引用本文： 雷文華, 黃方洋, 廖延標, 李長明, 李君麗, 楊奕清, 陳茂. 二葉式主動脈瓣合并升主動脈擴張的生物信息學分析. 華西醫學, 2022, 37(8): 1203-1212. doi: 10.7507/1002-0179.202206098 復制
二葉式主動脈瓣（bicuspid aortic valve，BAV）是最常見的先天性心血管畸形，患病率為 0.5%～2%[1]。除引起主動脈瓣膜功能異常（主動脈瓣狹窄和/或主動脈瓣關閉不全）外，BAV 患者易并發主動脈擴張、主動脈夾層等主動脈疾病[2]。研究表明，35%～80% 的 BAV 患者伴有升主動脈擴張[2-3]。與正常三葉式主動脈瓣（tricuspid aortic valve，TAV）的人群相比，BAV 患者主動脈擴張出現更早，主動脈根部直徑更大，且進展速率更快[4-5]。文獻報道，合并主動脈擴張的 BAV 患者 15 年內接受主動脈手術及發生主動脈夾層的可能性分別為 46%［95% 置信區間（24.5%，67.5%）］和 7%［95% 置信區間（0.0%，14.8%）］[2]。BAV 合并升主動脈擴張的發病機制復雜，目前認為由遺傳因素與血流動力學異常共同導致。然而目前關于 BAV 合并主動脈擴張的發生進展及關鍵調節機制的理解仍然有限。本研究擬通過生物信息學方法分析基因測序芯片數據，旨在尋找可能延緩 BAV 合并升主動脈擴張的靶標，為臨床防治提供新的思路及依據。
1 資料與方法
1.1 數據來源
使用 R 包 GEO query[6]從基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載基因表達數據集 GSE83675 及其芯片探針對應的 GPL17077 平臺注釋文件（截至 2022 年 5 月 12 日）。該芯片包含 16 例主動脈瓣狹窄患者升主動脈組織的基因表達信息，其中 9 例為 BAV，7 例為 TAV[7]。他們的主動脈瓣膜狹窄程度無統計學意義（P>0.05），但 BAV 組的升主動脈平均直徑明顯大于 TAV 組。
1.2 數據預處理
采用 R 4.2.0 軟件進行數據分析及可視化操作。利用 stats 包中的 hclust、prcomp 函數對數據進行層次聚類分析及主成分分析，使用 plot 函數、R 包 ggplot2[8]和 ggfortify[9]對上述結果進行可視化，選擇合適的樣本進行后續分析。
1.3 篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）
對原始數據進行以 2 為底的對數轉換得到標準化后的探針表達矩陣，通過 limma 包[10]篩選 DEG［校正 P 值<0.05 且│log2FC│>1，其中 FC 表示差異倍數（fold change）］，使用 R 包 pheatmap 及 ggplot2 對 DEG 進行可視化處理，繪制熱圖和火山圖。
1.4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）
GSEA 通過評估預先定義的基因集在疾病表型中所有基因表達數據中的排序及分布趨勢來計算富集分數[11]。相較于傳統的富集方法，GSEA 未人為設定差異表達閾值，有助于識別表達變化較小卻有重要生物學意義的基因及通路。其具體方法為：按照 log2FC 對所有基因排序，利用 R 包 fgsea[12]進行 GSEA 及可視化，采用 MSigDB 數據庫中的京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）基因集，以 P<0.05、│標準化富集分數│>1 且錯誤發現率<0.25 的基因集為顯著富集基因集。
1.5 構建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡
使用 STRING 數據庫（
1.6 篩選 Hub 基因
利用 Cytoscape 軟件插件 cytoHubba（版本 0.1），篩選最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）、最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC）、節點連接度（degree）、邊緣滲出組件（edge percolated component，EPC）及緊密度（closeness）算法得到的前 15 位基因并取交集，將得到的基因作為 Hub 基因，對 Hub 基因利用 ClusterProfiler[13]包中的 gseGO 函數進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析。
1.7 免疫細胞浸潤分析
通過 CIBERSORT[14]網站的反卷積算法計算 22 種免疫細胞在兩組主動脈組織中的比例，P<0.05 視為差異有統計學意義，繪制免疫浸潤細胞箱式圖。
2 結果
2.1 層次聚類及主成分分析
為明確同組樣本之間的一致性及不同組別樣本之間的差異性，對數據進行層次聚類及主成分分析，結果如圖1 所示。除了 TAV 組中的 11 號、13 號樣本（tricuspid 11、tricuspid 13）外，其余的樣本都得到了正確的分類，因此我們去除了這 2 例樣本，對余下的 14 例樣本（9 例 BAV+5 例 TAV）進行后續分析。
圖1
樣本層次聚類樹狀圖及主成分分析散點圖
a. 各個樣本層次聚類分析結果，每個分支代表一個樣本，距離越小代表越相似；b. 各個樣本主成分分析結果。bicuspid 及 tricuspid 分別代表 BAV 組、TAV 組樣本
2.2 DEG 篩選
以 TAV 主動脈組作為對照組，以校正 P 值<0.05 且│log2FC│>1 為篩選標準進行差異基因篩選，共篩選出 199 個 DEG，BAV 合并擴張升主動脈組中上調基因 19 個，下調基因 180 個。兩組的差異基因分別以熱圖、火山圖的形式展現（圖2）。
圖2
DEG 的熱圖及火山圖
a. 熱圖，橫軸為樣品名稱，縱軸為基因名稱，其中 bicuspid 及 tricuspid 分別代表 BAV 組、TAV 組樣本；b. 火山圖，紅色代表上調，藍色代表下調
2.3 GSEA
GSEA 結果（表1、圖3）顯示，未發現顯著下調通路，相較于 TAV 組主動脈組織，BAV 合并升主動脈組織中細胞因子-細胞因子受體相互作用、癌癥相關通路、肌動蛋白細胞骨架調節、趨化因子信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等均上調。
表1
GSEA 標準化富集分數排名前 40 的基因集
圖3
GSEA 按標準化富集分數和 P 值綜合排名前 15 的基因集
2.4 構建 PPI 網絡及篩選 Hub 基因
為挖掘可能參與升主動脈擴張的關鍵基因，我們首先使用 STRING 數據庫對 GSE83675 數據集的 199 個 DEG 進行功能分析，得到了由 77 個節點、138 條關系線構成的 PPI 網絡（圖4）。進一步利用 Cytoscape 軟件的插件 cytoHubba，得到了 MCC、MNC、degree、EPC 及 closeness 算法計算出的前 15 位基因（表2），繪制韋恩圖取交集后，得到了 EGFR、RIMS3、DLGAP2、RAPH1、CCNB3、CD3E、PIK3R5、TP73、PAK3、AGAP2 這 10 個共有的 Hub 基因（圖5）。其中 CCNB3 和 PAK3 在 BAV 合并主動脈擴張組中表達上調，EGFR、RIMS3、RAPH1、CD3E、PIK3R5、TP73、AGAP2 表達下調（圖6）。Hub 基因的 GO 富集分析顯示，分子功能主要富集于激酶調節活性、Src 同源 3 結構域結合、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶結合等（圖7）。
圖4
DEG 的 PPI 網絡
表2
cytoHubba 插件計算得到的前 15 位基因
圖5
韋恩圖展示 Hub 基因
2.5 免疫細胞浸潤分析
為明確免疫細胞在主動脈擴張中的作用，我們通過 CIBERSORT 反卷積算法得到了 22 種免疫細胞浸潤矩陣，圖8 顯示了兩組主動脈組織中免疫細胞浸潤比例，其中活化自然殺傷細胞在兩組間浸潤差異有統計學意義（P=0.0214），M1 型巨噬細胞在 BAV 組擴張升主動脈組織中表達較低，但差異無統計學意義。
圖6
Hub 基因熱圖
橫軸為樣品名稱，縱軸為基因名稱，其中 bicuspid 及 tricuspid 分別代表 BAV 組、TAV 組樣本
圖8
CIBERSORT 分析 22 種免疫細胞在兩組主動脈組織中的浸潤情況
3 討論
目前 BAV 合并升主動脈擴張的發病機制仍不明確，可能包括 NOTCH1 及 GATA 家族基因突變、血流動力學改變引起血管壁剪切應力變化、中膜平滑肌細胞凋亡、彈性纖維片段化、原纖維蛋白 1 缺乏、基質金屬蛋白酶表達異常等原因[15-18]。本研究基于 GSE83675 芯片和生物信息學分析，深入挖掘了 BAV 合并升主動脈擴張患者與 TAV 患者主動脈組織間的 DEG，構建 PPI 網絡并獲得了 Hub 基因：EGFR、RIMS3、DLGAP2、RAPH1、CCNB3、CD3E、PIK3R5、TP73、PAK3、AGAP2。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）可調控多種信號分子及其下游靶標，包括 MAPK、磷酸肌醇-3 激酶等，從而調節細胞增殖、存活、分化、遷移和基質穩態[19]。研究顯示 EGFR 缺乏的小鼠出現了左心室肥厚、主動脈瓣增厚、峰值流速增加、炎癥細胞浸潤、膠原纖維排列紊亂等病理改變[20]；Schreier 等[21]還觀察到 EGFR 敲除小鼠心肌內小動脈呈現擴張表型，主動脈的壁/腔比值顯著降低，中膜厚度減小但該差異未達到統計學意義。含有 Ras 相關和 Pleckstrin 同源結構域的蛋白質 1 （ras-associated and pleckstrin homology domains-containing protein 1，RAPH1）在肌動蛋白細胞骨架的組裝、免疫細胞趨化作用、響應細胞外基質剛度的改變并調節細胞周期蛋白表達和細胞增殖中發揮重要作用[22-24]。有趣的是，RAPH1 也參與調節 EGFR 的內吞[25]。細胞周期蛋白 B3（cyclin B3，CCNB3）參與調控細胞有絲分裂及減數分裂[26]。CD3ε 亞基（CD3-epsilon，CD3E）參與 T 細胞受體（T-cell receptor，TCR）-CD3 復合物構成，介導 T 細胞活化及 TCR 信號轉導，同時它含有內吞序列，有助于 TCR 受體的內化和下調[27-28]。P110 催化亞基與由磷酸肌醇-3-激酶調節亞基 5（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 5，PIK3R5）編碼的 P101 調節亞基共同構成異二聚體即磷酸肌醇-3 激酶 γ，在炎癥、細胞遷移、心臟功能、腫瘤進展中起關鍵作用[29-30]。腫瘤蛋白 P73（tumor protein P73，TP73）是 p53 家族的一員，可通過調節血管內皮生長因子及轉化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）調控內皮細胞分化、遷移及血管生成[31]，但其在血管生成中的作用存在爭議[32]。作為調節細胞黏附和肌動蛋白細胞骨架動力學的中心樞紐之一，TP73 還參與調控 NOTCH 信號轉導[33-34]。在本研究中 BAV 合并主動脈擴張組中 TP73 表達下調，文獻報道 TAp73 缺失在降低細胞腺苷三磷酸水平及線粒體復合物Ⅳ活性的同時增加了活性氧產生、加速衰老進程[35]，而氧化應激和衰老也是 BAV 合并升主動脈擴張的關鍵病理機制[36-37]。P21 (RAC1)活化激酶 3［P21 (RAC1) activated kinase 3，PAK3］可以通過 TGF-β/smad 信號通路調節內皮間質轉分化相關分子的表達[38]。AGAP2 是 Arf GAP 蛋白（ADP 核糖基化因子 GTP 酶激活蛋白）家族的成員，參與受體運輸和再循環（包括 TGF-β 受體、β2-腎上腺素能受體等），以及調節黏著斑重塑和細胞與細胞外基質間信號傳導[39-41]。同時 AGAP2 與絲氨酸/蘇氨酸激酶特異性結合，并以 GTP 依賴的方式上調其激酶活性[42]。調節突觸膜胞吐作用蛋白 2（regulating synaptic membrane exocytosis 2，RIMS2）、DLG 相關蛋白 2（DLG associated protein 2，DLGAP2）主要在調節突觸形態及功能、神經系統疾病發生發展中發揮作用[43-44]，在心血管系統中的作用有待進一步探究。
本研究 GSEA 顯示，與 BAV 合并升主動脈擴張相關的通路顯著富集于免疫炎癥（細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路及 T 細胞受體信號通路等）、肌動蛋白細胞骨架調節、黏著斑、MAPK 信號通路、酪氨酸蛋白激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號通路、WNT 信號通路等。其中多條通路已經實驗證實[37, 45]，這也從側面反映了生物信息學分析方法在疾病機制探索中具有巨大應用價值。
本研究利用 CIBERSORT 反卷積算法計算了免疫細胞在主動脈組織中的浸潤比例，結果顯示活化自然殺傷細胞在 BAV 患者擴張的升主動脈組織中顯著浸潤。有研究表明腹主動脈瘤患者外周血中自然殺傷細胞比例及活性均增加[46]，結合本研究分析結果，推測活化自然殺傷細胞在 BAV 合并主動脈擴張中發揮關鍵作用。
本研究的局限：① 本研究是對 GEO 數據庫中已發布數據集的二次分析，且納入樣本量有限，或導致數據分析偏倚；② 本研究生物信息分析結果有待進一步實驗驗證；③ 不同的 BAV 瓣膜類型合并主動脈擴張的機制可能不同，因缺乏原始 BAV 分類信息，本研究未涉及相關分析，有待進一步探索。
綜上，本研究用生物信息學方法篩選出與 BAV 合并升主動脈擴張相關的關鍵基因及信號通路，可加深對其分子機制的理解，為臨床診療提供新思路。
圖7
Hub 基因 GO 富集分析結果
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
二葉式主動脈瓣（bicuspid aortic valve，BAV）是最常見的先天性心血管畸形，患病率為 0.5%～2%[1]。除引起主動脈瓣膜功能異常（主動脈瓣狹窄和/或主動脈瓣關閉不全）外，BAV 患者易并發主動脈擴張、主動脈夾層等主動脈疾病[2]。研究表明，35%～80% 的 BAV 患者伴有升主動脈擴張[2-3]。與正常三葉式主動脈瓣（tricuspid aortic valve，TAV）的人群相比，BAV 患者主動脈擴張出現更早，主動脈根部直徑更大，且進展速率更快[4-5]。文獻報道，合并主動脈擴張的 BAV 患者 15 年內接受主動脈手術及發生主動脈夾層的可能性分別為 46%［95% 置信區間（24.5%，67.5%）］和 7%［95% 置信區間（0.0%，14.8%）］[2]。BAV 合并升主動脈擴張的發病機制復雜，目前認為由遺傳因素與血流動力學異常共同導致。然而目前關于 BAV 合并主動脈擴張的發生進展及關鍵調節機制的理解仍然有限。本研究擬通過生物信息學方法分析基因測序芯片數據，旨在尋找可能延緩 BAV 合并升主動脈擴張的靶標，為臨床防治提供新的思路及依據。
1 資料與方法
1.1 數據來源
使用 R 包 GEO query[6]從基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載基因表達數據集 GSE83675 及其芯片探針對應的 GPL17077 平臺注釋文件（截至 2022 年 5 月 12 日）。該芯片包含 16 例主動脈瓣狹窄患者升主動脈組織的基因表達信息，其中 9 例為 BAV，7 例為 TAV[7]。他們的主動脈瓣膜狹窄程度無統計學意義（P>0.05），但 BAV 組的升主動脈平均直徑明顯大于 TAV 組。
1.2 數據預處理
采用 R 4.2.0 軟件進行數據分析及可視化操作。利用 stats 包中的 hclust、prcomp 函數對數據進行層次聚類分析及主成分分析，使用 plot 函數、R 包 ggplot2[8]和 ggfortify[9]對上述結果進行可視化，選擇合適的樣本進行后續分析。
1.3 篩選差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）
對原始數據進行以 2 為底的對數轉換得到標準化后的探針表達矩陣，通過 limma 包[10]篩選 DEG［校正 P 值<0.05 且│log2FC│>1，其中 FC 表示差異倍數（fold change）］，使用 R 包 pheatmap 及 ggplot2 對 DEG 進行可視化處理，繪制熱圖和火山圖。
1.4 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）
GSEA 通過評估預先定義的基因集在疾病表型中所有基因表達數據中的排序及分布趨勢來計算富集分數[11]。相較于傳統的富集方法，GSEA 未人為設定差異表達閾值，有助于識別表達變化較小卻有重要生物學意義的基因及通路。其具體方法為：按照 log2FC 對所有基因排序，利用 R 包 fgsea[12]進行 GSEA 及可視化，采用 MSigDB 數據庫中的京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）基因集，以 P<0.05、│標準化富集分數│>1 且錯誤發現率<0.25 的基因集為顯著富集基因集。
1.5 構建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡
使用 STRING 數據庫（
1.6 篩選 Hub 基因
利用 Cytoscape 軟件插件 cytoHubba（版本 0.1），篩選最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）、最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC）、節點連接度（degree）、邊緣滲出組件（edge percolated component，EPC）及緊密度（closeness）算法得到的前 15 位基因并取交集，將得到的基因作為 Hub 基因，對 Hub 基因利用 ClusterProfiler[13]包中的 gseGO 函數進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析。
1.7 免疫細胞浸潤分析
通過 CIBERSORT[14]網站的反卷積算法計算 22 種免疫細胞在兩組主動脈組織中的比例，P<0.05 視為差異有統計學意義，繪制免疫浸潤細胞箱式圖。
2 結果
2.1 層次聚類及主成分分析
為明確同組樣本之間的一致性及不同組別樣本之間的差異性，對數據進行層次聚類及主成分分析，結果如圖1 所示。除了 TAV 組中的 11 號、13 號樣本（tricuspid 11、tricuspid 13）外，其余的樣本都得到了正確的分類，因此我們去除了這 2 例樣本，對余下的 14 例樣本（9 例 BAV+5 例 TAV）進行后續分析。
圖1
樣本層次聚類樹狀圖及主成分分析散點圖
a. 各個樣本層次聚類分析結果，每個分支代表一個樣本，距離越小代表越相似；b. 各個樣本主成分分析結果。bicuspid 及 tricuspid 分別代表 BAV 組、TAV 組樣本
2.2 DEG 篩選
以 TAV 主動脈組作為對照組，以校正 P 值<0.05 且│log2FC│>1 為篩選標準進行差異基因篩選，共篩選出 199 個 DEG，BAV 合并擴張升主動脈組中上調基因 19 個，下調基因 180 個。兩組的差異基因分別以熱圖、火山圖的形式展現（圖2）。
圖2
DEG 的熱圖及火山圖
a. 熱圖，橫軸為樣品名稱，縱軸為基因名稱，其中 bicuspid 及 tricuspid 分別代表 BAV 組、TAV 組樣本；b. 火山圖，紅色代表上調，藍色代表下調
2.3 GSEA
GSEA 結果（表1、圖3）顯示，未發現顯著下調通路，相較于 TAV 組主動脈組織，BAV 合并升主動脈組織中細胞因子-細胞因子受體相互作用、癌癥相關通路、肌動蛋白細胞骨架調節、趨化因子信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等均上調。
表1
GSEA 標準化富集分數排名前 40 的基因集
圖3
GSEA 按標準化富集分數和 P 值綜合排名前 15 的基因集
2.4 構建 PPI 網絡及篩選 Hub 基因
為挖掘可能參與升主動脈擴張的關鍵基因，我們首先使用 STRING 數據庫對 GSE83675 數據集的 199 個 DEG 進行功能分析，得到了由 77 個節點、138 條關系線構成的 PPI 網絡（圖4）。進一步利用 Cytoscape 軟件的插件 cytoHubba，得到了 MCC、MNC、degree、EPC 及 closeness 算法計算出的前 15 位基因（表2），繪制韋恩圖取交集后，得到了 EGFR、RIMS3、DLGAP2、RAPH1、CCNB3、CD3E、PIK3R5、TP73、PAK3、AGAP2 這 10 個共有的 Hub 基因（圖5）。其中 CCNB3 和 PAK3 在 BAV 合并主動脈擴張組中表達上調，EGFR、RIMS3、RAPH1、CD3E、PIK3R5、TP73、AGAP2 表達下調（圖6）。Hub 基因的 GO 富集分析顯示，分子功能主要富集于激酶調節活性、Src 同源 3 結構域結合、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶結合等（圖7）。
圖4
DEG 的 PPI 網絡
表2
cytoHubba 插件計算得到的前 15 位基因
圖5
韋恩圖展示 Hub 基因
2.5 免疫細胞浸潤分析
為明確免疫細胞在主動脈擴張中的作用，我們通過 CIBERSORT 反卷積算法得到了 22 種免疫細胞浸潤矩陣，圖8 顯示了兩組主動脈組織中免疫細胞浸潤比例，其中活化自然殺傷細胞在兩組間浸潤差異有統計學意義（P=0.0214），M1 型巨噬細胞在 BAV 組擴張升主動脈組織中表達較低，但差異無統計學意義。
圖6
Hub 基因熱圖
橫軸為樣品名稱，縱軸為基因名稱，其中 bicuspid 及 tricuspid 分別代表 BAV 組、TAV 組樣本
圖8
CIBERSORT 分析 22 種免疫細胞在兩組主動脈組織中的浸潤情況
3 討論
目前 BAV 合并升主動脈擴張的發病機制仍不明確，可能包括 NOTCH1 及 GATA 家族基因突變、血流動力學改變引起血管壁剪切應力變化、中膜平滑肌細胞凋亡、彈性纖維片段化、原纖維蛋白 1 缺乏、基質金屬蛋白酶表達異常等原因[15-18]。本研究基于 GSE83675 芯片和生物信息學分析，深入挖掘了 BAV 合并升主動脈擴張患者與 TAV 患者主動脈組織間的 DEG，構建 PPI 網絡并獲得了 Hub 基因：EGFR、RIMS3、DLGAP2、RAPH1、CCNB3、CD3E、PIK3R5、TP73、PAK3、AGAP2。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）可調控多種信號分子及其下游靶標，包括 MAPK、磷酸肌醇-3 激酶等，從而調節細胞增殖、存活、分化、遷移和基質穩態[19]。研究顯示 EGFR 缺乏的小鼠出現了左心室肥厚、主動脈瓣增厚、峰值流速增加、炎癥細胞浸潤、膠原纖維排列紊亂等病理改變[20]；Schreier 等[21]還觀察到 EGFR 敲除小鼠心肌內小動脈呈現擴張表型，主動脈的壁/腔比值顯著降低，中膜厚度減小但該差異未達到統計學意義。含有 Ras 相關和 Pleckstrin 同源結構域的蛋白質 1 （ras-associated and pleckstrin homology domains-containing protein 1，RAPH1）在肌動蛋白細胞骨架的組裝、免疫細胞趨化作用、響應細胞外基質剛度的改變并調節細胞周期蛋白表達和細胞增殖中發揮重要作用[22-24]。有趣的是，RAPH1 也參與調節 EGFR 的內吞[25]。細胞周期蛋白 B3（cyclin B3，CCNB3）參與調控細胞有絲分裂及減數分裂[26]。CD3ε 亞基（CD3-epsilon，CD3E）參與 T 細胞受體（T-cell receptor，TCR）-CD3 復合物構成，介導 T 細胞活化及 TCR 信號轉導，同時它含有內吞序列，有助于 TCR 受體的內化和下調[27-28]。P110 催化亞基與由磷酸肌醇-3-激酶調節亞基 5（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 5，PIK3R5）編碼的 P101 調節亞基共同構成異二聚體即磷酸肌醇-3 激酶 γ，在炎癥、細胞遷移、心臟功能、腫瘤進展中起關鍵作用[29-30]。腫瘤蛋白 P73（tumor protein P73，TP73）是 p53 家族的一員，可通過調節血管內皮生長因子及轉化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）調控內皮細胞分化、遷移及血管生成[31]，但其在血管生成中的作用存在爭議[32]。作為調節細胞黏附和肌動蛋白細胞骨架動力學的中心樞紐之一，TP73 還參與調控 NOTCH 信號轉導[33-34]。在本研究中 BAV 合并主動脈擴張組中 TP73 表達下調，文獻報道 TAp73 缺失在降低細胞腺苷三磷酸水平及線粒體復合物Ⅳ活性的同時增加了活性氧產生、加速衰老進程[35]，而氧化應激和衰老也是 BAV 合并升主動脈擴張的關鍵病理機制[36-37]。P21 (RAC1)活化激酶 3［P21 (RAC1) activated kinase 3，PAK3］可以通過 TGF-β/smad 信號通路調節內皮間質轉分化相關分子的表達[38]。AGAP2 是 Arf GAP 蛋白（ADP 核糖基化因子 GTP 酶激活蛋白）家族的成員，參與受體運輸和再循環（包括 TGF-β 受體、β2-腎上腺素能受體等），以及調節黏著斑重塑和細胞與細胞外基質間信號傳導[39-41]。同時 AGAP2 與絲氨酸/蘇氨酸激酶特異性結合，并以 GTP 依賴的方式上調其激酶活性[42]。調節突觸膜胞吐作用蛋白 2（regulating synaptic membrane exocytosis 2，RIMS2）、DLG 相關蛋白 2（DLG associated protein 2，DLGAP2）主要在調節突觸形態及功能、神經系統疾病發生發展中發揮作用[43-44]，在心血管系統中的作用有待進一步探究。
本研究 GSEA 顯示，與 BAV 合并升主動脈擴張相關的通路顯著富集于免疫炎癥（細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路及 T 細胞受體信號通路等）、肌動蛋白細胞骨架調節、黏著斑、MAPK 信號通路、酪氨酸蛋白激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號通路、WNT 信號通路等。其中多條通路已經實驗證實[37, 45]，這也從側面反映了生物信息學分析方法在疾病機制探索中具有巨大應用價值。
本研究利用 CIBERSORT 反卷積算法計算了免疫細胞在主動脈組織中的浸潤比例，結果顯示活化自然殺傷細胞在 BAV 患者擴張的升主動脈組織中顯著浸潤。有研究表明腹主動脈瘤患者外周血中自然殺傷細胞比例及活性均增加[46]，結合本研究分析結果，推測活化自然殺傷細胞在 BAV 合并主動脈擴張中發揮關鍵作用。
本研究的局限：① 本研究是對 GEO 數據庫中已發布數據集的二次分析，且納入樣本量有限，或導致數據分析偏倚；② 本研究生物信息分析結果有待進一步實驗驗證；③ 不同的 BAV 瓣膜類型合并主動脈擴張的機制可能不同，因缺乏原始 BAV 分類信息，本研究未涉及相關分析，有待進一步探索。
綜上，本研究用生物信息學方法篩選出與 BAV 合并升主動脈擴張相關的關鍵基因及信號通路，可加深對其分子機制的理解，為臨床診療提供新思路。
圖7
Hub 基因 GO 富集分析結果
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
