 年齡≥3 歲，能配合完成碳 13 尿素呼氣試驗（13C-urea breath test，13C-UBT）。
1.1.2 抗菌藥物組排除標準
① 近 4 周內同時服用過磷酸鋁、鋁碳酸鎂、鉍劑等黏膜保護劑；② 近 4 周內同時服用過質子泵抑制劑及其他制酸劑；③ 近 4 周內因各種原因服用過中藥；④ 不能完成后續外周血采集、大便采集及尿素呼氣試驗等檢測，不合作的患兒。
1.1.3 對照組納入標準
① 我院門診及住院部患兒，臨床高度疑診 Hp 感染相關疾病，需要完善胃鏡檢查患兒；② 胃鏡檢查前 4 周內，未使用過任何抗菌藥物；③ 年齡≥3 歲，能配合完成尿素呼氣試驗。
1.1.4 對照組排除標準
同抗菌藥物組排除標準。
1.2 倫理審核
研究涉及的臨床試驗已通過四川大學華西第二醫院倫理委員會批準［（2015）倫審批第（48）號］，并于中國臨床試驗中心注冊（注冊號：ChiCTR-DDD-16010273）。所有患兒家屬均被告知相關事宜及風險，均同意加入研究，并簽署同意書。
1.3 研究方法
詢問記錄所有納入患兒 Hp 檢測前用藥情況，包括服用抗菌藥物種類、用藥時間、用藥原因等相關信息。所有納入患兒在胃鏡檢查時，同時行胃竇及胃體黏膜活檢，活檢標本進行快速尿素酶試驗（rapid urease test，RUT），并送病理檢查。完成胃鏡檢查后，患兒立即進行 13C-UBT 及取外周指血 1 滴進行 Hp 免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）抗體檢測。同時收集患兒大便保存待檢。研究中，所有納入患兒均分別使用以下 5 種方法進行 Hp 檢測。
1.3.1 RUT
胃鏡檢查下，于胃竇及胃體部位各取活檢標本 1 塊，分別行胃竇及胃體 2 個部位的 RUT 試驗。活檢標本浸于胃 Hp 診斷試劑盒（福建三強生物化工有限公司）試劑中孵育，24～25℃ 下，觀察顏色變化，試劑由黃色變紅色為陽性，不變色為陰性。在第 15 分鐘時進行第 1 次結果判讀，待時間延長至第 30 分鐘時，進行第 2 次結果判讀。
1.3.2 13C-UBT
患兒空腹 4 h 以上進行檢測，檢查過程中保持安靜狀態。受檢患兒先空腹呼氣，收集本底氣體。然后飲服浴于 100 mL 冷開水中的 13C-尿素試劑（尿素 13C 散劑呼氣試驗藥盒，75 mg，協和藥業有限公司）。30 min 后再次收集服用 13C-尿素后呼氣樣本。服用試劑前后的呼氣樣本，用 WLD600C 13C 呼氣分析儀（北京萬聯達信科儀器有限公司）進行同位素比值譜儀分析，前后樣本檢測超基準值的差值即檢測結果，檢測結果≥4.0 為陽性，<4.0 為陰性。
1.3.3 Warthin-Starry 染色法（W-S 法）病理顯微鏡檢查 Hp
所有患兒胃鏡檢查時，同時取胃竇及胃體 2 個部位活檢，每個部位各取 1 塊，行 W-S 法顯微鏡檢查 Hp。活檢組織石蠟包埋后切片，切片脫蠟至蒸餾水，用 1% 硝酸銀在 43℃ 水浴浸染 30 min，顯色液顯色 5～15 min，鏡下觀察組織呈淺棕黃色，同時顯色劑變成棕黑色即終止染色，54℃ 熱自來水沖洗終止顯色。切片再經脫水、透明、封固后顯微鏡下檢查（鏡檢）。所有切片由同一病理科醫生鏡檢并判斷結果。鏡下發現棕黑色短棒狀弧形細菌，背景呈灰黃或黃棕色，即診斷 Hp 陽性。顯微鏡下觀察到 Hp 細胞壁部分或全部喪失而細胞膜保持完整，細菌的形態呈現高度多形性改變，即可認定為 Hp 發生 L 型改變[3]。L 型改變的發生率=發現 L 型改變的例數/對應部位 Hp 陽性例數×100%。
1.3.4 膠體金法檢測 Hp 現癥感染抗體（IgM 抗體）
采集患兒外周指血 1 滴，進行 Hp 現癥抗體（IgM 抗體）檢測。HP 抗體檢測試劑盒（Genelabs Assure TM）購自安倍醫療器械貿易（上海）有限公司（GLD’s Hp RT，MP Biomedicals）。按試劑盒說明書嚴格操作，1 滴指血滴入檢測卡，15 min 后讀取結果。A 線為質控線，B 線為現癥感染 IgM 線（current infection marker，CIM 線）—現癥感染條帶 IgM 抗體，C 線為測試線—既往感染條帶 IgG 抗體。根據酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理，CIM 線、質控線和測試線均顯色，即認定為“現癥感染陽性”。僅 A 線及 C 線顯色提示既往感染，非現癥感染。
1.3.5 ELISA 法檢測糞便 Hp 抗原（Hp stool antigen，HpSA）
酶聯免疫分析雙抗體夾心法檢測患兒新鮮大便 HpSA。按 HpSA ELISA 檢測試劑盒（協和藥業有限公司）說明書程序進行操作。收集新鮮糞便標本于 0.5 h 內送檢，并凍存于–80℃ 液氮待檢，檢測同時設立陽性及陰性對照。取 50 mg 大便標本，稀釋于 1 mL 生理鹽水中，取糞便濾液 100 μL 加入包被了抗 Hp 抗體的滴定板孔中，加入酶標抗體，震蕩 20 s，25℃ 孵育 60 min，洗滌滴定板孔 6 次后，加入底物液震蕩 30 s，25℃ 孵育 10 min，加入反應停止液后 15 min，在酶標儀上測定 450/650 nm 吸光度，根據界限值判定結果，吸光度≥0.12 為陽性，吸光度<0.12 為陰性。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；計數資料用例數（百分數）表示，兩組間比較采用四格表 χ2 檢驗，不同檢測方法間的比較采用行×列表 χ2 檢驗及配伍組設計的 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
抗菌藥物組及對照組患兒每組各收集 200 例。抗菌藥物組患兒男 108 例，女 92 例，平均年齡（6.81±1.98）歲，平均病程（14.18±7.29） d。對照組患兒男 112 例，女 88 例，平均年齡（6.79±2.13）歲，平均病程（12.98±6.89） d。兩組患兒性別、年齡、病程差異無統計學意義（P<0.05）。
所有抗菌藥物組患兒中，僅有 25 例（12.5%）患兒使用抗菌藥物的目的是為根除 Hp，這 25 例患兒均為兩聯使用抗菌藥物，其中 20 例使用阿莫西林+克拉霉素，5 例使用阿莫西林+甲硝唑。其余 87.5% 的患兒均因呼吸道感染、發熱、腹瀉、腹痛、嘔吐等病因，近期有使用過下列各種抗菌藥物。多數患兒的近期抗菌藥物使用，并非以根除 Hp 為目的。見表1。
表1
抗菌藥物組患兒的抗菌藥物使用情況（n=200）
2.2 各種方法 Hp 檢測結果
2.2.1 RUT
抗菌藥物組 RUT 檢測陽性率低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。胃竇部及胃體部聯合活檢，并延長檢測時間為 30 min 可提高陽性檢出率。見表 2。
表2
RUT 檢測 Hp 結果［n=200，例（%）］
2.2.2 13C-UBT
抗菌藥物組陽性率低于對照組，且抗菌藥物組陽性定量值低于對照組陽性測定值的 50% 以下，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
13C-UBT 檢測 Hp 結果［n=200，例（%）］
2.2.3 W-S 法病理鏡檢 Hp
抗菌藥物組活檢標本中，Hp 菌量多少不一，但普遍較對照組菌量明顯減少，散在分布在腺體陷窩中。抗菌藥物組標本中 L 型改變很常見（80.9% 可見），菌體呈球形樣變，或萎縮變形，分布稀疏。抗菌藥物組胃竇部活檢陽性率僅為 42.0%，明顯低于對照組（P<0.05），胃體及胃竇部聯合活檢有利于提高陽性檢出率。抗菌藥物組胃鏡下活檢總的 Hp 陽性率為 48.0%，低于對照組的陽性率（68.0%），抗菌藥物組 Hp 的 L 型變發生率遠高于對照組，兩組之間差異有統計學意義（P<0.05）。見表 4。
表4
W-S 法病理鏡檢 Hp 結果［n=200，例（%）］
2.2.4 膠體金法檢測 Hp 現癥感染抗體（IgM 抗體）
兩組患兒的 IgG 抗體陽性率差異無統計學意義（P>0.05）；但抗菌藥物組 IgM 抗體陽性率低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
表5
膠體金法檢測 Hp 抗體結果［n=200，例（%）］
2.2.5 ELISA 法檢測 HpSA
抗菌藥物組與對照組的 HpSA 陽性率分別為 38.0%（76/200）和 69.0%（138/200），差異有統計學意義（χ2=9.986，P<0.001）。抗菌藥物干擾下 HpSA 檢測的靈敏度有明顯下降。
2.2.6 各種 Hp 檢測方法陽性率比較
5 種檢測方法中，抗菌藥物組的陽性率均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。抗菌藥物組中，以 13C-UBT 陽性率最高（vs. RUT、W-S 法、HpSA，P<0.05；vs. 血 IgM 抗體，χ2=7.111，P=0.004）。見表 6。
表6
各種方法檢測 Hp 陽性率比較［n=200，例（%）］
3 討論
Hp 感染是兒童期非特異性腹痛及消化性潰瘍的重要病因[4]。50% 的 Hp 感染始發于兒童期[5]，我國兒童 Hp 自然感染率約為 17%[6]。目前所有的 Hp 相關指南中均提到“檢測與治療策略”[7-8]。Hp 感染的治療均基于準確的 Hp 檢測。而目前所有 Hp 檢測方法都建議規避相關藥物干擾至少 1 個月[9-10]。尤其是“與 Hp 根除相關的抗菌藥物”使用，對 Hp 檢測準確性影響極大[11]。我們在臨床上發現，兒童 Hp 感染的確診往往受眾多因素干擾，包括患兒癥狀敘述不清、檢查不配合、對侵襲性檢測情緒抵觸、家屬情緒焦慮、要求未確診先診斷性用藥等。且兒童為呼吸道感染、胃腸炎等疾病的高發人群，多數患兒在行 Hp 檢測前常因各種原因使用過抗菌藥物，難以達到規避藥物 1 個月以上。我科 5 年來數千例兒童胃鏡檢查顯示，RUT 的總體陽性率不足 5%，遠遠低于正常人群感染率[12]及內鏡下影像提示 Hp 感染率。究其原因，我們發現 50%～60% 的患兒近期使用過抗菌藥物，且多數為呼吸道感染、腹瀉、嘔吐、發熱等病因，抗菌藥物使用多數不是為了根除 Hp。很多患兒需補充多項檢測方能確診 Hp 感染。“非 Hp 根除性”的抗菌藥物使用已嚴重干擾了兒童 Hp 檢測的準確性。既往研究多針對幾種有限的根除 Hp 相關的抗菌藥物，對于品種更多的兒童其他疾患常用抗菌藥物，尚無報道探討過其對 Hp 檢測的干擾狀況。
目前 Hp 檢測方法很多，總體分為侵襲性及非侵襲性兩類，每種方法都各有利弊，適用范圍不同。既往關于 Hp 檢測敏感性及特異性的文獻，將抗生素服用者列為排除對象，均是無抗生素干擾下的結果[13]。而實際臨床上，兒童因 Hp 根除使用抗菌藥物并不多，更多的時候使用抗菌藥物不是為了進行 Hp 根除，且很難避免。Hp 根除性抗菌藥物（阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑等）對 Hp 檢測的干擾常有報道，但其他類別的兒科呼吸道常用抗菌藥物對 Hp 檢測的干擾狀況如何，未見報道。因國外抗菌藥物控制相對嚴格，此類情況未見報道。我國兒科抗菌藥物確實存在過度使用問題，針對這一現狀，尚未見相關臨床調研。在此次研究中，我們發現，在近期使用過抗菌藥物的患兒中，有 87.5% 的患兒是因呼吸道感染、發熱等其他原因使用抗菌藥物，真正涉及 Hp 根除性的抗菌藥物使用者僅占 12.5%。眾所周知，阿莫西林等 Hp 根除相關性抗菌藥物會抑制 Hp 增殖，導致 Hp 檢測假陰性[14]。本研究結果顯示，頭孢菌素類、阿奇霉素等呼吸道常用抗菌藥物，也會導致 Hp 陽性檢出率顯著下降，這些種類的抗菌藥物是通過直接抑制 Hp 增殖，還是通過改變微生態環境間接抑制 Hp 增殖，機制尚不清，但本研究結果顯示其他類別的抗菌藥物使用也會嚴重干擾 Hp 檢出率。在這些抗菌藥物使用后的短期內檢測 Hp，假陰性率大大增高。
RUT 是胃鏡下常用的 Hp 檢測方法，因 Hp 在胃中的分布不均，且受限于取材部位及點狀活檢，此法的敏感性及特異性都較低。我們的檢測結果顯示，高度疑診 Hp 感染的患兒中，對照組的陽性率為 75.0%。而抗菌藥物使用組的陽性率則降低了近一半，檢測敏感性大大下降。如果多部位活檢，并加倍延長顯色時間可將陽性率由 29.0% 提升至 36.5%，但仍有大量的患兒漏診。13C-UBT 是 Hp 診斷的金標準。我們的研究結果顯示，13C-UBT 在 5 種 Hp 檢測方法中最敏感，盡管較對照組陽性率仍有顯著降低，但較其他幾種檢測方法，陽性率仍然最高。在抗菌藥物使用干擾下，13C-UBT 的測定值較對照組降低 50% 以上。可見在抗菌藥物干擾下，即使 13C-UBT 在低閾值狀態也有顯著臨床意義，對于這部分低閾值患兒，有必要后期復查及隨訪了解 Hp 攜帶狀況。病理活檢因受限于取材部位及 Hp 分布的局灶性，其敏感性原本不高。在抗菌藥物干擾下，其陽性檢出率也大大降低，并且 Hp 的 L 型變很常見，胃竇及胃體部位 L 型變的發生率分別為 80.9% 及 67.9%。若配合多點活檢，病理檢查敏感性仍遠遠高于 RUT，因此對于內鏡下表現符合 Hp 感染征象，疑診 RUT 假陰性的患兒，建議同時多點活檢行 Hp 特殊染色，并務必提醒病理科醫生注意觀察，以免因 Hp 分布稀疏及 L 型變而漏診。血液 Hp-IgM 抗體檢測在 5 種檢測方法中敏感性僅次于 13C-UBT，因其僅需 1 滴指血，顯示結果快速，是兒童 Hp 檢測的優選方法。從原理上說 IgM 抗體檢測應該不受抗菌藥物使用的干擾，但我們發現，抗菌藥物使用組的抗體檢出率仍低于對照組。究其原因，可能受抗菌藥物干擾后，Hp 生長緩慢、增殖抑制、機體載菌量下降，使 IgM 抗體產生延遲或含量過低，導致檢測假陰性。但總體而言 IgM 抗體檢測敏感率仍較高，此方法不失為檢測失敗者的優選補充方案。HpSA 檢測因其無痛苦性，在兒童患者常有采用，但其敏感性及特異性較低，常常作為流行病學人群感染率調查的方法[15]，如果用于臨床確診，受限于采樣誤差及菌體載量不同，容易漏診。我們的檢測結果顯示，在抗菌藥物使用干擾下，因 Hp 抑制狀態，細菌載量大大下降，HpSA 檢測陽性率降低近一半，其協助診斷的價值不大。同時，對照組檢測結果顯示，若無抗菌藥物干擾，RUT 與 13C-UBT 陽性率接近，二者敏感性較高。而病理活檢、IgM 抗體檢測及糞便抗原檢測的陽性敏感率較為接近。
從我們的研究結果可見，在兒童 Hp 檢測前 1 個月，多種抗菌藥物的使用都會干擾降低 Hp 的檢出率，其不僅限于有限的幾種“根除 Hp 相關抗菌藥物”，更多的“非根除 Hp 相關抗菌藥物”也會嚴重干擾 Hp 檢測。受限于兒童的多病性、治療緊迫性及家長時間安排等現實因素，臨床上常常被迫在抗菌藥物干擾下行 Hp 檢測。針對這一現狀，我們的研究結果顯示，13C-UBT 是首選推薦的方法，其敏感性高，且無創無痛苦。而對于小年齡嬰幼兒，因其不能配合呼氣動作，無法進行 13C-UBT，則首選推薦指血 IgM 膠體金法檢測，該法痛苦性小，準確性較高。而 HpSA 檢測及血 IgG 抗體檢測臨床參考價值較低。對于臨床需要完成胃鏡檢查的患兒，若內鏡征象疑診 Hp 感染，但 RUT 陰性，需警惕 RUT 假陰性可能，建議務必同時完成多點病理活檢協助 Hp 檢測，因 RUT 在抗菌藥物干擾下漏檢率極高。
綜上所述，本研究對臨床上抗菌藥物干擾兒童 Hp 檢測的現狀進行了分析，為兒科醫生對結果判斷提供經驗借鑒，并提出優選方案及組合建議，希望能協助兒科醫生正確評判檢測結果，避免漏診及盲目用藥。
幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是消化性潰瘍及胃癌等疾病的重要病因。50% 的 Hp 感染始發于兒童期[1]，因此兒童期 Hp 感染的篩查、確診及根除有著重要意義。目前所有的 Hp 檢測方法均建議在檢測前盡量規避相關藥物影響 1 個月以上，尤其是抗生素使用，因其對各種檢測方法的靈敏度及特異度有較大干擾[2]。但兒童期是上呼吸道感染、肺炎、腹瀉等感染性疾病的高發期，很多兒童的消化道癥狀與呼吸道疾患同時發生。加之家屬心情焦慮、醫患關系緊張等因素，兒童抗菌藥物過度使用已是我國臨床普遍存在的問題。我們在臨床工作中發現，許多兒童在疑診 Hp 感染需進行 Hp 檢測時，常常有近期抗菌藥物使用病史，且多數患兒的抗菌藥物使用目的并非為了根除 Hp。由于家長焦慮、時間有限、要求盡快檢測、盡快用藥等具體情況，很多患兒常在有藥物干擾的情況下進行 Hp 檢測。“非根除 Hp 為目的”的抗菌藥物使用已經嚴重干擾了 Hp 檢測的準確性。這是兒科醫生常常面對的現狀。在抗菌藥物影響下，如何判讀 Hp 檢測結果、分辨檢測結果真偽，是消化兒科醫生常要面對的棘手問題。本研究將針對這一常見臨床問題，了解在抗菌藥物干擾下，不同 Hp 感染檢測方法的靈敏度變化，以期提出合理臨床建議，減少誤診及漏診。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
按以下標準前瞻性收集我院 2015 年 6 月—2017 年 12 月門診及住院部患兒，抗菌藥物組與對照組各 200 例。
1.1.1 抗菌藥物組納入標準
① 我院門診及住院部患兒，臨床高度疑診 Hp 感染相關疾病，因臨床診療需要，必須完善胃鏡檢查者；② 胃鏡檢查前 4 周內，因各種原因使用過各種抗生素；③ 年齡≥3 歲，能配合完成碳 13 尿素呼氣試驗（13C-urea breath test，13C-UBT）。
1.1.2 抗菌藥物組排除標準
① 近 4 周內同時服用過磷酸鋁、鋁碳酸鎂、鉍劑等黏膜保護劑；② 近 4 周內同時服用過質子泵抑制劑及其他制酸劑；③ 近 4 周內因各種原因服用過中藥；④ 不能完成后續外周血采集、大便采集及尿素呼氣試驗等檢測，不合作的患兒。
1.1.3 對照組納入標準
① 我院門診及住院部患兒，臨床高度疑診 Hp 感染相關疾病，需要完善胃鏡檢查患兒；② 胃鏡檢查前 4 周內，未使用過任何抗菌藥物；③ 年齡≥3 歲，能配合完成尿素呼氣試驗。
1.1.4 對照組排除標準
同抗菌藥物組排除標準。
1.2 倫理審核
研究涉及的臨床試驗已通過四川大學華西第二醫院倫理委員會批準［（2015）倫審批第（48）號］，并于中國臨床試驗中心注冊（注冊號：ChiCTR-DDD-16010273）。所有患兒家屬均被告知相關事宜及風險，均同意加入研究，并簽署同意書。
1.3 研究方法
詢問記錄所有納入患兒 Hp 檢測前用藥情況，包括服用抗菌藥物種類、用藥時間、用藥原因等相關信息。所有納入患兒在胃鏡檢查時，同時行胃竇及胃體黏膜活檢，活檢標本進行快速尿素酶試驗（rapid urease test，RUT），并送病理檢查。完成胃鏡檢查后，患兒立即進行 13C-UBT 及取外周指血 1 滴進行 Hp 免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）抗體檢測。同時收集患兒大便保存待檢。研究中，所有納入患兒均分別使用以下 5 種方法進行 Hp 檢測。
1.3.1 RUT
胃鏡檢查下，于胃竇及胃體部位各取活檢標本 1 塊，分別行胃竇及胃體 2 個部位的 RUT 試驗。活檢標本浸于胃 Hp 診斷試劑盒（福建三強生物化工有限公司）試劑中孵育，24～25℃ 下，觀察顏色變化，試劑由黃色變紅色為陽性，不變色為陰性。在第 15 分鐘時進行第 1 次結果判讀，待時間延長至第 30 分鐘時，進行第 2 次結果判讀。
1.3.2 13C-UBT
患兒空腹 4 h 以上進行檢測，檢查過程中保持安靜狀態。受檢患兒先空腹呼氣，收集本底氣體。然后飲服浴于 100 mL 冷開水中的 13C-尿素試劑（尿素 13C 散劑呼氣試驗藥盒，75 mg，協和藥業有限公司）。30 min 后再次收集服用 13C-尿素后呼氣樣本。服用試劑前后的呼氣樣本，用 WLD600C 13C 呼氣分析儀（北京萬聯達信科儀器有限公司）進行同位素比值譜儀分析，前后樣本檢測超基準值的差值即檢測結果，檢測結果≥4.0 為陽性，<4.0 為陰性。
1.3.3 Warthin-Starry 染色法（W-S 法）病理顯微鏡檢查 Hp
所有患兒胃鏡檢查時，同時取胃竇及胃體 2 個部位活檢，每個部位各取 1 塊，行 W-S 法顯微鏡檢查 Hp。活檢組織石蠟包埋后切片，切片脫蠟至蒸餾水，用 1% 硝酸銀在 43℃ 水浴浸染 30 min，顯色液顯色 5～15 min，鏡下觀察組織呈淺棕黃色，同時顯色劑變成棕黑色即終止染色，54℃ 熱自來水沖洗終止顯色。切片再經脫水、透明、封固后顯微鏡下檢查（鏡檢）。所有切片由同一病理科醫生鏡檢并判斷結果。鏡下發現棕黑色短棒狀弧形細菌，背景呈灰黃或黃棕色，即診斷 Hp 陽性。顯微鏡下觀察到 Hp 細胞壁部分或全部喪失而細胞膜保持完整，細菌的形態呈現高度多形性改變，即可認定為 Hp 發生 L 型改變[3]。L 型改變的發生率=發現 L 型改變的例數/對應部位 Hp 陽性例數×100%。
1.3.4 膠體金法檢測 Hp 現癥感染抗體（IgM 抗體）
采集患兒外周指血 1 滴，進行 Hp 現癥抗體（IgM 抗體）檢測。HP 抗體檢測試劑盒（Genelabs Assure TM）購自安倍醫療器械貿易（上海）有限公司（GLD’s Hp RT，MP Biomedicals）。按試劑盒說明書嚴格操作，1 滴指血滴入檢測卡，15 min 后讀取結果。A 線為質控線，B 線為現癥感染 IgM 線（current infection marker，CIM 線）—現癥感染條帶 IgM 抗體，C 線為測試線—既往感染條帶 IgG 抗體。根據酶聯免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）原理，CIM 線、質控線和測試線均顯色，即認定為“現癥感染陽性”。僅 A 線及 C 線顯色提示既往感染，非現癥感染。
1.3.5 ELISA 法檢測糞便 Hp 抗原（Hp stool antigen，HpSA）
酶聯免疫分析雙抗體夾心法檢測患兒新鮮大便 HpSA。按 HpSA ELISA 檢測試劑盒（協和藥業有限公司）說明書程序進行操作。收集新鮮糞便標本于 0.5 h 內送檢，并凍存于–80℃ 液氮待檢，檢測同時設立陽性及陰性對照。取 50 mg 大便標本，稀釋于 1 mL 生理鹽水中，取糞便濾液 100 μL 加入包被了抗 Hp 抗體的滴定板孔中，加入酶標抗體，震蕩 20 s，25℃ 孵育 60 min，洗滌滴定板孔 6 次后，加入底物液震蕩 30 s，25℃ 孵育 10 min，加入反應停止液后 15 min，在酶標儀上測定 450/650 nm 吸光度，根據界限值判定結果，吸光度≥0.12 為陽性，吸光度<0.12 為陰性。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗；計數資料用例數（百分數）表示，兩組間比較采用四格表 χ2 檢驗，不同檢測方法間的比較采用行×列表 χ2 檢驗及配伍組設計的 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般資料
抗菌藥物組及對照組患兒每組各收集 200 例。抗菌藥物組患兒男 108 例，女 92 例，平均年齡（6.81±1.98）歲，平均病程（14.18±7.29） d。對照組患兒男 112 例，女 88 例，平均年齡（6.79±2.13）歲，平均病程（12.98±6.89） d。兩組患兒性別、年齡、病程差異無統計學意義（P<0.05）。
所有抗菌藥物組患兒中，僅有 25 例（12.5%）患兒使用抗菌藥物的目的是為根除 Hp，這 25 例患兒均為兩聯使用抗菌藥物，其中 20 例使用阿莫西林+克拉霉素，5 例使用阿莫西林+甲硝唑。其余 87.5% 的患兒均因呼吸道感染、發熱、腹瀉、腹痛、嘔吐等病因，近期有使用過下列各種抗菌藥物。多數患兒的近期抗菌藥物使用，并非以根除 Hp 為目的。見表1。
表1
抗菌藥物組患兒的抗菌藥物使用情況（n=200）
2.2 各種方法 Hp 檢測結果
2.2.1 RUT
抗菌藥物組 RUT 檢測陽性率低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。胃竇部及胃體部聯合活檢，并延長檢測時間為 30 min 可提高陽性檢出率。見表 2。
表2
RUT 檢測 Hp 結果［n=200，例（%）］
2.2.2 13C-UBT
抗菌藥物組陽性率低于對照組，且抗菌藥物組陽性定量值低于對照組陽性測定值的 50% 以下，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
13C-UBT 檢測 Hp 結果［n=200，例（%）］
2.2.3 W-S 法病理鏡檢 Hp
抗菌藥物組活檢標本中，Hp 菌量多少不一，但普遍較對照組菌量明顯減少，散在分布在腺體陷窩中。抗菌藥物組標本中 L 型改變很常見（80.9% 可見），菌體呈球形樣變，或萎縮變形，分布稀疏。抗菌藥物組胃竇部活檢陽性率僅為 42.0%，明顯低于對照組（P<0.05），胃體及胃竇部聯合活檢有利于提高陽性檢出率。抗菌藥物組胃鏡下活檢總的 Hp 陽性率為 48.0%，低于對照組的陽性率（68.0%），抗菌藥物組 Hp 的 L 型變發生率遠高于對照組，兩組之間差異有統計學意義（P<0.05）。見表 4。
表4
W-S 法病理鏡檢 Hp 結果［n=200，例（%）］
2.2.4 膠體金法檢測 Hp 現癥感染抗體（IgM 抗體）
兩組患兒的 IgG 抗體陽性率差異無統計學意義（P>0.05）；但抗菌藥物組 IgM 抗體陽性率低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 5。
表5
膠體金法檢測 Hp 抗體結果［n=200，例（%）］
2.2.5 ELISA 法檢測 HpSA
抗菌藥物組與對照組的 HpSA 陽性率分別為 38.0%（76/200）和 69.0%（138/200），差異有統計學意義（χ2=9.986，P<0.001）。抗菌藥物干擾下 HpSA 檢測的靈敏度有明顯下降。
2.2.6 各種 Hp 檢測方法陽性率比較
5 種檢測方法中，抗菌藥物組的陽性率均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。抗菌藥物組中，以 13C-UBT 陽性率最高（vs. RUT、W-S 法、HpSA，P<0.05；vs. 血 IgM 抗體，χ2=7.111，P=0.004）。見表 6。
表6
各種方法檢測 Hp 陽性率比較［n=200，例（%）］
3 討論
Hp 感染是兒童期非特異性腹痛及消化性潰瘍的重要病因[4]。50% 的 Hp 感染始發于兒童期[5]，我國兒童 Hp 自然感染率約為 17%[6]。目前所有的 Hp 相關指南中均提到“檢測與治療策略”[7-8]。Hp 感染的治療均基于準確的 Hp 檢測。而目前所有 Hp 檢測方法都建議規避相關藥物干擾至少 1 個月[9-10]。尤其是“與 Hp 根除相關的抗菌藥物”使用，對 Hp 檢測準確性影響極大[11]。我們在臨床上發現，兒童 Hp 感染的確診往往受眾多因素干擾，包括患兒癥狀敘述不清、檢查不配合、對侵襲性檢測情緒抵觸、家屬情緒焦慮、要求未確診先診斷性用藥等。且兒童為呼吸道感染、胃腸炎等疾病的高發人群，多數患兒在行 Hp 檢測前常因各種原因使用過抗菌藥物，難以達到規避藥物 1 個月以上。我科 5 年來數千例兒童胃鏡檢查顯示，RUT 的總體陽性率不足 5%，遠遠低于正常人群感染率[12]及內鏡下影像提示 Hp 感染率。究其原因，我們發現 50%～60% 的患兒近期使用過抗菌藥物，且多數為呼吸道感染、腹瀉、嘔吐、發熱等病因，抗菌藥物使用多數不是為了根除 Hp。很多患兒需補充多項檢測方能確診 Hp 感染。“非 Hp 根除性”的抗菌藥物使用已嚴重干擾了兒童 Hp 檢測的準確性。既往研究多針對幾種有限的根除 Hp 相關的抗菌藥物，對于品種更多的兒童其他疾患常用抗菌藥物，尚無報道探討過其對 Hp 檢測的干擾狀況。
目前 Hp 檢測方法很多，總體分為侵襲性及非侵襲性兩類，每種方法都各有利弊，適用范圍不同。既往關于 Hp 檢測敏感性及特異性的文獻，將抗生素服用者列為排除對象，均是無抗生素干擾下的結果[13]。而實際臨床上，兒童因 Hp 根除使用抗菌藥物并不多，更多的時候使用抗菌藥物不是為了進行 Hp 根除，且很難避免。Hp 根除性抗菌藥物（阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑等）對 Hp 檢測的干擾常有報道，但其他類別的兒科呼吸道常用抗菌藥物對 Hp 檢測的干擾狀況如何，未見報道。因國外抗菌藥物控制相對嚴格，此類情況未見報道。我國兒科抗菌藥物確實存在過度使用問題，針對這一現狀，尚未見相關臨床調研。在此次研究中，我們發現，在近期使用過抗菌藥物的患兒中，有 87.5% 的患兒是因呼吸道感染、發熱等其他原因使用抗菌藥物，真正涉及 Hp 根除性的抗菌藥物使用者僅占 12.5%。眾所周知，阿莫西林等 Hp 根除相關性抗菌藥物會抑制 Hp 增殖，導致 Hp 檢測假陰性[14]。本研究結果顯示，頭孢菌素類、阿奇霉素等呼吸道常用抗菌藥物，也會導致 Hp 陽性檢出率顯著下降，這些種類的抗菌藥物是通過直接抑制 Hp 增殖，還是通過改變微生態環境間接抑制 Hp 增殖，機制尚不清，但本研究結果顯示其他類別的抗菌藥物使用也會嚴重干擾 Hp 檢出率。在這些抗菌藥物使用后的短期內檢測 Hp，假陰性率大大增高。
RUT 是胃鏡下常用的 Hp 檢測方法，因 Hp 在胃中的分布不均，且受限于取材部位及點狀活檢，此法的敏感性及特異性都較低。我們的檢測結果顯示，高度疑診 Hp 感染的患兒中，對照組的陽性率為 75.0%。而抗菌藥物使用組的陽性率則降低了近一半，檢測敏感性大大下降。如果多部位活檢，并加倍延長顯色時間可將陽性率由 29.0% 提升至 36.5%，但仍有大量的患兒漏診。13C-UBT 是 Hp 診斷的金標準。我們的研究結果顯示，13C-UBT 在 5 種 Hp 檢測方法中最敏感，盡管較對照組陽性率仍有顯著降低，但較其他幾種檢測方法，陽性率仍然最高。在抗菌藥物使用干擾下，13C-UBT 的測定值較對照組降低 50% 以上。可見在抗菌藥物干擾下，即使 13C-UBT 在低閾值狀態也有顯著臨床意義，對于這部分低閾值患兒，有必要后期復查及隨訪了解 Hp 攜帶狀況。病理活檢因受限于取材部位及 Hp 分布的局灶性，其敏感性原本不高。在抗菌藥物干擾下，其陽性檢出率也大大降低，并且 Hp 的 L 型變很常見，胃竇及胃體部位 L 型變的發生率分別為 80.9% 及 67.9%。若配合多點活檢，病理檢查敏感性仍遠遠高于 RUT，因此對于內鏡下表現符合 Hp 感染征象，疑診 RUT 假陰性的患兒，建議同時多點活檢行 Hp 特殊染色，并務必提醒病理科醫生注意觀察，以免因 Hp 分布稀疏及 L 型變而漏診。血液 Hp-IgM 抗體檢測在 5 種檢測方法中敏感性僅次于 13C-UBT，因其僅需 1 滴指血，顯示結果快速，是兒童 Hp 檢測的優選方法。從原理上說 IgM 抗體檢測應該不受抗菌藥物使用的干擾，但我們發現，抗菌藥物使用組的抗體檢出率仍低于對照組。究其原因，可能受抗菌藥物干擾后，Hp 生長緩慢、增殖抑制、機體載菌量下降，使 IgM 抗體產生延遲或含量過低，導致檢測假陰性。但總體而言 IgM 抗體檢測敏感率仍較高，此方法不失為檢測失敗者的優選補充方案。HpSA 檢測因其無痛苦性，在兒童患者常有采用，但其敏感性及特異性較低，常常作為流行病學人群感染率調查的方法[15]，如果用于臨床確診，受限于采樣誤差及菌體載量不同，容易漏診。我們的檢測結果顯示，在抗菌藥物使用干擾下，因 Hp 抑制狀態，細菌載量大大下降，HpSA 檢測陽性率降低近一半，其協助診斷的價值不大。同時，對照組檢測結果顯示，若無抗菌藥物干擾，RUT 與 13C-UBT 陽性率接近，二者敏感性較高。而病理活檢、IgM 抗體檢測及糞便抗原檢測的陽性敏感率較為接近。
從我們的研究結果可見，在兒童 Hp 檢測前 1 個月，多種抗菌藥物的使用都會干擾降低 Hp 的檢出率，其不僅限于有限的幾種“根除 Hp 相關抗菌藥物”，更多的“非根除 Hp 相關抗菌藥物”也會嚴重干擾 Hp 檢測。受限于兒童的多病性、治療緊迫性及家長時間安排等現實因素，臨床上常常被迫在抗菌藥物干擾下行 Hp 檢測。針對這一現狀，我們的研究結果顯示，13C-UBT 是首選推薦的方法，其敏感性高，且無創無痛苦。而對于小年齡嬰幼兒，因其不能配合呼氣動作，無法進行 13C-UBT，則首選推薦指血 IgM 膠體金法檢測，該法痛苦性小，準確性較高。而 HpSA 檢測及血 IgG 抗體檢測臨床參考價值較低。對于臨床需要完成胃鏡檢查的患兒，若內鏡征象疑診 Hp 感染，但 RUT 陰性，需警惕 RUT 假陰性可能，建議務必同時完成多點病理活檢協助 Hp 檢測，因 RUT 在抗菌藥物干擾下漏檢率極高。
綜上所述，本研究對臨床上抗菌藥物干擾兒童 Hp 檢測的現狀進行了分析，為兒科醫生對結果判斷提供經驗借鑒，并提出優選方案及組合建議，希望能協助兒科醫生正確評判檢測結果，避免漏診及盲目用藥。
