引用本文： 李偉, 張咪娟, 王琰, 王濤, 馬敏江, 田春娥, 楊謙, 陳瑞利. 血小板活化因子和血管內皮活性標志物與腔隙性腦梗死的關系. 華西醫學, 2019, 34(10): 1143-1147. doi: 10.7507/1002-0179.201908056 復制
腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）是腦部深穿支動脈的缺血性梗死，其梗死灶直徑為 2～20 mm，約占腦梗死的 25%[1-2]。近年來，國外研究表明內皮功能障礙和血小板活化表達增加與 LI 有一定關系[3-4]。關于血小板活化與 LI 關系的研究較少且結論不一致。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 屬于整合素家族受體，激活血小板后，通過 G 蛋白偶聯信號途徑使血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體激活，受體結合位點暴露后，與血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、纖維蛋白原等結合，促使血小板聚集，導致血小板進一步活化[5]。P 選擇素是血小板活化后釋放的重要物質，可反映血小板活化程度，是血管損傷和血小板活化的標志物[6]。因此，我們可分析血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體和 P 選擇素的變化來了解血小板的活化狀況。腦小血管內皮功能障礙可能會導致腦深部小的梗死，原因有血管完整性破壞、腦血流的減少、腦血流自動調節功能障礙或血細胞某些成分的改變[7]。故本研究檢測入組時健康對照組和 LI 事件后 1 個月時及 3 個月時患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體、P 選擇素、vWF、同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）和高敏 C 反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hsCRP）濃度，探討血小板活化和血管內皮功能與 LI 的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
經陜西省人民醫院醫學倫理委員會審批通過，前瞻性納入 2018 年 3 月—2019 年 2 月在陜西省人民醫院神經內科住院治療行顱腦 MRI 檢查確診為 LI 的患者 100 例（LI 組），其中男 65 例，女 35 例。并收集同一時期在該院體檢中心進行體檢，與患者年齡（±5 歲）、性別相匹配且顱腦 MRI 檢查正常的健康者 100 例作為對照組。
LI 組患者納入標準：① 年齡≥18 歲；②發病 1 個月以內入院；③ LI 在 MRI 檢查上的診斷標準如下：表現為圓或橢圓形，直徑 3～15 mm，在 MRI T1 加權像呈邊界清楚的低信號灶，T2 加權像高信號，液體衰減反轉恢復序列高信號，擴散加權成像上呈高信號[8]；④ 患者在參加研究前簽署知情同意書。
對照組納入標準：① 年齡≥18 歲；② 同一時期在該院體檢中心，與患者年齡（±5 歲）、性別相匹配且顱腦 MRI 檢查正常者；③ 簽署知情同意書。
兩組排除標準：① 心源性栓塞、動脈夾層或動脈粥樣硬化導致的腦梗死；② 既往有炎癥性疾病、甲狀腺疾病、自身免疫疾病、血液疾病、惡性腫瘤病史或近期有感染等疾病；③ 既往有腦梗死病史；④ 影像學檢查發現蛛網膜下腔出血、腦出血等出血性疾病；⑤ 嚴重神經系統疾病。
1.2 資料收集
收集所有入組者的資料，包括年齡、性別、既往史（高血壓、糖尿病、冠心病、吸煙及飲酒史）、實驗室檢查、卒中病情嚴重程度［由經統一培訓的神經內科醫師采用美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評價患者發病 1 個月內和 3 個月時的神經功能缺損程度］、發病至入院時間、頭顱 MRI 特征（由 2 位具有高級職稱的神經科醫師獨立分析患者頭顱 MRI，如有分歧，由第 3 位神經科醫生協商解決）和治療藥物等。
1.3 血液采集
收集 LI 患者發病后 1 個月及 3 個月和對照組入組時的血標本，采集血液標本前需完全禁食 8 h，并于次日清晨由專業的神經內科護士采集肘部靜脈血標本，血標本收集并儲存在–80℃ 的冰箱內，2 h 內送至實驗室。
1.3.1 血小板活化因子
采用同軸圓桶剪切儀檢測剪切誘導血小板聚集，剪切率為 4 000 s?1。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體和 P 選擇素的測定使用 FACS Vantage 流式細胞儀進行檢測（間接熒光免疫法），試劑盒用美國 B-D 公司提供，原理是熒光標記血小板產生的平均熒光強度與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體、P 選擇素之間位點數呈正比，單位為%。
1.3.2 血管內皮活性標志物
vWF：采用酶聯免疫法檢測，試劑盒由福建太陽生物技術公司生產，單位為 ng/mL。hsCRP：采用顆粒增強膠乳免疫比濁法檢測，選擇申能德賽公司生產的 hsCRP 試劑，單位為 mg/L。HCY：采用循環酶法檢測，試劑盒來自北京九強生物技術有限公司，單位為 mmol/L。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。分類變量使用例數（百分比）表示，組間比較采用 χ2 檢驗；用均數±標準差表示符合正態分布的連續性變量，組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗；用中位數（四分位數間距）表示不符合正態分布的連續變量。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納入研究對象的主要特點
LI 組和對照組年齡、性別匹配，在高血壓、糖尿病和冠心病病史以及吸煙史和飲酒史上差異無統計學意義（P>0.05）。LI 組血脂異常發生率高于對照組（P<0.001）。所有 LI 患者入院后均采用抗血小板藥物治療，81 例患者采用阿司匹林（100 mg/d）治療，其余 19 例患者采用氯吡格雷（75 mg/d）治療。LI 發生后 1 個月左右時抽取血液標本（抽血時間為 LI 發生后 26～32 d，中位時間 30 d）。見表1。
表1
納入研究對象的主要特點（n=100）
2.2 所有LI組患者與對照組各項指標比較
LI 組患者和對照組血小板聚集的差異無統計學意義（P=0.061）。血小板活化因子在 LI 組和對照組之間差異無統計學意義（P>0.05）。而 LI 組內皮細胞活化標志物均較對照組明顯增加（P<0.001）。見表2。
表2
所有LI組患者與對照組各項指標比較（n=100，
±s）
2.3 發病1個月和3個月時LI組患者各項指標比較
3 個月時有 6 例患者失訪，我們對余下的 94 例患者再次采集血液標本，采集血液標本的時間為發病后 83～97 d，中位時間 91 d。與發病 1 個月時的 100 例患者比較，發病 3 個月時 94 例患者 vWF 和 hsCRP 水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；而發病 3 個月時 HCY 和血小板活化因子較發病 1 個月時差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。
表3
發病1個月時和3個月時LI組患者各項指標比較（
±s）
3 討論
本研究探索了血小板活化因子和血管內皮活性標志物與 LI 的關系，排除年齡、性別、高血壓、糖尿病和冠心病對研究的影響。結果顯示，與對照組相比，LI 組患者血小板活化參數差異無統計學意義，而內皮功能障礙的參數差異有統計學意義，提示內皮損傷可能是 LI 的病理學機制之一。這與國外 Lavallée 等[4]和 Oksala 等[9]的研究結果基本一致。最近的一項研究納入 2 型糖尿病合并微血管病變的患者和健康對照組，結果顯示患者 vWF 表達水平高于對照組［（196.59±80.32）% vs.（148.06±90.34）%，P=0.04］；患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體表達水平明顯高于對照組［（3.91±2.91）% vs.（2.79±2.51）%，P=0.002］[10]，表明了 vWF 和血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體的表達參與血管病變的發生和發展。國內許海霞等[11]研究發現，腦小血管病患者血小板活性因子表達水平較對照組高，提示血小板功能活躍和內皮細胞損傷是導致腦小血管病的病理學機制之一；但將腦小血管病根據影像學分組后發現，分級程度高的患者血小板活性因子表達水平不一定高，兩者無明顯正相關。其與本研究觀察的血小板活化因子不同，可能是兩個研究結果差異的原因。
本研究發現 LI 組患者血小板活化參數在 1 個月和 3 個月時均無明顯改變。而在急性腦卒中的研究中，血小板活性因子不能預測患者長期生存[12]。因此我們認為慢性血小板活化可能在 LI 的發病機制中不發揮核心作用。
血管內皮活性因子 vWF、hsCPR 及 HCY 表達水平在 LI 組患者中升高，而 3 個月時有所下降，但仍高于正常，表明內皮功能的障礙可能與 LI 相關。動物實驗發現，C反應蛋白 水平升高與內皮功能障礙有關，主要機制為 C 反應蛋白抑制血管內皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），而一氧化氮介導的血管舒張需要 eNOS 的參與，故研究者認為 CRP 可能是加重內皮功能障礙的關鍵分子[13]。一項大型研究發現，對于 LI 患者，hsCRP 水平可預測卒中復發的風險[14]。Woywodt 等[15]發現，與動脈粥樣硬化型、心源型腦梗死相似，LI 患者循環內皮細胞增加，推測循環內皮細胞是腦卒中內皮損傷和/或修復的標志物。Fan 等[16]研究發現血清 HCY 可能是急性 LI 患者的獨立危險因素，而不是早期預后的預測因素結果。本研究中血清 HCY 在 LI 患者中升高，但在 3 個月時基本恢復正常。一項對 121 例患者進行 TOAST 分型的試驗發現，LI 患者 HCY、hsCRP、白細胞介素 6、基質金屬蛋白酶 9 水平均升高（P<0.05），提示炎癥反應在卒中發病機制中的重要作用[17]。一項 meta 研究納入 42 篇文獻，包括 4 186 例腦梗死，其中有 2 196 例 LI 患者和 2 500 例非卒中對照者，發現了 LI 患者內皮功能障礙標志物（HCY、vWF）明顯高于非 LI 者；與其他腦梗死亞型相比，HCY 水平在 LI 中沒有差異，而 vWF 在 LI 中顯著降低；炎性標志物（C 反應蛋白）在 LI 患者與非 LI 相比更高，而與其他腦梗死亞型相比，則沒有差異[18]。該研究表明 LI 患者這些因子升高可能反映卒中的發生過程，而不是 LI 特有的全身性炎癥或內皮功能障礙，故炎癥過程和內皮功能障礙可能在 LI 發展中有一定的作用，與本研究的結果一致。
綜上，與對照組相比，慢性血小板活化可能在 LI 病理生理學中不發揮核心作用，內皮功能障礙可能是 LI 的病理機制之一。下一步還需增加檢測的時間點和延長研究的時間跨度，有必要采用多中心、不同種族的合作研究模式，以提供更可靠的 LI 病理學證據。
腔隙性腦梗死（lacunar infarction，LI）是腦部深穿支動脈的缺血性梗死，其梗死灶直徑為 2～20 mm，約占腦梗死的 25%[1-2]。近年來，國外研究表明內皮功能障礙和血小板活化表達增加與 LI 有一定關系[3-4]。關于血小板活化與 LI 關系的研究較少且結論不一致。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 屬于整合素家族受體，激活血小板后，通過 G 蛋白偶聯信號途徑使血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體激活，受體結合位點暴露后，與血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、纖維蛋白原等結合，促使血小板聚集，導致血小板進一步活化[5]。P 選擇素是血小板活化后釋放的重要物質，可反映血小板活化程度，是血管損傷和血小板活化的標志物[6]。因此，我們可分析血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體和 P 選擇素的變化來了解血小板的活化狀況。腦小血管內皮功能障礙可能會導致腦深部小的梗死，原因有血管完整性破壞、腦血流的減少、腦血流自動調節功能障礙或血細胞某些成分的改變[7]。故本研究檢測入組時健康對照組和 LI 事件后 1 個月時及 3 個月時患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體、P 選擇素、vWF、同型半胱氨酸（homocysteine，HCY）和高敏 C 反應蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hsCRP）濃度，探討血小板活化和血管內皮功能與 LI 的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
經陜西省人民醫院醫學倫理委員會審批通過，前瞻性納入 2018 年 3 月—2019 年 2 月在陜西省人民醫院神經內科住院治療行顱腦 MRI 檢查確診為 LI 的患者 100 例（LI 組），其中男 65 例，女 35 例。并收集同一時期在該院體檢中心進行體檢，與患者年齡（±5 歲）、性別相匹配且顱腦 MRI 檢查正常的健康者 100 例作為對照組。
LI 組患者納入標準：① 年齡≥18 歲；②發病 1 個月以內入院；③ LI 在 MRI 檢查上的診斷標準如下：表現為圓或橢圓形，直徑 3～15 mm，在 MRI T1 加權像呈邊界清楚的低信號灶，T2 加權像高信號，液體衰減反轉恢復序列高信號，擴散加權成像上呈高信號[8]；④ 患者在參加研究前簽署知情同意書。
對照組納入標準：① 年齡≥18 歲；② 同一時期在該院體檢中心，與患者年齡（±5 歲）、性別相匹配且顱腦 MRI 檢查正常者；③ 簽署知情同意書。
兩組排除標準：① 心源性栓塞、動脈夾層或動脈粥樣硬化導致的腦梗死；② 既往有炎癥性疾病、甲狀腺疾病、自身免疫疾病、血液疾病、惡性腫瘤病史或近期有感染等疾病；③ 既往有腦梗死病史；④ 影像學檢查發現蛛網膜下腔出血、腦出血等出血性疾病；⑤ 嚴重神經系統疾病。
1.2 資料收集
收集所有入組者的資料，包括年齡、性別、既往史（高血壓、糖尿病、冠心病、吸煙及飲酒史）、實驗室檢查、卒中病情嚴重程度［由經統一培訓的神經內科醫師采用美國國立衛生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評價患者發病 1 個月內和 3 個月時的神經功能缺損程度］、發病至入院時間、頭顱 MRI 特征（由 2 位具有高級職稱的神經科醫師獨立分析患者頭顱 MRI，如有分歧，由第 3 位神經科醫生協商解決）和治療藥物等。
1.3 血液采集
收集 LI 患者發病后 1 個月及 3 個月和對照組入組時的血標本，采集血液標本前需完全禁食 8 h，并于次日清晨由專業的神經內科護士采集肘部靜脈血標本，血標本收集并儲存在–80℃ 的冰箱內，2 h 內送至實驗室。
1.3.1 血小板活化因子
采用同軸圓桶剪切儀檢測剪切誘導血小板聚集，剪切率為 4 000 s?1。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體和 P 選擇素的測定使用 FACS Vantage 流式細胞儀進行檢測（間接熒光免疫法），試劑盒用美國 B-D 公司提供，原理是熒光標記血小板產生的平均熒光強度與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體、P 選擇素之間位點數呈正比，單位為%。
1.3.2 血管內皮活性標志物
vWF：采用酶聯免疫法檢測，試劑盒由福建太陽生物技術公司生產，單位為 ng/mL。hsCRP：采用顆粒增強膠乳免疫比濁法檢測，選擇申能德賽公司生產的 hsCRP 試劑，單位為 mg/L。HCY：采用循環酶法檢測，試劑盒來自北京九強生物技術有限公司，單位為 mmol/L。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。分類變量使用例數（百分比）表示，組間比較采用 χ2 檢驗；用均數±標準差表示符合正態分布的連續性變量，組間比較采用兩獨立樣本 t 檢驗；用中位數（四分位數間距）表示不符合正態分布的連續變量。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納入研究對象的主要特點
LI 組和對照組年齡、性別匹配，在高血壓、糖尿病和冠心病病史以及吸煙史和飲酒史上差異無統計學意義（P>0.05）。LI 組血脂異常發生率高于對照組（P<0.001）。所有 LI 患者入院后均采用抗血小板藥物治療，81 例患者采用阿司匹林（100 mg/d）治療，其余 19 例患者采用氯吡格雷（75 mg/d）治療。LI 發生后 1 個月左右時抽取血液標本（抽血時間為 LI 發生后 26～32 d，中位時間 30 d）。見表1。
表1
納入研究對象的主要特點（n=100）
2.2 所有LI組患者與對照組各項指標比較
LI 組患者和對照組血小板聚集的差異無統計學意義（P=0.061）。血小板活化因子在 LI 組和對照組之間差異無統計學意義（P>0.05）。而 LI 組內皮細胞活化標志物均較對照組明顯增加（P<0.001）。見表2。
表2
所有LI組患者與對照組各項指標比較（n=100，±s）
2.3 發病1個月和3個月時LI組患者各項指標比較
3 個月時有 6 例患者失訪，我們對余下的 94 例患者再次采集血液標本，采集血液標本的時間為發病后 83～97 d，中位時間 91 d。與發病 1 個月時的 100 例患者比較，發病 3 個月時 94 例患者 vWF 和 hsCRP 水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；而發病 3 個月時 HCY 和血小板活化因子較發病 1 個月時差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。
表3
發病1個月時和3個月時LI組患者各項指標比較（±s）
3 討論
本研究探索了血小板活化因子和血管內皮活性標志物與 LI 的關系，排除年齡、性別、高血壓、糖尿病和冠心病對研究的影響。結果顯示，與對照組相比，LI 組患者血小板活化參數差異無統計學意義，而內皮功能障礙的參數差異有統計學意義，提示內皮損傷可能是 LI 的病理學機制之一。這與國外 Lavallée 等[4]和 Oksala 等[9]的研究結果基本一致。最近的一項研究納入 2 型糖尿病合并微血管病變的患者和健康對照組，結果顯示患者 vWF 表達水平高于對照組［（196.59±80.32）% vs.（148.06±90.34）%，P=0.04］；患者血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體表達水平明顯高于對照組［（3.91±2.91）% vs.（2.79±2.51）%，P=0.002］[10]，表明了 vWF 和血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 受體的表達參與血管病變的發生和發展。國內許海霞等[11]研究發現，腦小血管病患者血小板活性因子表達水平較對照組高，提示血小板功能活躍和內皮細胞損傷是導致腦小血管病的病理學機制之一；但將腦小血管病根據影像學分組后發現，分級程度高的患者血小板活性因子表達水平不一定高，兩者無明顯正相關。其與本研究觀察的血小板活化因子不同，可能是兩個研究結果差異的原因。
本研究發現 LI 組患者血小板活化參數在 1 個月和 3 個月時均無明顯改變。而在急性腦卒中的研究中，血小板活性因子不能預測患者長期生存[12]。因此我們認為慢性血小板活化可能在 LI 的發病機制中不發揮核心作用。
血管內皮活性因子 vWF、hsCPR 及 HCY 表達水平在 LI 組患者中升高，而 3 個月時有所下降，但仍高于正常，表明內皮功能的障礙可能與 LI 相關。動物實驗發現，C反應蛋白 水平升高與內皮功能障礙有關，主要機制為 C 反應蛋白抑制血管內皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），而一氧化氮介導的血管舒張需要 eNOS 的參與，故研究者認為 CRP 可能是加重內皮功能障礙的關鍵分子[13]。一項大型研究發現，對于 LI 患者，hsCRP 水平可預測卒中復發的風險[14]。Woywodt 等[15]發現，與動脈粥樣硬化型、心源型腦梗死相似，LI 患者循環內皮細胞增加，推測循環內皮細胞是腦卒中內皮損傷和/或修復的標志物。Fan 等[16]研究發現血清 HCY 可能是急性 LI 患者的獨立危險因素，而不是早期預后的預測因素結果。本研究中血清 HCY 在 LI 患者中升高，但在 3 個月時基本恢復正常。一項對 121 例患者進行 TOAST 分型的試驗發現，LI 患者 HCY、hsCRP、白細胞介素 6、基質金屬蛋白酶 9 水平均升高（P<0.05），提示炎癥反應在卒中發病機制中的重要作用[17]。一項 meta 研究納入 42 篇文獻，包括 4 186 例腦梗死，其中有 2 196 例 LI 患者和 2 500 例非卒中對照者，發現了 LI 患者內皮功能障礙標志物（HCY、vWF）明顯高于非 LI 者；與其他腦梗死亞型相比，HCY 水平在 LI 中沒有差異，而 vWF 在 LI 中顯著降低；炎性標志物（C 反應蛋白）在 LI 患者與非 LI 相比更高，而與其他腦梗死亞型相比，則沒有差異[18]。該研究表明 LI 患者這些因子升高可能反映卒中的發生過程，而不是 LI 特有的全身性炎癥或內皮功能障礙，故炎癥過程和內皮功能障礙可能在 LI 發展中有一定的作用，與本研究的結果一致。
綜上，與對照組相比，慢性血小板活化可能在 LI 病理生理學中不發揮核心作用，內皮功能障礙可能是 LI 的病理機制之一。下一步還需增加檢測的時間點和延長研究的時間跨度，有必要采用多中心、不同種族的合作研究模式，以提供更可靠的 LI 病理學證據。
