干細胞移植是治療血栓閉塞性脈管炎的主要方法之一。近年來，干細胞移植在治療機制方面的研究有所進展，一批專門針對血栓閉塞性脈管炎的干細胞臨床試驗結果相繼發表，部分新的干細胞種類逐漸運用于臨床，適應證的把控和移植方法逐漸成熟，其安全性并無太大爭議。此外，有研究表明干細胞移植的療效受到多方面影響，部分因子對移植后截肢的可能性有一定的預測作用。該文就干細胞移植治療血栓閉塞性脈管炎的臨床研究進展進行綜述，旨在為干細胞移植更好地用于治療血栓閉塞性脈管炎提供一定依據。
引用本文： 楊金江, 楊鏞, 馬振桓. 干細胞移植治療血栓閉塞性脈管炎的進展. 華西醫學, 2020, 35(3): 357-362. doi: 10.7507/1002-0179.201912123 復制
血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是一種影響中小動靜脈的周圍血管疾病，其發病機制尚不明確，特點是中青年患者會出現慢性肢體缺血以及截肢率高，旁路手術、介入治療和藥物治療對其療效有限。1998 年 Folkman[1]提出“治療性血管新生（therapeutic angiogenesis）”的概念，2002 年 Tateishi-Yuyama 等[2]首次用干細胞移植治療慢性肢體缺血。作為治療性血管新生的主要方法之一，干細胞移植有獨特的優勢，目前干細胞移植在臨床上的運用越來越廣泛。由于國內人口基數較大，這方面的研究較國外更多，且多聚焦于自體外周血單個核細胞（autologous peripheral blood mononuclear cell，APBMNC）移植，并在 2012 年制定了專家共識[3]，國內對純化 CD34+細胞（purified CD34+ cell，PCC）的臨床運用研究處于前沿[4-5]，國際上對于 TAO 所用干細胞移植治療中的其他細胞種類也進行了一些探索[6-7]。既往臨床試驗大多將 TAO、動脈硬化閉塞癥和糖尿病足等合并為重癥肢體缺血進行研究[8]。近年來，一批專門針對 TAO 進行的干細胞臨床試驗結果相繼發表[4-7, 9-16]。本文就國內外的相關文獻進行整理，對干細胞移植的機制、療效、安全性等多個方面進行綜述，旨在為干細胞移植更好地用于治療 TAO 提供一定依據。
1 干細胞治療 TAO 的機制
干細胞有能力在不斷自我更新的同時保持分化的潛能，并且可以在人體內產生任何成熟的細胞類型。干細胞移植可以通過多種機制調控治療性血管新生和組織修復，包括：① 分化成內皮祖細胞和/或多種組織細胞以替代受損細胞類型；② 分泌生長因子、細胞因子、激素等旁分泌因子，調節新生血管的形成；③ 具有免疫調節和抗炎作用[17]。在早期用小鼠模型模擬后肢缺血的動物實驗中，術后第 14 天實驗組與對照組相比，小鼠缺血腓腸肌的再灌注明顯改善，毛細血管密度明顯增大[18]。在臨床試驗中，Wan 等[9]報道 64 例 TAO（80 條肢體）行外周血干細胞移植，術后 6 個月動脈造影發現新的側支血管形成。干細胞移植療法目前正處于臨床試驗階段，近年來的一些臨床研究中干細胞移植改善了大多數 TAO 患者的預后[4-7, 9-16]。
2 適應證
TAO 通常導致患者膝下中小動脈節段性閉塞，雖然血管腔內治療可能是一種有效的方法，可以保護缺血的肢體和加速缺血性潰瘍的愈合，但是腔內治療的遠期通暢率不高[19]，且膝下動脈閉塞的患者也不適合做旁路手術，患者術后 5、10、20 年的截肢率分別為 25%、38% 和 46%[20]。在保守治療方面，前列腺素類藥物是首選[21]，此外免疫治療[22]、波生坦[23]及西洛他唑[24]等藥物可能有一定療效，也有研究使用高壓氧來促進創面愈合和減輕靜息痛[25]。但是保守治療也只對部分患者有效，對于不能手術、保守治療無效的患者，干細胞治療提供了一種新的治療手段。總結起來，干細胞治療 TAO 的適應證為：① 無法行旁路手術或介入治療的 TAO 患者；② 上述保守治療無效的患者；③ 無法耐受旁路手術和介入治療的患者；④ 動脈閉塞節段位置較低（不包括主髂動脈閉塞）的患者；⑤ 無手術禁忌[3, 26]。
3 干細胞的分類和采集
在 Tateishi-Yuyama 等[2]進行的試驗取得初步成功后，研究者就針對可用于移植的干細胞類型進行了探索[4, 6-7, 27-28]。可以根據干細胞的提供者將干細胞移植分為自體干細胞移植和異體干細胞移植，干細胞也可分為成體干細胞和胚胎干細胞。干細胞有幾種已知的來源：① 骨髓，需要從股骨或髂骨抽取骨髓組織，從而獲得骨髓來源的骨髓間充質干細胞和自體骨髓單個核細胞（autologous bone marrow mononuclear cell，ABMMNC）；② 脂肪組織（脂肪細胞），需要抽取脂肪獲得脂肪源性干細胞；③ 血液，需要經血液穿刺術抽出獲得 APBMNC 以及 PCC；④ 臍帶血，即人臍帶血來源間充質干細胞和人臍帶血單個核細胞；⑤ 胚胎，即胚胎干細胞。相較于其他的干細胞移植方法，外周血單個核細胞移植創傷小，不存在免疫排斥，也不涉及倫理問題，無需進行細胞培養，而且在臨床療效上與其他類型的干細胞相比未見明顯差別，故而在臨床上的運用最為廣泛。
3.1 APBMNC
正常生理狀態下，大多數骨髓干細胞在特定的稱為“龕”的微環境中處于靜息狀態，需要某些藥物或某些細胞因子的刺激使干細胞從“龕”中釋放進入外周血，這個過程稱之為骨髓動員。正常人體外周血中干細胞數量極低，達不到干細胞移植的要求，需要通過骨髓動員增加外周血中的干細胞濃度，以滿足自體移植的需要[29]。目前 APBMNC 的采集方法是皮下注射粒細胞集落刺激因子 5～10 μg/kg，1 次/d，外周血干細胞移植動員 4～5 d，改良骨髓干細胞移植動員 2～3 d，然后用血細胞分離器連續收集單個核細胞。Wan 等[9]用 APBMNC 治療 TAO，該研究入組 TAO 患者 64 例（80 支受影響的肢體），研究結果表明，除了 5 例患者（5 條患肢）移植后 4 周后發生下肢中段以下壞死和截肢，其余 59 例（75 條患肢）均成功保肢，疼痛感、冷覺改善，術后 3 個月跛行距離改善，踝肱指數（ankle brachial index，ABI）升高，經皮血氧分壓（transcutaneous partial blood oxygen pressure，TcPO2）升高，足部皮膚溫度升高，治療前后差異有統計學意義，移植后 6 個月的動脈造影顯示有不同程度的新側支血管形成。于靖宜等[10]用 APBMNC 治療 12 例患者，隨訪 24 個月，結果表明與對照組（10 例）相比，治療組的潰瘍愈合情況和肢體缺血情況改善，兩組截肢率差別無統計學意義。張濤等[11]用 APBMNC 治療 39 例 TAO 患者，隨訪 6 個月，發現 TcPO2、ABI、皮溫和跛行距離改善，下肢血管側支循環的 CT 血管成像評分明顯提高，治療前后視覺模擬疼痛評分差別無統計學意義。
3.2 ABMMNC
ABMMNC 的采集方法是進行骨髓動員后，用利多卡因麻醉骨髓抽吸部位后抽吸骨髓，常規采集量約 200 mL，采集的骨髓用連續流式細胞分離器分離并濃縮為干細胞移植所需的 ABMMNC[3]。Guo 等[12]用自體骨髓源性單核細胞治療 59 例 TAO 患者，19 例單獨選擇阿司匹林，40 例選擇阿司匹林聯合 ABMMNC 注射。結果顯示，使用 ABMMNC 的患者 10 年無截肢生存率為 85.3%，而單獨使用阿司匹林的患者 10 年無截肢生存率為 40%，前者潰瘍面積、趾肱指數、TcPO2、疼痛評分均有明顯改善，但兩者 ABI 平均值差異無統計學意義（P=0.806）。此外，Heo 等[13]、白超等[15]、Baran 等[16]采用 ABMMNC 治療 TAO 的單臂試驗都顯示出良好的療效。
3.3 PCC
ABMMNC 和 APBMNC 中起主要作用的是內皮祖細胞，但是內皮祖細胞濃度很低，而 CD34 是內皮祖細胞的表面標志物，理論上講，純化后的單核細胞中 PCC 含量更高，與未純化的單核細胞相比，可能會誘導更高水平的新生血管分化和更少的炎癥反應[4]。目前已有研究開始使用 PCC 治療 TAO[4-5]。Dong 等[4]將 50 例患者平均分為 PCC 組和 APBMNC 組，移植后 2 周，PCC 組獲得靜息疼痛緩解的患者比例明顯高于 APBMNC 組（68% vs. 32%，P=0.011），提示 PCC 較 APBMNC 可能更早改善灌注，且注射部位疼痛在 APBMNC 組比 PCC 組更常見（56% vs. 8%），這也可能是與 PCC 組去除了非內皮祖細胞成分有關。平均隨訪 24.5 個月后顯示，兩組的截肢率無明顯差別。
3.4 骨髓間充質干細胞
間充質干細胞具有良好的分化作用，是目前治療多種下肢缺血性疾病的研究熱點。在局部肌肉注射自體或異體骨髓間充質干細胞取得良好療效的基礎上，Martin-Rufino 等[6]首次報道了一例有截肢風險的 TAO 患者接受了來自健康捐獻者的骨髓來源的充質干細胞。移植后足部皮膚潰瘍明顯消退，靜息痛、步行障礙問卷得分、生活質量得到改善，治療 16 個月后患者已不再需要截肢，治療前后磁共振血管成像顯示下肢血管的密度無差別。
3.5 人臍帶血間充質干細胞
人臍帶血間充質干細胞是典型的成體干細胞之一，與其他來源的干細胞相比，它們具有免疫原性低、無創獲取、易于體外擴增、不會引起倫理學上的爭議等優點。因此，臍帶血間充質干細胞是一種很有前途的細胞療法。杜俊文等[27]研究表明臍帶血間充質干細胞聯合骨髓干細胞治療下肢缺血較單獨采用骨髓干細胞能夠更加有效提高患肢皮溫、TcPO2 和 ABI，且改善患者疼痛及冷感等臨床癥狀療效更佳。Yang 等[30]采用臍血源性間充質干細胞肌肉注射移植治療 8 例不適宜接受血管成形術治療的慢性肢體缺血患者的研究表明，75% 的潰瘍完全愈合，8 例患者中有 3 例的血管造影評分升高。該試驗表明肌肉注射臍帶血間充質干細胞是一種安全且耐受良好的治療方法，適用于閉塞性動脈硬化和 TAO 導致的晚期慢性肢體缺血患者。
3.6 人臍帶血單個核細胞
臍帶血富含大量造血干細胞，造血干細胞和內皮祖細胞來源于共同的成血管細胞，能在缺血組織中分化成內皮細胞和骨骼肌細胞，并可誘導血管新生。周慧敏等[28]研究表明，臍帶血單個核細胞移植治療后 6 個月內，移植局部可見較小的側支血管形成。劉璠等[31]研究表明 ABMMNC 和臍帶血單個核細胞在治療 2 型糖尿病下肢血管病變時均安全有效，臍帶血單個核細胞的療效不亞于 ABMMNC。但目前尚未有臍帶血單個核細胞治療 TAO 的相關文獻，不過周慧敏等[28]研究表明干細胞移植治療糖尿病足后 6 個月內局部有側支循環形成，這可以增加缺血部位的血供，對 TAO 的治療應該同樣有效。
3.7 脂肪源性干細胞
2001 年 Zuk 等[32]成功從脂肪抽吸物中分離培養出具有多向分化潛能的干細胞，脂肪組織在人體中含量多、分布廣、較容易獲得，脂肪組織來源的間充質干細胞作為干細胞藥物開發后，具有治療 TAO 的潛力。目前已經有研究就脂肪源性干細胞運用于 TAO 進行了探索[7]。Ra 等[7]的研究中共有 17 例患者以 500 萬個細胞/kg 的劑量肌內注射了脂肪源性干細胞，在功效方面，主要終點指標是總步行距離增加，次要終點指標是靜息痛的改善以及無痛步行距離、趾肱指數、TcPO2 和 ABI 的增加；注射脂肪源性干細胞后 6 個月的臨床試驗期間和 2 年以上的隨訪問卷調查中均未報告患者行截肢手術。此外，脂肪源性干細胞的提取已經有了專家共識[33]。
3.8 胚胎干細胞
由于胚胎干細胞涉及倫理學爭議，目前雖然已經做了一些基礎研究[34]，但在臨床上運用受限，尚沒有胚胎干細胞用于下肢缺血的臨床試驗發表。
4 療效分析
上述研究表明，干細胞治療在減輕疼痛、促進潰瘍愈合、增加 TcPO2 等方面的臨床試驗結果一致[4-7, 9-16, 26-29]，基本可以肯定干細胞治療在這些方面的療效。然而，Guo 等[12]等研究的結果顯示，干細胞移植治療后試驗組和對照組相比 ABI 差異無統計學意義，Heo 等[13]的單臂試驗結果顯示，干細胞移植治療后 ABI 較基線升高，但差異無統計學意義，這和其他各項研究的結果不同，可能是因為干細胞的移植對于較大血管的血流改善不明顯，而增加了小微血管數量和口徑的緣故，尚需要進一步的研究。干細胞移植的目的，不僅是為了改善患者的靜息痛、跛行、潰瘍等癥狀，還為了降低截肢率和截肢平面。在隨機對照試驗方面，Guo 等[12]的研究表明與對照組相比，干細胞移植可以降低截肢率，于靖宜等[10]研究表明截肢率差別無統計學意義，Dong 等[4]研究表明 PCC 組和 APBMNC 組的截肢率無明顯差別，孫英倫等[35]研究表明自體外周血干細胞移植聯合置管溶栓術治療 TAO 患者可促進新生側支血管形成并降低截肢平面。其他研究雖未直接對比，但是可以看出截肢率與 TAO 自然病程相比降低，發表在國內的幾項研究大部分未能提供在隨訪期間截肢率的數據[11, 14-15]，筆者認為就自身對照試驗而言，可以在試驗開始前計算截肢預評估值，與治療后截肢數據進行對比，可以得出預估的截肢對照數據。此外，各項研究觀察的指標有所差別，部分試驗沒有觀察 ABI[4-5, 10, 15]，有的試驗未評估側支血管新生情況[4-5, 10, 12-13, 15]，臨床觀察的主觀和客觀指標有待統一以便于系統回顧。
5 干細胞的移植方法
傳統的 TAO 干細胞移植方法有 2 種，一種是局部缺血肌肉注射法，一種是下肢動脈腔內注射[3]。Martin-Rufino 等[6]采用間充質干細胞靜脈輸注的方法，也取得了良好的療效。目前尚無證據表明這3 種注射方法在療效上有明顯區別，還需將該方法與更常規的肌內給藥和下肢動脈腔內注射療法進行對比。
6 影響療效的因素
6.1 干細胞的預處理
干細胞注入患肢后能否順利發揮作用涉及到干細胞的歸巢、存活、旁分泌等多個方面。部分研究表明，干細胞的預處理可能會增加療效[36-40]。由于干細胞的運用范圍廣，預處理方式多樣，目前關于干細胞預處理的研究很多，筆者認為在其他研究中干細胞的預處理方法對于 TAO 患者干細胞移植同樣有借鑒作用。Aicher 等[36]研究表明在慢性后肢缺血大鼠模型中能量沖擊波能夠增強內皮祖細胞募集。袁大江等[37]研究表明，低濃度過氧化氫預處理可顯著增強骨髓間充質干細胞抗氧化應激損傷能力。王倩等[38]研究表明，體外培養的人脂肪干細胞在 3% 和 5% 氧分壓的低氧條件下，血管內皮生長因子的分泌量以及類胰島素一號增長因子的分泌量相比在常氧條件下都有顯著提高，分別為常氧條件下的 2.33 倍和 2.41 倍。細胞因子是骨髓環境的重要組成部分，對造血干細胞移植后的移植時間有顯著影響。干細胞移植受到多種因子的影響，Nowicki 等[39]研究表明，血管內皮生長因子、血管生成素 1、血管生成素 2 和基質金屬蛋白酶 9 等對造血干細胞移植后的移植時間有顯著影響。對移植的干細胞進行基因修飾也是一種可行的方法[40]。干細胞的預處理方法不一而足，難以完全統計，以后的臨床試驗可以就這方面進行探索。
6.2 其他影響療效的因素
除了對移植用的干細胞進行預處理會影響療效外，閆波等[41]研究表明患者術前膝下輸出道的長度、缺血原因、缺血速度、年齡因素對干細胞移植后療效有很大的影響。此外，該研究表明自體干細胞移植在 TAO 患者中效果較動脈硬化閉塞癥患者和糖尿病足患者更佳。Jeon 等[42]研究表明在后肢缺血性疾病模型中，原始的骨髓間充質干細胞較胎盤和脂肪來源的間充質干細胞具有更好的治療效果。Chandra 等[43]發現雌激素能夠明顯增加人體骨髓間充質干細胞的增殖能力。干細胞移植和其他治療方法聯合也可以起到更好的療效，Jiang 等[44]的研究表明含有血管內皮生長因子的聚己內酯納米纖維增強了間充質干細胞的分化和內皮細胞的血管生成。杜俊文等[27]研究表明多種干細胞聯合移植治療可以提高療效。
7 干細胞移植后截肢預測因子
由于 TAO 本身發病率較低，患者較少，干細胞移植后截肢的預測因子方面的研究非常少。Sun 等[45]研究表明空腹血糖>6.0 mmol/L 和纖維蛋白原>4 g/L 意味著較高的截肢率，干細胞移植后預后更差，纖維蛋白原<4 g/L 的患者中有 81.8% 可避免截肢，而纖維蛋白原>4 g/L 的患者中只有 53.6% 避免截肢（P<0.05）。Aoyama 等[46]的研究表明 APBMNC 移植術后早期白細胞介素-6 和堿性成纖維生長因子的變化可作為 3 個月內需要截肢的預測因子。干細胞移植后截肢的預測因子方面還需要更多的研究。
8 安全性
關于 TAO 干細胞移植的安全性并無太大爭議。谷涌泉等[26]指出術后應該觀察是否有致瘤性，有無局部不良反應，包括局部有無紅、腫、熱、痛等炎癥反應及過敏反應，有無全身的不良反應，術后肝腎等功能的變化。另外一個可能的風險是在骨髓單個核細胞移植時使用粒細胞集落刺激因子動員大量的骨髓單個核細胞入血，這增加了血液的黏度，粒細胞集落刺激因子還可促進血小板的聚集與活化，有可能導致血栓形成，所以在采集過程中需要常規抗凝。但是在上述多項臨床研究[4-7, 9-16]中可以看出，最早 Tateishi-Yuyama 等[2]隨訪 24 周的研究表明并無不良事件發生，隨后的研究都進行了長期的隨訪，目前進行的各項研究均無嚴重不良事件的發生，因此有充分的理由認為各種干細胞在治療 TAO 方面是安全的。
9 小結
干細胞治療的優勢在于對那些旁路手術、腔內治療及保守治療無效的 TAO 患者提供了新的治療方法，而且這一方法的療效已經在臨床上獲得了證實，部分研究表明患者的臨床癥狀能夠得到明顯緩解[4-7, 9-16]，也有研究表明截肢率下降，而且干細胞移植基本是安全的[12]。ABMMNC 和 APBMNC 的移植已經有 10 余年的歷史，其中 APBMNC 移植由于采集的微創和簡便性，目前運用得越來越多，PCC 的研究是近年來自體干細胞移植取得的一大進展，值得進行更深入的研究。各種來源的干細胞，尤其是 ABMMNC、APBMNC 和 PCC 外的各種干細胞間還需要進一步的對比研究。干細胞的移植取得了一些進展，但還存在一些問題，首要的問題是缺乏大樣本、多中心、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗，有 Cochrane 回顧性研究經過嚴格篩選后納入了一項 Dash 等[47]的隨機對照試驗進行分析，結果顯示非常低質量的證據表明，使用骨髓來源的干細胞可能對潰瘍愈合有影響，并可改善 TAO 患者的無痛步行距離。此外，干細胞的移植逐漸由粗放走向精細和精準，干細胞的基因修飾、干細胞和多種生長因子的聯合運用、尋找更有效的干細胞植入后的預測因子、更科學的療效評估標準等問題亟待解決，這還需依賴更多研究者的重視和參與。
血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是一種影響中小動靜脈的周圍血管疾病，其發病機制尚不明確，特點是中青年患者會出現慢性肢體缺血以及截肢率高，旁路手術、介入治療和藥物治療對其療效有限。1998 年 Folkman[1]提出“治療性血管新生（therapeutic angiogenesis）”的概念，2002 年 Tateishi-Yuyama 等[2]首次用干細胞移植治療慢性肢體缺血。作為治療性血管新生的主要方法之一，干細胞移植有獨特的優勢，目前干細胞移植在臨床上的運用越來越廣泛。由于國內人口基數較大，這方面的研究較國外更多，且多聚焦于自體外周血單個核細胞（autologous peripheral blood mononuclear cell，APBMNC）移植，并在 2012 年制定了專家共識[3]，國內對純化 CD34+細胞（purified CD34+ cell，PCC）的臨床運用研究處于前沿[4-5]，國際上對于 TAO 所用干細胞移植治療中的其他細胞種類也進行了一些探索[6-7]。既往臨床試驗大多將 TAO、動脈硬化閉塞癥和糖尿病足等合并為重癥肢體缺血進行研究[8]。近年來，一批專門針對 TAO 進行的干細胞臨床試驗結果相繼發表[4-7, 9-16]。本文就國內外的相關文獻進行整理，對干細胞移植的機制、療效、安全性等多個方面進行綜述，旨在為干細胞移植更好地用于治療 TAO 提供一定依據。
1 干細胞治療 TAO 的機制
干細胞有能力在不斷自我更新的同時保持分化的潛能，并且可以在人體內產生任何成熟的細胞類型。干細胞移植可以通過多種機制調控治療性血管新生和組織修復，包括：① 分化成內皮祖細胞和/或多種組織細胞以替代受損細胞類型；② 分泌生長因子、細胞因子、激素等旁分泌因子，調節新生血管的形成；③ 具有免疫調節和抗炎作用[17]。在早期用小鼠模型模擬后肢缺血的動物實驗中，術后第 14 天實驗組與對照組相比，小鼠缺血腓腸肌的再灌注明顯改善，毛細血管密度明顯增大[18]。在臨床試驗中，Wan 等[9]報道 64 例 TAO（80 條肢體）行外周血干細胞移植，術后 6 個月動脈造影發現新的側支血管形成。干細胞移植療法目前正處于臨床試驗階段，近年來的一些臨床研究中干細胞移植改善了大多數 TAO 患者的預后[4-7, 9-16]。
2 適應證
TAO 通常導致患者膝下中小動脈節段性閉塞，雖然血管腔內治療可能是一種有效的方法，可以保護缺血的肢體和加速缺血性潰瘍的愈合，但是腔內治療的遠期通暢率不高[19]，且膝下動脈閉塞的患者也不適合做旁路手術，患者術后 5、10、20 年的截肢率分別為 25%、38% 和 46%[20]。在保守治療方面，前列腺素類藥物是首選[21]，此外免疫治療[22]、波生坦[23]及西洛他唑[24]等藥物可能有一定療效，也有研究使用高壓氧來促進創面愈合和減輕靜息痛[25]。但是保守治療也只對部分患者有效，對于不能手術、保守治療無效的患者，干細胞治療提供了一種新的治療手段。總結起來，干細胞治療 TAO 的適應證為：① 無法行旁路手術或介入治療的 TAO 患者；② 上述保守治療無效的患者；③ 無法耐受旁路手術和介入治療的患者；④ 動脈閉塞節段位置較低（不包括主髂動脈閉塞）的患者；⑤ 無手術禁忌[3, 26]。
3 干細胞的分類和采集
在 Tateishi-Yuyama 等[2]進行的試驗取得初步成功后，研究者就針對可用于移植的干細胞類型進行了探索[4, 6-7, 27-28]。可以根據干細胞的提供者將干細胞移植分為自體干細胞移植和異體干細胞移植，干細胞也可分為成體干細胞和胚胎干細胞。干細胞有幾種已知的來源：① 骨髓，需要從股骨或髂骨抽取骨髓組織，從而獲得骨髓來源的骨髓間充質干細胞和自體骨髓單個核細胞（autologous bone marrow mononuclear cell，ABMMNC）；② 脂肪組織（脂肪細胞），需要抽取脂肪獲得脂肪源性干細胞；③ 血液，需要經血液穿刺術抽出獲得 APBMNC 以及 PCC；④ 臍帶血，即人臍帶血來源間充質干細胞和人臍帶血單個核細胞；⑤ 胚胎，即胚胎干細胞。相較于其他的干細胞移植方法，外周血單個核細胞移植創傷小，不存在免疫排斥，也不涉及倫理問題，無需進行細胞培養，而且在臨床療效上與其他類型的干細胞相比未見明顯差別，故而在臨床上的運用最為廣泛。
3.1 APBMNC
正常生理狀態下，大多數骨髓干細胞在特定的稱為“龕”的微環境中處于靜息狀態，需要某些藥物或某些細胞因子的刺激使干細胞從“龕”中釋放進入外周血，這個過程稱之為骨髓動員。正常人體外周血中干細胞數量極低，達不到干細胞移植的要求，需要通過骨髓動員增加外周血中的干細胞濃度，以滿足自體移植的需要[29]。目前 APBMNC 的采集方法是皮下注射粒細胞集落刺激因子 5～10 μg/kg，1 次/d，外周血干細胞移植動員 4～5 d，改良骨髓干細胞移植動員 2～3 d，然后用血細胞分離器連續收集單個核細胞。Wan 等[9]用 APBMNC 治療 TAO，該研究入組 TAO 患者 64 例（80 支受影響的肢體），研究結果表明，除了 5 例患者（5 條患肢）移植后 4 周后發生下肢中段以下壞死和截肢，其余 59 例（75 條患肢）均成功保肢，疼痛感、冷覺改善，術后 3 個月跛行距離改善，踝肱指數（ankle brachial index，ABI）升高，經皮血氧分壓（transcutaneous partial blood oxygen pressure，TcPO2）升高，足部皮膚溫度升高，治療前后差異有統計學意義，移植后 6 個月的動脈造影顯示有不同程度的新側支血管形成。于靖宜等[10]用 APBMNC 治療 12 例患者，隨訪 24 個月，結果表明與對照組（10 例）相比，治療組的潰瘍愈合情況和肢體缺血情況改善，兩組截肢率差別無統計學意義。張濤等[11]用 APBMNC 治療 39 例 TAO 患者，隨訪 6 個月，發現 TcPO2、ABI、皮溫和跛行距離改善，下肢血管側支循環的 CT 血管成像評分明顯提高，治療前后視覺模擬疼痛評分差別無統計學意義。
3.2 ABMMNC
ABMMNC 的采集方法是進行骨髓動員后，用利多卡因麻醉骨髓抽吸部位后抽吸骨髓，常規采集量約 200 mL，采集的骨髓用連續流式細胞分離器分離并濃縮為干細胞移植所需的 ABMMNC[3]。Guo 等[12]用自體骨髓源性單核細胞治療 59 例 TAO 患者，19 例單獨選擇阿司匹林，40 例選擇阿司匹林聯合 ABMMNC 注射。結果顯示，使用 ABMMNC 的患者 10 年無截肢生存率為 85.3%，而單獨使用阿司匹林的患者 10 年無截肢生存率為 40%，前者潰瘍面積、趾肱指數、TcPO2、疼痛評分均有明顯改善，但兩者 ABI 平均值差異無統計學意義（P=0.806）。此外，Heo 等[13]、白超等[15]、Baran 等[16]采用 ABMMNC 治療 TAO 的單臂試驗都顯示出良好的療效。
3.3 PCC
ABMMNC 和 APBMNC 中起主要作用的是內皮祖細胞，但是內皮祖細胞濃度很低，而 CD34 是內皮祖細胞的表面標志物，理論上講，純化后的單核細胞中 PCC 含量更高，與未純化的單核細胞相比，可能會誘導更高水平的新生血管分化和更少的炎癥反應[4]。目前已有研究開始使用 PCC 治療 TAO[4-5]。Dong 等[4]將 50 例患者平均分為 PCC 組和 APBMNC 組，移植后 2 周，PCC 組獲得靜息疼痛緩解的患者比例明顯高于 APBMNC 組（68% vs. 32%，P=0.011），提示 PCC 較 APBMNC 可能更早改善灌注，且注射部位疼痛在 APBMNC 組比 PCC 組更常見（56% vs. 8%），這也可能是與 PCC 組去除了非內皮祖細胞成分有關。平均隨訪 24.5 個月后顯示，兩組的截肢率無明顯差別。
3.4 骨髓間充質干細胞
間充質干細胞具有良好的分化作用，是目前治療多種下肢缺血性疾病的研究熱點。在局部肌肉注射自體或異體骨髓間充質干細胞取得良好療效的基礎上，Martin-Rufino 等[6]首次報道了一例有截肢風險的 TAO 患者接受了來自健康捐獻者的骨髓來源的充質干細胞。移植后足部皮膚潰瘍明顯消退，靜息痛、步行障礙問卷得分、生活質量得到改善，治療 16 個月后患者已不再需要截肢，治療前后磁共振血管成像顯示下肢血管的密度無差別。
3.5 人臍帶血間充質干細胞
人臍帶血間充質干細胞是典型的成體干細胞之一，與其他來源的干細胞相比，它們具有免疫原性低、無創獲取、易于體外擴增、不會引起倫理學上的爭議等優點。因此，臍帶血間充質干細胞是一種很有前途的細胞療法。杜俊文等[27]研究表明臍帶血間充質干細胞聯合骨髓干細胞治療下肢缺血較單獨采用骨髓干細胞能夠更加有效提高患肢皮溫、TcPO2 和 ABI，且改善患者疼痛及冷感等臨床癥狀療效更佳。Yang 等[30]采用臍血源性間充質干細胞肌肉注射移植治療 8 例不適宜接受血管成形術治療的慢性肢體缺血患者的研究表明，75% 的潰瘍完全愈合，8 例患者中有 3 例的血管造影評分升高。該試驗表明肌肉注射臍帶血間充質干細胞是一種安全且耐受良好的治療方法，適用于閉塞性動脈硬化和 TAO 導致的晚期慢性肢體缺血患者。
3.6 人臍帶血單個核細胞
臍帶血富含大量造血干細胞，造血干細胞和內皮祖細胞來源于共同的成血管細胞，能在缺血組織中分化成內皮細胞和骨骼肌細胞，并可誘導血管新生。周慧敏等[28]研究表明，臍帶血單個核細胞移植治療后 6 個月內，移植局部可見較小的側支血管形成。劉璠等[31]研究表明 ABMMNC 和臍帶血單個核細胞在治療 2 型糖尿病下肢血管病變時均安全有效，臍帶血單個核細胞的療效不亞于 ABMMNC。但目前尚未有臍帶血單個核細胞治療 TAO 的相關文獻，不過周慧敏等[28]研究表明干細胞移植治療糖尿病足后 6 個月內局部有側支循環形成，這可以增加缺血部位的血供，對 TAO 的治療應該同樣有效。
3.7 脂肪源性干細胞
2001 年 Zuk 等[32]成功從脂肪抽吸物中分離培養出具有多向分化潛能的干細胞，脂肪組織在人體中含量多、分布廣、較容易獲得，脂肪組織來源的間充質干細胞作為干細胞藥物開發后，具有治療 TAO 的潛力。目前已經有研究就脂肪源性干細胞運用于 TAO 進行了探索[7]。Ra 等[7]的研究中共有 17 例患者以 500 萬個細胞/kg 的劑量肌內注射了脂肪源性干細胞，在功效方面，主要終點指標是總步行距離增加，次要終點指標是靜息痛的改善以及無痛步行距離、趾肱指數、TcPO2 和 ABI 的增加；注射脂肪源性干細胞后 6 個月的臨床試驗期間和 2 年以上的隨訪問卷調查中均未報告患者行截肢手術。此外，脂肪源性干細胞的提取已經有了專家共識[33]。
3.8 胚胎干細胞
由于胚胎干細胞涉及倫理學爭議，目前雖然已經做了一些基礎研究[34]，但在臨床上運用受限，尚沒有胚胎干細胞用于下肢缺血的臨床試驗發表。
4 療效分析
上述研究表明，干細胞治療在減輕疼痛、促進潰瘍愈合、增加 TcPO2 等方面的臨床試驗結果一致[4-7, 9-16, 26-29]，基本可以肯定干細胞治療在這些方面的療效。然而，Guo 等[12]等研究的結果顯示，干細胞移植治療后試驗組和對照組相比 ABI 差異無統計學意義，Heo 等[13]的單臂試驗結果顯示，干細胞移植治療后 ABI 較基線升高，但差異無統計學意義，這和其他各項研究的結果不同，可能是因為干細胞的移植對于較大血管的血流改善不明顯，而增加了小微血管數量和口徑的緣故，尚需要進一步的研究。干細胞移植的目的，不僅是為了改善患者的靜息痛、跛行、潰瘍等癥狀，還為了降低截肢率和截肢平面。在隨機對照試驗方面，Guo 等[12]的研究表明與對照組相比，干細胞移植可以降低截肢率，于靖宜等[10]研究表明截肢率差別無統計學意義，Dong 等[4]研究表明 PCC 組和 APBMNC 組的截肢率無明顯差別，孫英倫等[35]研究表明自體外周血干細胞移植聯合置管溶栓術治療 TAO 患者可促進新生側支血管形成并降低截肢平面。其他研究雖未直接對比，但是可以看出截肢率與 TAO 自然病程相比降低，發表在國內的幾項研究大部分未能提供在隨訪期間截肢率的數據[11, 14-15]，筆者認為就自身對照試驗而言，可以在試驗開始前計算截肢預評估值，與治療后截肢數據進行對比，可以得出預估的截肢對照數據。此外，各項研究觀察的指標有所差別，部分試驗沒有觀察 ABI[4-5, 10, 15]，有的試驗未評估側支血管新生情況[4-5, 10, 12-13, 15]，臨床觀察的主觀和客觀指標有待統一以便于系統回顧。
5 干細胞的移植方法
傳統的 TAO 干細胞移植方法有 2 種，一種是局部缺血肌肉注射法，一種是下肢動脈腔內注射[3]。Martin-Rufino 等[6]采用間充質干細胞靜脈輸注的方法，也取得了良好的療效。目前尚無證據表明這3 種注射方法在療效上有明顯區別，還需將該方法與更常規的肌內給藥和下肢動脈腔內注射療法進行對比。
6 影響療效的因素
6.1 干細胞的預處理
干細胞注入患肢后能否順利發揮作用涉及到干細胞的歸巢、存活、旁分泌等多個方面。部分研究表明，干細胞的預處理可能會增加療效[36-40]。由于干細胞的運用范圍廣，預處理方式多樣，目前關于干細胞預處理的研究很多，筆者認為在其他研究中干細胞的預處理方法對于 TAO 患者干細胞移植同樣有借鑒作用。Aicher 等[36]研究表明在慢性后肢缺血大鼠模型中能量沖擊波能夠增強內皮祖細胞募集。袁大江等[37]研究表明，低濃度過氧化氫預處理可顯著增強骨髓間充質干細胞抗氧化應激損傷能力。王倩等[38]研究表明，體外培養的人脂肪干細胞在 3% 和 5% 氧分壓的低氧條件下，血管內皮生長因子的分泌量以及類胰島素一號增長因子的分泌量相比在常氧條件下都有顯著提高，分別為常氧條件下的 2.33 倍和 2.41 倍。細胞因子是骨髓環境的重要組成部分，對造血干細胞移植后的移植時間有顯著影響。干細胞移植受到多種因子的影響，Nowicki 等[39]研究表明，血管內皮生長因子、血管生成素 1、血管生成素 2 和基質金屬蛋白酶 9 等對造血干細胞移植后的移植時間有顯著影響。對移植的干細胞進行基因修飾也是一種可行的方法[40]。干細胞的預處理方法不一而足，難以完全統計，以后的臨床試驗可以就這方面進行探索。
6.2 其他影響療效的因素
除了對移植用的干細胞進行預處理會影響療效外，閆波等[41]研究表明患者術前膝下輸出道的長度、缺血原因、缺血速度、年齡因素對干細胞移植后療效有很大的影響。此外，該研究表明自體干細胞移植在 TAO 患者中效果較動脈硬化閉塞癥患者和糖尿病足患者更佳。Jeon 等[42]研究表明在后肢缺血性疾病模型中，原始的骨髓間充質干細胞較胎盤和脂肪來源的間充質干細胞具有更好的治療效果。Chandra 等[43]發現雌激素能夠明顯增加人體骨髓間充質干細胞的增殖能力。干細胞移植和其他治療方法聯合也可以起到更好的療效，Jiang 等[44]的研究表明含有血管內皮生長因子的聚己內酯納米纖維增強了間充質干細胞的分化和內皮細胞的血管生成。杜俊文等[27]研究表明多種干細胞聯合移植治療可以提高療效。
7 干細胞移植后截肢預測因子
由于 TAO 本身發病率較低，患者較少，干細胞移植后截肢的預測因子方面的研究非常少。Sun 等[45]研究表明空腹血糖>6.0 mmol/L 和纖維蛋白原>4 g/L 意味著較高的截肢率，干細胞移植后預后更差，纖維蛋白原<4 g/L 的患者中有 81.8% 可避免截肢，而纖維蛋白原>4 g/L 的患者中只有 53.6% 避免截肢（P<0.05）。Aoyama 等[46]的研究表明 APBMNC 移植術后早期白細胞介素-6 和堿性成纖維生長因子的變化可作為 3 個月內需要截肢的預測因子。干細胞移植后截肢的預測因子方面還需要更多的研究。
8 安全性
關于 TAO 干細胞移植的安全性并無太大爭議。谷涌泉等[26]指出術后應該觀察是否有致瘤性，有無局部不良反應，包括局部有無紅、腫、熱、痛等炎癥反應及過敏反應，有無全身的不良反應，術后肝腎等功能的變化。另外一個可能的風險是在骨髓單個核細胞移植時使用粒細胞集落刺激因子動員大量的骨髓單個核細胞入血，這增加了血液的黏度，粒細胞集落刺激因子還可促進血小板的聚集與活化，有可能導致血栓形成，所以在采集過程中需要常規抗凝。但是在上述多項臨床研究[4-7, 9-16]中可以看出，最早 Tateishi-Yuyama 等[2]隨訪 24 周的研究表明并無不良事件發生，隨后的研究都進行了長期的隨訪，目前進行的各項研究均無嚴重不良事件的發生，因此有充分的理由認為各種干細胞在治療 TAO 方面是安全的。
9 小結
干細胞治療的優勢在于對那些旁路手術、腔內治療及保守治療無效的 TAO 患者提供了新的治療方法，而且這一方法的療效已經在臨床上獲得了證實，部分研究表明患者的臨床癥狀能夠得到明顯緩解[4-7, 9-16]，也有研究表明截肢率下降，而且干細胞移植基本是安全的[12]。ABMMNC 和 APBMNC 的移植已經有 10 余年的歷史，其中 APBMNC 移植由于采集的微創和簡便性，目前運用得越來越多，PCC 的研究是近年來自體干細胞移植取得的一大進展，值得進行更深入的研究。各種來源的干細胞，尤其是 ABMMNC、APBMNC 和 PCC 外的各種干細胞間還需要進一步的對比研究。干細胞的移植取得了一些進展，但還存在一些問題，首要的問題是缺乏大樣本、多中心、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗，有 Cochrane 回顧性研究經過嚴格篩選后納入了一項 Dash 等[47]的隨機對照試驗進行分析，結果顯示非常低質量的證據表明，使用骨髓來源的干細胞可能對潰瘍愈合有影響，并可改善 TAO 患者的無痛步行距離。此外，干細胞的移植逐漸由粗放走向精細和精準，干細胞的基因修飾、干細胞和多種生長因子的聯合運用、尋找更有效的干細胞植入后的預測因子、更科學的療效評估標準等問題亟待解決，這還需依賴更多研究者的重視和參與。