引用本文： 楊旭潔, 焦琳, 白浩, 陳捷, 吳茜, 趙珍珍, 孟子芮. 肺結核患者發生乙型肝炎病毒共感染遺傳易感性的全基因組關聯分析. 華西醫學, 2019, 34(8): 885-889. doi: 10.7507/1002-0179.201907070 復制
乙型肝炎（乙肝）病毒感染和結核感染是兩個全球性公共衛生問題。據調查，目前我國乙肝病毒表面抗原陽性患者達 7.8%[1]。2010 年全國第五次結核病流行病學調查顯示，15 歲及以上人群活動性肺結核的患病率高達 0.459%[2]。來自我國不同地區的調查顯示，肺結核感染者的乙肝病毒表面抗原流行率在 7.3%～13.7%，提示我國結核乙肝合并感染有很高的流行背景[3]。結核和乙肝病毒感染的臨床結果在個體間差異很大[4-5]，而雙胞胎研究揭示宿主遺傳因素在其中發揮重要作用[6-7]。如果機體針對乙肝病毒和結核分枝桿菌感染的免疫調節存在某些共有途徑，當宿主遺傳因素造成這些共有途徑的免疫失調時，則會造成某些結核患者更容易發生乙肝共感染。對結核病患者發生乙肝共感染發病機制的相關遺傳因素進行分析，有助于早期發現發生共感染風險較高的易感個體，從而早期進行更密切的醫學監測，或是發現新的潛在治療靶點，為結核乙肝共感染的有效防治提供思路。近年來已有大量研究通過全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）成功鑒定出與結核和乙肝感染相關的基因和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），如 ESRRB[8]和 STAT4 等[9]。但目前針對結核乙肝共感染的研究主要圍繞抗結核藥物誘發藥物性肝損傷和治療，對于結核病患者發生乙肝共感染發病機制的相關遺傳因素的研究卻罕見報道。因此本研究從宿主遺傳學的角度，利用 GWAS 探究結核患者發生乙肝共感染的關鍵位點和相關通路。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2013 年 3 月—2018 年 3 月于四川大學華西醫院就診的初治肺結核患者 946 例，其中結核單一感染 888 例，結核乙肝合并感染 58 例。納入標準：① 乙肝診治符合 2015 年《慢性乙型肝炎防治指南》新標準[10]，肺結核診治符合《WS 288－2017 肺結核診斷》新標準[11]，無其他臟器嚴重疾病；② 首次發病；③ 既往未進行抗乙肝病毒和抗結核桿菌治療。排除標準：① 其他類型病毒性肝炎；② 肝吸蟲等寄生蟲感染；③ 其他中樞神經系統疾病以及自身免疫系統疾病；④ 惡性腫瘤；⑤ 曾接受過甾體激素類或干擾素等藥物治療。本研究經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會批準［審批號：2019 年審（151 號）］，所有研究對象均簽署知情同意書。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
QIAampDNA 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）；無水乙醇（成都市科隆化學品有限公司）；蛋白酶 K（德國 Roche 公司）；Human Omni Express 基因分型試劑盒（美國 Illumina 公司）；離心管、槍頭（美國 Axygen Biosciences 公司）。
1.2.2 主要儀器
高速臺式離心機、各種量程移液器（德國 Eppendorf 公司）；?80℃ 超低溫冰箱（德國 Heraeus 公司）；Milli-Q Integral 10 水純化系統（美國 Millipore 公司）；微量分光光度計（美國 GE 公司）；Human Omni Express 基因分型平臺（美國 Illumina 公司）；熱板（美國 Thermo 公司）。
1.3 方法
1.3.1 基因組 DNA 提取
采用 QIAampDNA 試劑盒提取樣本 DNA。采集上述研究對象的外周靜脈血標本 5 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝。將 200 μL 全血加入 1.5 mL 離心管中，加入 20 μL 的蛋白酶 K 和 200 μL Buffer AL 后立即振蕩混勻，于 56℃ 水浴 30 min 后向離心管中加入 200 μL 無水乙醇，振蕩混勻，瞬時離心。將上一步所得濾液和絮狀沉淀加入 QIAamp 吸附柱（吸附柱放入收集管），10 000 r/min 離心 1 min（離心半徑 7 cm），棄廢液。更換收集管，向吸附柱中加入 500 μL Buffer AW1，10 000 r/min 離心 1 min（離心半徑 7 cm），棄廢液；再次更換收集管，加入 500 μL Buffer AW 2，14 000 r/min 離心 5 min（離心半徑 7 cm），棄廢液。將吸附柱移至新的離心管中，加入 200 μL 的 Buffer AE，37℃ 放置 30 min 后 8 000 r/min 離心 1 min（離心半徑 7 cm），所得濾液即為提取的 DNA。采用分光光度計檢測 DNA 純度和濃度，DNA 濃度高于 50 ng/μL 的樣本加入適量 Buffer AE 稀釋至工作濃度（50 ng/μL），未能滿足用于 Illumina 基因分型的 50 ng/μL 最小 DNA 濃度的樣品被去除。提取的 DNA 放置于?80℃ 保存備用。
1.3.2 基因分型及質量控制（質控）
使用 Illumina Human Omni Express 基因芯片分型實驗平臺對患者的 DNA 進行全基因組基因分型。具體步驟根據 Illumina Infinium HD assay protocol guide 手冊執行。然后利用 PLINK 軟件對全基因組掃描所得到的原始數據進行質控。樣本質控：① 去除檢出率小于 95% 的樣本；② 通過親緣關系檢測去除重復抽樣樣本及親緣樣本；③ 去除非漢族人群樣本；④ 去除性別不一致的樣本；⑤ 計算雜合率，去除超過 3 個標準偏差的樣本。SNP 質控：① 去除哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）顯著偏差（P≤1×10?4）的 SNP；② 去除最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）<0.01 的 SNP；③ 僅保留常染色體和 X 性染色體的 SNP。
888 例結核單一感染患者和 58 例結核乙肝合并感染患者標本經上述全基因組基因分型共獲得 691 529 個 SNP。所有樣本 SNP 檢出率均>95%；去除 298 962 個 MAF<0.01 的 SNP，去除 1 436 個不滿足 HWE 檢驗的 SNP，去除 1 159 個非常染色體和 X 性染色體的 SNP；去除 2 個性別信息不一致樣本，去除 18 個重復抽樣樣本及親緣樣本，去除 170 個藏族人群樣本，最后共有 756 例樣本，其中單一感染患者 703 例和結核乙肝共感染患者 53 例，共計 389 972 個 SNP 納入后續分析。
1.4 統計學方法
利用 PLINK 1.07 軟件對上述通過質控的樣本位點進行趨勢 χ2 檢驗，比較結核乙肝共感染患者和單一感染患者各 SNP 的等位基因頻率組間的分布是否存在統計學差異。計算等位基因 P 值，采用比值比（odds ratio，OR）和 95% 置信區間（confidence interval，CI）表示 SNP 對結核病患者發生乙肝共感染的相對風險程度。使用 Haploview 軟件生成?log10（P）的曼哈頓圖，同時進行連鎖不平衡分析。考慮到多重檢驗的影響，經 Bonferroni 校正后，以目前公認的 P<5×10?8作為本研究的顯著性閾值。
2 結果
2.1 GWAS 確定了 10 個易感位點及相關的基因
經質控后共有 703 例單一感染患者和 53 例共感染患者的 389 972 個 SNP 納入關聯分析。使用 Haploview 軟件生成曼哈頓圖，P 值以?log10（P） 表示（圖 1）。共篩選出可能與共感染相關的 10 個 P<1×10?6 的 SNP（表 1），其中 8p23.1 染色體上的 rs118122819（P=2.923×10?12，OR=7.933）是唯一達到顯著性閾值的 SNP。我們查詢了這些 SNP 相關基因的表觀遺傳學注釋和相關報道以探究它們可能參與的功能。
圖1
GWAS 的曼哈頓圖
表1
P 值最小的 10 個 SNP 的相關基因及位置
2.2 兩個基因座的連鎖不平衡分析
雖然唯一通過顯著性閾值的 SNP rs118122819（P=2.923×10-12）的基因 LOC105379224 是一種非編碼 RNA 基因，且其功能尚不清楚，但我們在曼哈頓圖中觀察到染色體 8p23 附近有幾個位置相近的 SNP，其中 rs4840365［P=8.41×10?6，OR=4.134，95%CI（2.11，8.11）］位于惡性纖維組織細胞瘤擴增序列 1（malignant fibrous histiocytoma amplified sequence 1，MFHAS1）基因區域。我們利用 Haploview 軟件對這兩個 SNP 進行連鎖不平衡分析，結果顯示上述兩個 SNP 位于一個強連鎖不平衡（D’=0.88，r2=0.76）區塊中。見圖 2。
圖2
rs118122819 與 rs4840365 的連鎖不平衡分析圖
3 討論
結核病是一種由結核分枝桿菌引起的傳染病，迄今為止，肺結核仍然是單一致病菌引發疾病中致死率最高的疾病[12]。而在我國，在肺結核基礎上合并乙肝感染的患者也為數不少。病毒對肝臟的損害妨礙抗結核治療，而抗結核藥物易引起藥物性肝損傷，進而加重肝臟損害，甚至造成肝功能衰竭。因此臨床上針對肺結核合并乙肝的治療存在巨大困難。如果對于容易發生乙肝共感染的結核患者早期進行更密切的監測和治療，就能為病情的有效控制提供條件。
本研究通過對 756 例漢族人群標本的 389 972 個SNP進行全基因組基因分型和關聯分析，共篩選出10個與共感染相關的 SNP。這些 SNP 大多位于編碼區，部分位于非編碼區。其中 rs118122819 是與共感染最顯著相關的位點，定位于 LOC105379224，是一種 RNA 基因，隸屬于非編碼 RNA 類；雖然非編碼 RNA 沒有編碼蛋白質的功能，但它們并非毫無作用，近年來大量研究表明，它們中的許多成員（其中包括長鏈非編碼 RNA、微 RNA、環狀 RNA 等）廣泛參與各種重要生命活動的調控，甚至有成為疾病診斷的標志物或潛在藥物靶點的潛力。雖然目前還沒有 LOC105379224 功能的相關報道，但我們的連鎖不平衡分析發現該 SNP 與 rs4840365 存在較強的連鎖不平衡。rs4840365 位于 MFHAS1 基因區域，LOC105379224 位于 MFHAS1 的上游，MFHAS1 是蛋白質編碼基因，定位于 8p23，主要結構包括三磷酸腺苷/三磷酸鳥苷結合位點和富含亮氨酸的串聯重復序列（leucine-rich repeats，LRR）。在先天免疫感知中，識別受體對病原體相關分子模式的識別通常與 LRR 有關。為了揭示可能參與宿主-病原體先天免疫反應但尚未發現具有免疫學作用的候選 LRR 基因，Ng 等[13]通過實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測了包括 MFHAS1 在內的一部分 LRR 基因當受到 5 種致病菌感染時在人巨噬細胞中的表達譜，結果發現有其中 4 種病原體感染時，MFHAS1 在巨噬細胞中的表達增加，表現出強烈的病原體反應性；此外作者用小干擾 RNA 下調巨噬細胞中的 MFHAS1 表達，經脂多糖和聚肌胞刺激后下調的 MFHAS1 基因強烈增強了白細胞介素（interleukin，IL）-6 的產生。這也證明 MFHAS1 在炎癥反應方面潛在的免疫調節作用。但目前還沒有 MFHAS1 參與宿主防御過程的相關報道。在乙肝病毒感染過程中，巨噬細胞可被高滴度的乙肝病毒激活，主要就是通過產生腫瘤壞死因子-α 和 IL-6 等炎性細胞因子來產生針對乙肝病毒的免疫應答[14]。而 IL-6 被認為在病毒感染發生的起始階段發揮非常重要的作用，可誘導多種細胞合成和分泌各種急性期蛋白，并促進 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞增殖，分化和產生免疫球蛋白[15]。如果某種基因突變發生在 MFHAS1 基因調控區或編碼區，從而影響巨噬細胞 IL-6 的合成，可導致 IL-6 表達的個體間差異，從而影響肺結核病患者乙肝病毒感染的易感性和乙肝病毒相關疾病的進展。除了在病毒感染免疫中的作用外，巨噬細胞在結核感染的免疫反應中也發揮著重要作用。在感染期間，結核分枝桿菌特異性地感染巨噬細胞作為宿主細胞[16]。機體活化巨噬細胞的免疫功能取決于多種信號通路的調節，包括模式識別受體[17]。而 LRR 就與病原體相關分子模式的識別密切相關，因此 MFHAS1 作為 LRR 候選基因也可能參與調節機體抗結核的免疫反應，從而影響結核分枝桿菌在細胞內的存活。
其他 SNP 中， rs3797020（P=7.81×10?7，OR=3.56）位于膜相關環指蛋白 1（membrane associated ring-CH-type finger 1，MARCH1）基因區域，染色體 4q32.3 上，覆蓋 869.755 kb，是膜結合的 E3 泛素連接酶的環指結構域家族的成員，其參與多種細胞過程，參與調節主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子的表達和轉換及其他糖蛋白的表面表達。研究發現 MARCH1 介導的 MHCⅡ泛素化還可影響 MHCⅠ抗原呈遞途徑[18]。此外有報道稱 MARCH1 通過調節磷脂酰肌醇 3 激酶和/或蛋白激酶 B（phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B，PI3K-AKT）途徑可以促進肝細胞癌的進展[19]。但也有研究發現 PI3K-AKT 通路可以介導慢性乙肝患者中 IL-2 的上調，而 IL-12 作為一種典型的促炎細胞因子，其在宿主防御病原體（包括乙肝病毒）中發揮重要作用[20]。而 rs13393112（P=1.03×10?7，OR=6.91）則在 Delta 和 Notch 樣表皮生長因子相關受體（Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor，DNER）基因區域，該基因位于 2q36.3。有研究發現其在香煙煙霧誘導的慢性炎癥期間通過調節非經典 Notch 信號傳導調節巨噬細胞中 γ 干擾素的表達[21]。此外有研究發現 DNER 和上述 MARCH1 一樣均參與調節 PI3K/AKT 通路[22]。但 DNER 和 MARCH1 能否通過 PI3K/AKT 通路靶向調節 IL-12 的表達從而影響宿主對乙肝病毒的防御仍有待研究。
我們嚴格按照標準對全基因組掃描所得到的原始數據進行質控，盡管取得了初步成功，但也存在一定的局限性：雖然本研究中的所有病例和對照均為漢族人群，排除了部分人口分層的不利影響，但不能排除自然選擇、遺傳漂變等因素對結果的影響；共感染組的病例數較少，也可能會導致一些有統計學意義的 SNP 位點未被發現；此外，一些研究發現病原體遺傳背景也可能對宿主遺傳風險產生影響[23]，因此無法排除乙肝病毒基因型對結果的影響。由于這些限制，必須謹慎解釋結果并作出結論。目前我們正在收集更多樣本，并打算在更大規模的研究中調查某些有意義的 SNP 和基因型，以驗證這些關聯，同時還必須進一步研究風險等位基因和相關基因功能。
總之，通過 GWAS，本研究發現了與肺結核患者發生乙肝共感染相關的一些潛在易感位點，為確定遺傳易感因素和了解發病機制提供了新的見解，也為疾病的個性化診斷和治療提供了與基因相關的信息。
乙型肝炎（乙肝）病毒感染和結核感染是兩個全球性公共衛生問題。據調查，目前我國乙肝病毒表面抗原陽性患者達 7.8%[1]。2010 年全國第五次結核病流行病學調查顯示，15 歲及以上人群活動性肺結核的患病率高達 0.459%[2]。來自我國不同地區的調查顯示，肺結核感染者的乙肝病毒表面抗原流行率在 7.3%～13.7%，提示我國結核乙肝合并感染有很高的流行背景[3]。結核和乙肝病毒感染的臨床結果在個體間差異很大[4-5]，而雙胞胎研究揭示宿主遺傳因素在其中發揮重要作用[6-7]。如果機體針對乙肝病毒和結核分枝桿菌感染的免疫調節存在某些共有途徑，當宿主遺傳因素造成這些共有途徑的免疫失調時，則會造成某些結核患者更容易發生乙肝共感染。對結核病患者發生乙肝共感染發病機制的相關遺傳因素進行分析，有助于早期發現發生共感染風險較高的易感個體，從而早期進行更密切的醫學監測，或是發現新的潛在治療靶點，為結核乙肝共感染的有效防治提供思路。近年來已有大量研究通過全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）成功鑒定出與結核和乙肝感染相關的基因和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），如 ESRRB[8]和 STAT4 等[9]。但目前針對結核乙肝共感染的研究主要圍繞抗結核藥物誘發藥物性肝損傷和治療，對于結核病患者發生乙肝共感染發病機制的相關遺傳因素的研究卻罕見報道。因此本研究從宿主遺傳學的角度，利用 GWAS 探究結核患者發生乙肝共感染的關鍵位點和相關通路。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
回顧性收集 2013 年 3 月—2018 年 3 月于四川大學華西醫院就診的初治肺結核患者 946 例，其中結核單一感染 888 例，結核乙肝合并感染 58 例。納入標準：① 乙肝診治符合 2015 年《慢性乙型肝炎防治指南》新標準[10]，肺結核診治符合《WS 288－2017 肺結核診斷》新標準[11]，無其他臟器嚴重疾病；② 首次發病；③ 既往未進行抗乙肝病毒和抗結核桿菌治療。排除標準：① 其他類型病毒性肝炎；② 肝吸蟲等寄生蟲感染；③ 其他中樞神經系統疾病以及自身免疫系統疾病；④ 惡性腫瘤；⑤ 曾接受過甾體激素類或干擾素等藥物治療。本研究經四川大學華西醫院生物醫學倫理委員會批準［審批號：2019 年審（151 號）］，所有研究對象均簽署知情同意書。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
QIAampDNA 試劑盒（德國 QIAGEN 公司）；無水乙醇（成都市科隆化學品有限公司）；蛋白酶 K（德國 Roche 公司）；Human Omni Express 基因分型試劑盒（美國 Illumina 公司）；離心管、槍頭（美國 Axygen Biosciences 公司）。
1.2.2 主要儀器
高速臺式離心機、各種量程移液器（德國 Eppendorf 公司）；?80℃ 超低溫冰箱（德國 Heraeus 公司）；Milli-Q Integral 10 水純化系統（美國 Millipore 公司）；微量分光光度計（美國 GE 公司）；Human Omni Express 基因分型平臺（美國 Illumina 公司）；熱板（美國 Thermo 公司）。
1.3 方法
1.3.1 基因組 DNA 提取
采用 QIAampDNA 試劑盒提取樣本 DNA。采集上述研究對象的外周靜脈血標本 5 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝。將 200 μL 全血加入 1.5 mL 離心管中，加入 20 μL 的蛋白酶 K 和 200 μL Buffer AL 后立即振蕩混勻，于 56℃ 水浴 30 min 后向離心管中加入 200 μL 無水乙醇，振蕩混勻，瞬時離心。將上一步所得濾液和絮狀沉淀加入 QIAamp 吸附柱（吸附柱放入收集管），10 000 r/min 離心 1 min（離心半徑 7 cm），棄廢液。更換收集管，向吸附柱中加入 500 μL Buffer AW1，10 000 r/min 離心 1 min（離心半徑 7 cm），棄廢液；再次更換收集管，加入 500 μL Buffer AW 2，14 000 r/min 離心 5 min（離心半徑 7 cm），棄廢液。將吸附柱移至新的離心管中，加入 200 μL 的 Buffer AE，37℃ 放置 30 min 后 8 000 r/min 離心 1 min（離心半徑 7 cm），所得濾液即為提取的 DNA。采用分光光度計檢測 DNA 純度和濃度，DNA 濃度高于 50 ng/μL 的樣本加入適量 Buffer AE 稀釋至工作濃度（50 ng/μL），未能滿足用于 Illumina 基因分型的 50 ng/μL 最小 DNA 濃度的樣品被去除。提取的 DNA 放置于?80℃ 保存備用。
1.3.2 基因分型及質量控制（質控）
使用 Illumina Human Omni Express 基因芯片分型實驗平臺對患者的 DNA 進行全基因組基因分型。具體步驟根據 Illumina Infinium HD assay protocol guide 手冊執行。然后利用 PLINK 軟件對全基因組掃描所得到的原始數據進行質控。樣本質控：① 去除檢出率小于 95% 的樣本；② 通過親緣關系檢測去除重復抽樣樣本及親緣樣本；③ 去除非漢族人群樣本；④ 去除性別不一致的樣本；⑤ 計算雜合率，去除超過 3 個標準偏差的樣本。SNP 質控：① 去除哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）顯著偏差（P≤1×10?4）的 SNP；② 去除最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）<0.01 的 SNP；③ 僅保留常染色體和 X 性染色體的 SNP。
888 例結核單一感染患者和 58 例結核乙肝合并感染患者標本經上述全基因組基因分型共獲得 691 529 個 SNP。所有樣本 SNP 檢出率均>95%；去除 298 962 個 MAF<0.01 的 SNP，去除 1 436 個不滿足 HWE 檢驗的 SNP，去除 1 159 個非常染色體和 X 性染色體的 SNP；去除 2 個性別信息不一致樣本，去除 18 個重復抽樣樣本及親緣樣本，去除 170 個藏族人群樣本，最后共有 756 例樣本，其中單一感染患者 703 例和結核乙肝共感染患者 53 例，共計 389 972 個 SNP 納入后續分析。
1.4 統計學方法
利用 PLINK 1.07 軟件對上述通過質控的樣本位點進行趨勢 χ2 檢驗，比較結核乙肝共感染患者和單一感染患者各 SNP 的等位基因頻率組間的分布是否存在統計學差異。計算等位基因 P 值，采用比值比（odds ratio，OR）和 95% 置信區間（confidence interval，CI）表示 SNP 對結核病患者發生乙肝共感染的相對風險程度。使用 Haploview 軟件生成?log10（P）的曼哈頓圖，同時進行連鎖不平衡分析。考慮到多重檢驗的影響，經 Bonferroni 校正后，以目前公認的 P<5×10?8作為本研究的顯著性閾值。
2 結果
2.1 GWAS 確定了 10 個易感位點及相關的基因
經質控后共有 703 例單一感染患者和 53 例共感染患者的 389 972 個 SNP 納入關聯分析。使用 Haploview 軟件生成曼哈頓圖，P 值以?log10（P） 表示（圖 1）。共篩選出可能與共感染相關的 10 個 P<1×10?6 的 SNP（表 1），其中 8p23.1 染色體上的 rs118122819（P=2.923×10?12，OR=7.933）是唯一達到顯著性閾值的 SNP。我們查詢了這些 SNP 相關基因的表觀遺傳學注釋和相關報道以探究它們可能參與的功能。
圖1
GWAS 的曼哈頓圖
表1
P 值最小的 10 個 SNP 的相關基因及位置
2.2 兩個基因座的連鎖不平衡分析
雖然唯一通過顯著性閾值的 SNP rs118122819（P=2.923×10-12）的基因 LOC105379224 是一種非編碼 RNA 基因，且其功能尚不清楚，但我們在曼哈頓圖中觀察到染色體 8p23 附近有幾個位置相近的 SNP，其中 rs4840365［P=8.41×10?6，OR=4.134，95%CI（2.11，8.11）］位于惡性纖維組織細胞瘤擴增序列 1（malignant fibrous histiocytoma amplified sequence 1，MFHAS1）基因區域。我們利用 Haploview 軟件對這兩個 SNP 進行連鎖不平衡分析，結果顯示上述兩個 SNP 位于一個強連鎖不平衡（D’=0.88，r2=0.76）區塊中。見圖 2。
圖2
rs118122819 與 rs4840365 的連鎖不平衡分析圖
3 討論
結核病是一種由結核分枝桿菌引起的傳染病，迄今為止，肺結核仍然是單一致病菌引發疾病中致死率最高的疾病[12]。而在我國，在肺結核基礎上合并乙肝感染的患者也為數不少。病毒對肝臟的損害妨礙抗結核治療，而抗結核藥物易引起藥物性肝損傷，進而加重肝臟損害，甚至造成肝功能衰竭。因此臨床上針對肺結核合并乙肝的治療存在巨大困難。如果對于容易發生乙肝共感染的結核患者早期進行更密切的監測和治療，就能為病情的有效控制提供條件。
本研究通過對 756 例漢族人群標本的 389 972 個SNP進行全基因組基因分型和關聯分析，共篩選出10個與共感染相關的 SNP。這些 SNP 大多位于編碼區，部分位于非編碼區。其中 rs118122819 是與共感染最顯著相關的位點，定位于 LOC105379224，是一種 RNA 基因，隸屬于非編碼 RNA 類；雖然非編碼 RNA 沒有編碼蛋白質的功能，但它們并非毫無作用，近年來大量研究表明，它們中的許多成員（其中包括長鏈非編碼 RNA、微 RNA、環狀 RNA 等）廣泛參與各種重要生命活動的調控，甚至有成為疾病診斷的標志物或潛在藥物靶點的潛力。雖然目前還沒有 LOC105379224 功能的相關報道，但我們的連鎖不平衡分析發現該 SNP 與 rs4840365 存在較強的連鎖不平衡。rs4840365 位于 MFHAS1 基因區域，LOC105379224 位于 MFHAS1 的上游，MFHAS1 是蛋白質編碼基因，定位于 8p23，主要結構包括三磷酸腺苷/三磷酸鳥苷結合位點和富含亮氨酸的串聯重復序列（leucine-rich repeats，LRR）。在先天免疫感知中，識別受體對病原體相關分子模式的識別通常與 LRR 有關。為了揭示可能參與宿主-病原體先天免疫反應但尚未發現具有免疫學作用的候選 LRR 基因，Ng 等[13]通過實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測了包括 MFHAS1 在內的一部分 LRR 基因當受到 5 種致病菌感染時在人巨噬細胞中的表達譜，結果發現有其中 4 種病原體感染時，MFHAS1 在巨噬細胞中的表達增加，表現出強烈的病原體反應性；此外作者用小干擾 RNA 下調巨噬細胞中的 MFHAS1 表達，經脂多糖和聚肌胞刺激后下調的 MFHAS1 基因強烈增強了白細胞介素（interleukin，IL）-6 的產生。這也證明 MFHAS1 在炎癥反應方面潛在的免疫調節作用。但目前還沒有 MFHAS1 參與宿主防御過程的相關報道。在乙肝病毒感染過程中，巨噬細胞可被高滴度的乙肝病毒激活，主要就是通過產生腫瘤壞死因子-α 和 IL-6 等炎性細胞因子來產生針對乙肝病毒的免疫應答[14]。而 IL-6 被認為在病毒感染發生的起始階段發揮非常重要的作用，可誘導多種細胞合成和分泌各種急性期蛋白，并促進 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞增殖，分化和產生免疫球蛋白[15]。如果某種基因突變發生在 MFHAS1 基因調控區或編碼區，從而影響巨噬細胞 IL-6 的合成，可導致 IL-6 表達的個體間差異，從而影響肺結核病患者乙肝病毒感染的易感性和乙肝病毒相關疾病的進展。除了在病毒感染免疫中的作用外，巨噬細胞在結核感染的免疫反應中也發揮著重要作用。在感染期間，結核分枝桿菌特異性地感染巨噬細胞作為宿主細胞[16]。機體活化巨噬細胞的免疫功能取決于多種信號通路的調節，包括模式識別受體[17]。而 LRR 就與病原體相關分子模式的識別密切相關，因此 MFHAS1 作為 LRR 候選基因也可能參與調節機體抗結核的免疫反應，從而影響結核分枝桿菌在細胞內的存活。
其他 SNP 中， rs3797020（P=7.81×10?7，OR=3.56）位于膜相關環指蛋白 1（membrane associated ring-CH-type finger 1，MARCH1）基因區域，染色體 4q32.3 上，覆蓋 869.755 kb，是膜結合的 E3 泛素連接酶的環指結構域家族的成員，其參與多種細胞過程，參與調節主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子的表達和轉換及其他糖蛋白的表面表達。研究發現 MARCH1 介導的 MHCⅡ泛素化還可影響 MHCⅠ抗原呈遞途徑[18]。此外有報道稱 MARCH1 通過調節磷脂酰肌醇 3 激酶和/或蛋白激酶 B（phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B，PI3K-AKT）途徑可以促進肝細胞癌的進展[19]。但也有研究發現 PI3K-AKT 通路可以介導慢性乙肝患者中 IL-2 的上調，而 IL-12 作為一種典型的促炎細胞因子，其在宿主防御病原體（包括乙肝病毒）中發揮重要作用[20]。而 rs13393112（P=1.03×10?7，OR=6.91）則在 Delta 和 Notch 樣表皮生長因子相關受體（Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor，DNER）基因區域，該基因位于 2q36.3。有研究發現其在香煙煙霧誘導的慢性炎癥期間通過調節非經典 Notch 信號傳導調節巨噬細胞中 γ 干擾素的表達[21]。此外有研究發現 DNER 和上述 MARCH1 一樣均參與調節 PI3K/AKT 通路[22]。但 DNER 和 MARCH1 能否通過 PI3K/AKT 通路靶向調節 IL-12 的表達從而影響宿主對乙肝病毒的防御仍有待研究。
我們嚴格按照標準對全基因組掃描所得到的原始數據進行質控，盡管取得了初步成功，但也存在一定的局限性：雖然本研究中的所有病例和對照均為漢族人群，排除了部分人口分層的不利影響，但不能排除自然選擇、遺傳漂變等因素對結果的影響；共感染組的病例數較少，也可能會導致一些有統計學意義的 SNP 位點未被發現；此外，一些研究發現病原體遺傳背景也可能對宿主遺傳風險產生影響[23]，因此無法排除乙肝病毒基因型對結果的影響。由于這些限制，必須謹慎解釋結果并作出結論。目前我們正在收集更多樣本，并打算在更大規模的研究中調查某些有意義的 SNP 和基因型，以驗證這些關聯，同時還必須進一步研究風險等位基因和相關基因功能。
總之，通過 GWAS，本研究發現了與肺結核患者發生乙肝共感染相關的一些潛在易感位點，為確定遺傳易感因素和了解發病機制提供了新的見解，也為疾病的個性化診斷和治療提供了與基因相關的信息。
