引用本文： 吳石凱, 肖玉玲, 衛麗, 何燕玲, 王成成, 吳文靜, 文虹霞, 劉露, 唐光敏, 宗志勇. 耐碳青霉烯類腸桿菌屬細菌的抗菌藥物耐藥性及氨曲南聯合阿維巴坦體外殺菌試驗研究. 華西醫學, 2023, 38(3): 364-369. doi: 10.7507/1002-0179.202301099 復制
抗菌藥物耐藥是世界衛生組織 2021 年發布的十大全球亟需關注的健康問題之一，其中耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的流行給臨床上抗菌藥物選擇和患者治療帶來極大挑戰[1-2]。2022 年中國細菌耐藥監測網顯示，腸桿菌科中的腸桿菌屬細菌對碳青霉烯的耐藥率為 9.7%～12.5%。在我國，新德里金屬β-內酰胺酶是耐碳青霉烯類腸桿菌屬細菌（carbapenem-resistant Enterobacter spp., CREn）中最常見的碳青霉烯酶[3]。新德里金屬β-內酰胺酶能水解除單環類（氨曲南）外的所有臨床用 β-內酰胺類抗菌藥物，且不被目前臨床用的各種β-內酰胺酶抑制劑抑制[4]。CREn 又常同時產水解氨曲南的其他β-內酰胺酶（絲氨酸酶），因此單用氨曲南難以對抗產金屬酶的 CREn[5]。阿維巴坦是新近批準上市的新型β-內酰胺酶抑制劑，能有效抑制除金屬酶外的其他β-內酰胺酶（絲氨酸酶），保護氨曲南不被水解[6]。頭孢他啶與阿維巴坦的組合已在臨床使用，而目前氨曲南-阿維巴坦這一組合尚在臨床試驗階段[7]。本研究通過分析四川大學華西醫院（以下簡稱“華西醫院”）6 年內分離的 CREn 菌株的抗菌藥物敏感性（藥敏）結果并進行體外殺菌試驗，了解 CREn 的臨床分布、對各類常用抗菌藥物的耐藥情況，并對比測試目前臨床常用的多黏菌素與新的抗菌藥物酶抑制劑組合（氨曲南聯合阿維巴坦）對 CREn 的殺菌作用，為臨床治療提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 菌株來源
菌株來源為華西醫院 2016 年－2021 年自臨床分離且鑒定為 CREn 的菌株。藥敏質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）購自美國標準培養中心（American Type Culture Center）。
1.2 試劑和儀器
抗菌藥物：美羅培南、厄他培南、多黏菌素 E、氨曲南、阿維巴坦（大連美侖生物技術有限公司）和亞胺培南（北京索萊寶科技有限公司）。培養基和試劑： CHROMagar 尿路菌群定位顯色培養基（法國生物梅里埃股份有限公司）、Luria-Bertani 瓊脂及陽離子調節肉湯（青島海博生物技術有限公司）和 Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。儀器和耗材：96 孔細胞培養板（美國康寧公司）、TU-10 型號恒溫金屬浴器（上海一恒科學儀器有限公司）、T100 型號 PCR 儀（美國 BIO-RAD 公司）、Vitek Ⅱ全自動微生物生化鑒定儀（法國生物梅里埃股份有限公司）、SPX 型號醫用生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）和 MDF-86V588E 型號超低溫冰箱（安徽中科都菱商用電器股份有限公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 菌種鑒定
對細菌看家基因 gyrB（編碼 DNA 促旋酶 B 亞基）進行擴增測序以鑒定菌種[8]。挑取過夜培養生長的單菌落于 50 μL 雙蒸水中，恒溫金屬浴器 100℃ 12 min，12000 r/min 離心后取上層清液用作 PCR 模板。gyrB 基因 PCR 正向引物 UP-1S（5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’）及反向引物 UP-2Sr（5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’）[8]由生工生物工程（成都）有限公司合成。PCR 反應循環條件：94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 90 s。PCR 產物送同一公司進行 Sanger 雙向測序，結果用 Sequence Scanner v1.0 軟件查看。正反雙向測序結果拼接后在美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information）網站和腸桿菌屬各菌種模式菌株（type strain）的 gyrB 基因進行比對，以相似度（identity）≥97%中相似度最高的菌株作為菌種鑒定結果[9]。最終鑒定菌種的模式菌株和基因庫（GenBank）接入號：香坊腸桿菌（Enterobacter xiangfangensis, CP017183.1）、霍夫曼腸桿菌（Enterobacter hoffmannii, CP017186.1）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae, CP056776.1）、成都腸桿菌（Enterobacter chengduensis, CP043318.1）、神戶腸桿菌（Enterobacter kobei, CP017181.1）、布干達腸桿菌（Enterobacter bugandensis, LT992502.1）以及尚無中文菌種名稱的 Enterobacter dykesii（VTTY01000013.1）和 Enterobacter soli（LXES01000018.1）。
1.3.2 相關臨床信息收集
CREn 菌株的臨床標本信息和相關患者的科室分布信息由醫院信息系統導出。本研究獲華西醫院倫理委員會批準［2022 年審（1519）號］，僅涉及分析菌株和臨床科室分布，不涉及患者其他信息和任何干預，華西醫院倫理委員會同意豁免知情同意書。
1.3.3 藥敏試驗
對 CREn 進行 3 種目前國內臨床常用的碳青霉烯類、多黏菌素 E 及氨曲南-阿維巴坦的藥敏試驗。用 Vitek Ⅱ系統進行臨床菌株的初步藥敏試驗，即用微量肉湯稀釋法測定抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC），但其所測濃度只包含判讀為耐藥、中介和敏感的 3 個 MIC 范圍（如 MIC≥16 μg/mL和≤2 μg/mL ）。因此，還使用美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的標準微量肉湯稀釋法測定 3 種碳青霉烯類（厄他培南、亞胺培南和美羅培南）、氨曲南-阿維巴坦、多黏菌素 E 的 MIC ，以確認菌株確為碳青霉烯類耐藥和對 2 種 CREn 主要治療用藥（氨曲南-阿維巴坦與多黏菌素）的敏感性。參照 CLSI 推薦方法[10-11]進行微量肉湯稀釋法測定并解讀。對于氨曲南-阿維巴坦，阿維巴坦的終濃度固定在 4 μg/mL。因 CLSI 尚未給出氨曲南-阿維巴坦判斷的標準，按照 CLSI 中氨曲南的標準（≤4 μg/mL 敏感，8 μg/mL 中介，≥16 μg/mL 耐藥）對氨曲南-阿維巴坦進行藥敏結果判讀[12]。CLSI 標準中多黏菌素 E 的 MIC≥4 μg/mL 為耐藥，≤2 μg/mL 為中介，無敏感分類[10]。此外，因 CLSI 未給出替加環素的判斷標準，參照美國食品藥品監督管理局的判斷標準（≤2 μg/mL 敏感，≥8 μg/mL 耐藥）對 Vitek Ⅱ系統的替加環素結果進行判斷。
1.3.4 體外殺菌試驗
選取均來自痰標本的多黏菌素耐藥及中介的 CREn 菌株各一株，其菌株編號分別為 020122（菌種為 Enterobacter dykesii，多黏菌素耐藥）和 020038（菌種為香坊腸桿菌，多黏菌素中介）。參照 CLSI 文件 M26-A 標準及相關文獻報道進行多黏菌素 E 和氨曲南-阿維巴坦的體外殺菌試驗[11, 13]。
過夜培養菌液比濁至 0.5 麥氏濁度（McFaland），以 1∶1000 加入 10 mL CAMHB 肉湯中，依據測定的氨曲南-阿維巴坦 MIC 加入終濃度為 1×MIC、2×MIC、4×MIC 的氨曲南，阿維巴坦的終濃度固定為 4 μg/mL。參照多黏菌素 E 的平均穩態血藥濃度 1.27 μg/mL[14]和 CLSI 2022 版對多黏菌素 E 判斷的折點[10]，選取多黏菌素 E 的 3 個濃度即 1 μg/mL（中介）、2 μg/mL（中介）和 4 μg/mL（耐藥），進行多黏菌素 E 殺菌試驗。以未加抗菌藥物的一管菌液作為對照組，通過瓊脂傾注法以 0、2、4、8、12 及 24 h 為時間間隔進行體外殺菌試驗。兩種抗菌藥物每個濃度、每個時刻均進行 3 個技術重復。37℃培養 18 h 后分別統計不同時刻的菌落數，并繪制時間-殺菌曲線。菌量下降≥3 log10 CFU/mL 時判定為該濃度的抗菌藥物有殺菌效果[13]。
2 結果
2.1 CREn 鑒定結果及相關臨床信息
共納入 110 株 CREn 臨床菌株。其菌種分布為：香坊腸桿菌 91 株，霍夫曼腸桿菌 11 株，陰溝腸桿菌 2 株，Enterobacter dykesii 2 株，另有成都腸桿菌、神戶腸桿菌、布干達腸桿菌和 Enterobacter soli 各 1 株。2 株 Enterobacter dykesii 和 1 株 Enterobacter soli 的 gyrB基因與腸桿菌屬模式菌株 gyrB 相似度分別為 97.84%、97.30%及 97.97%，其余菌株相似度> 98%。
臨床科室分布顯示，CREn 最多的 5 個科室為重癥監護病房（30 株，27.27%）、心臟外科（13 株，11.82%）、呼吸內科（9 株，8.18%）、骨科（7 株，6.36%）及急診科（7 株，6.36%）。呼吸道來源的標本占比超過 40%（45 株，40.91%），其次是血液（28 株，25.45%）、尿液（15 株，13.64%）、分泌物（12 株，10.91%）及其他（10 株，9.09%）。
2.2 CREn 藥敏結果
Vitek Ⅱ藥敏結果見表1。CREn 對β-內酰胺類、喹諾酮類、磺胺類等抗菌藥物的耐藥率均超過 70%，僅有氨基糖苷類的阿米卡星（7.00%）和四環素類的替加環素（4.90%）耐藥率低于 10%。
表1
110 株 CREn 臨床菌株的 Vitek Ⅱ抗菌藥物藥敏結果
藥敏試驗顯示，所有菌株對 3 種碳青霉烯類藥物均耐藥（美羅培南和亞胺培南 MIC≥4 μg/mL，厄他培南 MIC≥2 μg/mL）且大多為高水平耐藥（MIC≥16 μg/ml）。高水平耐藥菌株數：亞胺培南 96 株（87.27%），美羅培南 103 株（93.64%），厄他培南 108 株（98.18%）。有 26 株 CREn 的多黏菌素 E MIC≥4 μg/mL（耐藥），耐藥率 23.64%，其余均中介。氨曲南-阿維巴坦僅 1 株 MIC=8 μg/mL（中介），其余 MIC 均≤2 μg/mL（敏感），未發現對其耐藥的菌株（耐藥率為 0）。
2.3 CREn 時間-殺菌曲線
多黏菌素耐藥菌株 020122（Enterobacter dykesii，多黏菌素 E MIC 32 μg/mL，氨曲南-阿維巴坦 MIC 0.25/4 μg/mL）和多黏菌素中介菌株 020038（香坊腸桿菌，多黏菌素 E MIC 1 μg/mL，氨曲南-阿維巴坦 MIC 1/4 μg/mL）的時間-殺菌曲線結果見圖1。
圖1
時間-殺菌曲線
020038：多黏菌素中介 CREn 臨床菌株；020122：多黏菌素耐藥 CREn 臨床菌株。ATM：氨曲南，AVI：阿維巴坦，COL：多黏菌素 E，對照組：未加抗菌藥物的菌液。藥物后面的數字為終濃度（μg/mL），例如 ATM 0.25/AVI 4 代表 0.25 μg/mL 氨曲南和 4 μg/mL 阿維巴坦；COL 1 代表1 μg/mL 多黏菌素 E
多黏菌素中介菌株 020038 在氨曲南-阿維巴坦濃度為 1×MIC 組中，菌量在 8 h 內隨時間緩慢下降約 3 log10 CFU/mL，隨后開始上升，24 h 上升至約 6 log10 CFU/mL。在氨曲南-阿維巴坦濃度為 2×MIC 及 4×MIC 組中，菌量隨時間呈緩慢下降趨勢（曲線無反彈），下降幅度與藥物濃度無明顯關聯，12 h 均下降約 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 濃度為 1、2 和 4 μg/mL 時，2 h 內均能使 020038 的菌量下降 5 log10 CFU/mL 左右，直到 24 h 菌量均未出現反彈。
多黏菌素耐藥菌株 020122 在氨曲南-阿維巴坦濃度為 1～4 倍 MIC 時菌量隨時間緩慢下降（無反彈），24 h 均下降約 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 無論 1、2、4 μg/mL，菌量在 2 h 內下降約 3 log10 CFU/mL ，隨后均出現反彈，然后迅速上升，24 h 上升至對照組水平，與其多黏菌素耐藥的表型一致。
對多黏菌素中介菌株，多黏菌素相比氨曲南-阿維巴坦能在更短時間內達到殺菌效果（圖1），但無論菌株是否對多黏菌素耐藥，2 μg/mL 的氨曲南-阿維巴坦在 24 h 的殺菌率均能超過 99%。
3 討論
腸桿菌屬細菌是醫院感染的常見病原體，也是腸桿菌科細菌中僅次于埃希菌屬和克雷伯菌屬的第三常見菌屬[3]。本研究中，腸桿菌屬細菌的呼吸道來源樣本最多，與其他報道一致[15]。重癥監護病房是分離 CREn 最多的科室，因此臨床工作中需注意病房環境、人員儀器是否存在 CREn 潛伏的“儲存庫”。
我國流行的腸桿菌屬細菌因其多產金屬酶而對碳青霉烯類耐藥[16-17]，如何治療 CREn 所致感染已成為臨床難點[18]。本研究中，華西醫院 6 年內分離的所有 CREn 藥敏結果顯示其對臨床常用的大多數種類的抗菌藥物耐藥率都很高，僅少數耐藥率低于 10%，可選藥物十分有限。其中臨床常用的治療藥物多黏菌素 E 的耐藥率達 23.64%，并且可能存在異質性耐藥菌株使患者治療效果同體外藥敏結果不一致[3]。而阿米卡星和替加環素雖耐藥率較低，但與多黏菌素一樣因嚴重副作用、適應證局限性或治療效果不確切而未被美國感染病學會和歐洲臨床微生物與感染性疾病學會指南推薦用于產金屬酶的革蘭陰性桿菌所致嚴重感染[19-20]。
氨曲南-阿維巴坦是目前正在進行 3 期臨床試驗的新抗菌藥物-酶抑制劑組合，氨曲南對金屬酶穩定，而阿維巴坦可抑制其他絲氨酸類β-內酰胺酶以保護氨曲南不被水解[21]，因此這一組合被視為對抗耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的有效方案。歐美指南均推薦使用已用于臨床的頭孢他啶-阿維巴坦聯合氨曲南，以實現事實上的氨曲南-阿維巴坦來治療產金屬酶的腸桿菌科細菌所致嚴重感染[19-20]。研究表明氨曲南-阿維巴坦對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）有優秀的體外抗菌活性[21-22]，臨床研究也發現氨曲南-阿維巴坦治療產金屬酶 CRE 感染的患者相比傳統藥物有更高的臨床緩解率和更低的死亡率[23]。本研究中，對 CREn 的藥敏結果顯示其對氨曲南-阿維巴坦的敏感率超過 99%，而對多黏菌素的耐藥率達到 23.64%。因此，相比多黏菌素，選擇氨曲南-阿維巴坦治療產金屬酶 CRE 感染更可能使患者獲益，尤其是多黏菌素耐藥菌株所致感染。本研究中，對多黏菌素耐藥的 CREn 臨床菌株的殺菌試驗顯示，2 μg/mL（小于治療濃度及敏感的折點濃度 4 μg/mL）的氨曲南-阿維巴坦對多黏菌素耐藥菌株即有殺菌活性，可用于多黏菌素耐藥菌株的治療。對多黏菌素中介的 CREn 菌株，治療濃度的氨曲南-阿維巴坦和多黏菌素 E（2 μg/mL，也是其判讀為中介的折點濃度）都具有殺菌作用，但氨曲南-阿維巴坦達到殺菌效果的時間要長于多黏菌素 E。這提示多黏菌素對其中介的菌株有殺菌作用，臨床治療可能有效。研究表明氨曲南聯合阿維巴坦對產新德里金屬β-內酰胺酶的腸桿菌科細菌殺菌作用良好，時間-殺菌曲線顯示菌量下降超過 3 log10 CFU/mL 后在 24 h 內無明顯反彈[24]，而部分多黏菌素敏感的腸桿菌屬細菌應用多黏菌素菌量降為 0 之后的 24 h 內菌量可再次上升至對照組水平[25]。
與 CLSI 標準中僅有中介和耐藥而沒有敏感分類不同，歐洲抗菌藥敏試驗委員會對多黏菌素保留了敏感這一分類（MIC≤2 μg/mL）。因此在治療產金屬酶的 CREn 所致感染時，多黏菌素仍有其價值。尤其是雖然本研究中并未發現對氨曲南-阿維巴坦耐藥的 CREn 菌株，但此種耐藥菌已有報道[12, 26-27]。因此，氨曲南-阿維巴坦和多黏菌素作為治療 CREn 的 2 種選擇時，若 CREn 對其中一種藥物耐藥或療效不佳，則另一種可作為替代選擇。值得注意的是，氨曲南為β-內酰胺類，是時間依賴性抗菌藥物。體外殺菌試驗也表明 1×MIC 濃度的氨曲南-阿維巴坦作用下 8 h 有菌株的菌量出現反彈，提示至少需要每 8 小時給藥一次。
本研究也存在一些局限性：① 相應菌株尚未行進一步深度測序分析；② 殺菌快慢僅為觀察性研究結果，尚需納入更多菌株進行統計學分析得出更為可靠的結論；③ 還缺少體內試驗的相應結果來進一步說明多黏菌素和氨曲南-阿維巴坦的優劣。
綜上，CREn 最常見于呼吸道樣本中，重癥監護病房是分離最多的科室。藥敏結果顯示 CREn 對多黏菌素有約 1/4 的耐藥率，但其對氨曲南-阿維巴坦的敏感率接近 100%。多黏菌素相比氨曲南-阿維巴坦更快達到殺菌效果，但無法抑制耐藥菌株的生長。氨曲南-阿維巴坦在 24 h 內對多黏菌素中介或敏感的 CREn 殺菌率超過 99%，提示臨床上在治療 CREn 所致感染時可首選氨曲南-阿維巴坦。多黏菌素 E 對其中介的 CREn 菌株也有殺菌作用，但考慮到不良反應，可以作為對多黏菌素中介菌株所致感染的替代選擇。總之，本研究為治療 CREn 所致臨床感染的藥物選擇提供了體外試驗證據，但尚需更多體內試驗及臨床研究予以驗證。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
抗菌藥物耐藥是世界衛生組織 2021 年發布的十大全球亟需關注的健康問題之一，其中耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的流行給臨床上抗菌藥物選擇和患者治療帶來極大挑戰[1-2]。2022 年中國細菌耐藥監測網顯示，腸桿菌科中的腸桿菌屬細菌對碳青霉烯的耐藥率為 9.7%～12.5%。在我國，新德里金屬β-內酰胺酶是耐碳青霉烯類腸桿菌屬細菌（carbapenem-resistant Enterobacter spp., CREn）中最常見的碳青霉烯酶[3]。新德里金屬β-內酰胺酶能水解除單環類（氨曲南）外的所有臨床用 β-內酰胺類抗菌藥物，且不被目前臨床用的各種β-內酰胺酶抑制劑抑制[4]。CREn 又常同時產水解氨曲南的其他β-內酰胺酶（絲氨酸酶），因此單用氨曲南難以對抗產金屬酶的 CREn[5]。阿維巴坦是新近批準上市的新型β-內酰胺酶抑制劑，能有效抑制除金屬酶外的其他β-內酰胺酶（絲氨酸酶），保護氨曲南不被水解[6]。頭孢他啶與阿維巴坦的組合已在臨床使用，而目前氨曲南-阿維巴坦這一組合尚在臨床試驗階段[7]。本研究通過分析四川大學華西醫院（以下簡稱“華西醫院”）6 年內分離的 CREn 菌株的抗菌藥物敏感性（藥敏）結果并進行體外殺菌試驗，了解 CREn 的臨床分布、對各類常用抗菌藥物的耐藥情況，并對比測試目前臨床常用的多黏菌素與新的抗菌藥物酶抑制劑組合（氨曲南聯合阿維巴坦）對 CREn 的殺菌作用，為臨床治療提供理論支持。
1 材料與方法
1.1 菌株來源
菌株來源為華西醫院 2016 年－2021 年自臨床分離且鑒定為 CREn 的菌株。藥敏質控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）購自美國標準培養中心（American Type Culture Center）。
1.2 試劑和儀器
抗菌藥物：美羅培南、厄他培南、多黏菌素 E、氨曲南、阿維巴坦（大連美侖生物技術有限公司）和亞胺培南（北京索萊寶科技有限公司）。培養基和試劑： CHROMagar 尿路菌群定位顯色培養基（法國生物梅里埃股份有限公司）、Luria-Bertani 瓊脂及陽離子調節肉湯（青島海博生物技術有限公司）和 Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。儀器和耗材：96 孔細胞培養板（美國康寧公司）、TU-10 型號恒溫金屬浴器（上海一恒科學儀器有限公司）、T100 型號 PCR 儀（美國 BIO-RAD 公司）、Vitek Ⅱ全自動微生物生化鑒定儀（法國生物梅里埃股份有限公司）、SPX 型號醫用生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）和 MDF-86V588E 型號超低溫冰箱（安徽中科都菱商用電器股份有限公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 菌種鑒定
對細菌看家基因 gyrB（編碼 DNA 促旋酶 B 亞基）進行擴增測序以鑒定菌種[8]。挑取過夜培養生長的單菌落于 50 μL 雙蒸水中，恒溫金屬浴器 100℃ 12 min，12000 r/min 離心后取上層清液用作 PCR 模板。gyrB 基因 PCR 正向引物 UP-1S（5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’）及反向引物 UP-2Sr（5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’）[8]由生工生物工程（成都）有限公司合成。PCR 反應循環條件：94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 90 s。PCR 產物送同一公司進行 Sanger 雙向測序，結果用 Sequence Scanner v1.0 軟件查看。正反雙向測序結果拼接后在美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information）網站和腸桿菌屬各菌種模式菌株（type strain）的 gyrB 基因進行比對，以相似度（identity）≥97%中相似度最高的菌株作為菌種鑒定結果[9]。最終鑒定菌種的模式菌株和基因庫（GenBank）接入號：香坊腸桿菌（Enterobacter xiangfangensis, CP017183.1）、霍夫曼腸桿菌（Enterobacter hoffmannii, CP017186.1）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae, CP056776.1）、成都腸桿菌（Enterobacter chengduensis, CP043318.1）、神戶腸桿菌（Enterobacter kobei, CP017181.1）、布干達腸桿菌（Enterobacter bugandensis, LT992502.1）以及尚無中文菌種名稱的 Enterobacter dykesii（VTTY01000013.1）和 Enterobacter soli（LXES01000018.1）。
1.3.2 相關臨床信息收集
CREn 菌株的臨床標本信息和相關患者的科室分布信息由醫院信息系統導出。本研究獲華西醫院倫理委員會批準［2022 年審（1519）號］，僅涉及分析菌株和臨床科室分布，不涉及患者其他信息和任何干預，華西醫院倫理委員會同意豁免知情同意書。
1.3.3 藥敏試驗
對 CREn 進行 3 種目前國內臨床常用的碳青霉烯類、多黏菌素 E 及氨曲南-阿維巴坦的藥敏試驗。用 Vitek Ⅱ系統進行臨床菌株的初步藥敏試驗，即用微量肉湯稀釋法測定抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC），但其所測濃度只包含判讀為耐藥、中介和敏感的 3 個 MIC 范圍（如 MIC≥16 μg/mL和≤2 μg/mL ）。因此，還使用美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）推薦的標準微量肉湯稀釋法測定 3 種碳青霉烯類（厄他培南、亞胺培南和美羅培南）、氨曲南-阿維巴坦、多黏菌素 E 的 MIC ，以確認菌株確為碳青霉烯類耐藥和對 2 種 CREn 主要治療用藥（氨曲南-阿維巴坦與多黏菌素）的敏感性。參照 CLSI 推薦方法[10-11]進行微量肉湯稀釋法測定并解讀。對于氨曲南-阿維巴坦，阿維巴坦的終濃度固定在 4 μg/mL。因 CLSI 尚未給出氨曲南-阿維巴坦判斷的標準，按照 CLSI 中氨曲南的標準（≤4 μg/mL 敏感，8 μg/mL 中介，≥16 μg/mL 耐藥）對氨曲南-阿維巴坦進行藥敏結果判讀[12]。CLSI 標準中多黏菌素 E 的 MIC≥4 μg/mL 為耐藥，≤2 μg/mL 為中介，無敏感分類[10]。此外，因 CLSI 未給出替加環素的判斷標準，參照美國食品藥品監督管理局的判斷標準（≤2 μg/mL 敏感，≥8 μg/mL 耐藥）對 Vitek Ⅱ系統的替加環素結果進行判斷。
1.3.4 體外殺菌試驗
選取均來自痰標本的多黏菌素耐藥及中介的 CREn 菌株各一株，其菌株編號分別為 020122（菌種為 Enterobacter dykesii，多黏菌素耐藥）和 020038（菌種為香坊腸桿菌，多黏菌素中介）。參照 CLSI 文件 M26-A 標準及相關文獻報道進行多黏菌素 E 和氨曲南-阿維巴坦的體外殺菌試驗[11, 13]。
過夜培養菌液比濁至 0.5 麥氏濁度（McFaland），以 1∶1000 加入 10 mL CAMHB 肉湯中，依據測定的氨曲南-阿維巴坦 MIC 加入終濃度為 1×MIC、2×MIC、4×MIC 的氨曲南，阿維巴坦的終濃度固定為 4 μg/mL。參照多黏菌素 E 的平均穩態血藥濃度 1.27 μg/mL[14]和 CLSI 2022 版對多黏菌素 E 判斷的折點[10]，選取多黏菌素 E 的 3 個濃度即 1 μg/mL（中介）、2 μg/mL（中介）和 4 μg/mL（耐藥），進行多黏菌素 E 殺菌試驗。以未加抗菌藥物的一管菌液作為對照組，通過瓊脂傾注法以 0、2、4、8、12 及 24 h 為時間間隔進行體外殺菌試驗。兩種抗菌藥物每個濃度、每個時刻均進行 3 個技術重復。37℃培養 18 h 后分別統計不同時刻的菌落數，并繪制時間-殺菌曲線。菌量下降≥3 log10 CFU/mL 時判定為該濃度的抗菌藥物有殺菌效果[13]。
2 結果
2.1 CREn 鑒定結果及相關臨床信息
共納入 110 株 CREn 臨床菌株。其菌種分布為：香坊腸桿菌 91 株，霍夫曼腸桿菌 11 株，陰溝腸桿菌 2 株，Enterobacter dykesii 2 株，另有成都腸桿菌、神戶腸桿菌、布干達腸桿菌和 Enterobacter soli 各 1 株。2 株 Enterobacter dykesii 和 1 株 Enterobacter soli 的 gyrB基因與腸桿菌屬模式菌株 gyrB 相似度分別為 97.84%、97.30%及 97.97%，其余菌株相似度> 98%。
臨床科室分布顯示，CREn 最多的 5 個科室為重癥監護病房（30 株，27.27%）、心臟外科（13 株，11.82%）、呼吸內科（9 株，8.18%）、骨科（7 株，6.36%）及急診科（7 株，6.36%）。呼吸道來源的標本占比超過 40%（45 株，40.91%），其次是血液（28 株，25.45%）、尿液（15 株，13.64%）、分泌物（12 株，10.91%）及其他（10 株，9.09%）。
2.2 CREn 藥敏結果
Vitek Ⅱ藥敏結果見表1。CREn 對β-內酰胺類、喹諾酮類、磺胺類等抗菌藥物的耐藥率均超過 70%，僅有氨基糖苷類的阿米卡星（7.00%）和四環素類的替加環素（4.90%）耐藥率低于 10%。
表1
110 株 CREn 臨床菌株的 Vitek Ⅱ抗菌藥物藥敏結果
藥敏試驗顯示，所有菌株對 3 種碳青霉烯類藥物均耐藥（美羅培南和亞胺培南 MIC≥4 μg/mL，厄他培南 MIC≥2 μg/mL）且大多為高水平耐藥（MIC≥16 μg/ml）。高水平耐藥菌株數：亞胺培南 96 株（87.27%），美羅培南 103 株（93.64%），厄他培南 108 株（98.18%）。有 26 株 CREn 的多黏菌素 E MIC≥4 μg/mL（耐藥），耐藥率 23.64%，其余均中介。氨曲南-阿維巴坦僅 1 株 MIC=8 μg/mL（中介），其余 MIC 均≤2 μg/mL（敏感），未發現對其耐藥的菌株（耐藥率為 0）。
2.3 CREn 時間-殺菌曲線
多黏菌素耐藥菌株 020122（Enterobacter dykesii，多黏菌素 E MIC 32 μg/mL，氨曲南-阿維巴坦 MIC 0.25/4 μg/mL）和多黏菌素中介菌株 020038（香坊腸桿菌，多黏菌素 E MIC 1 μg/mL，氨曲南-阿維巴坦 MIC 1/4 μg/mL）的時間-殺菌曲線結果見圖1。
圖1
時間-殺菌曲線
020038：多黏菌素中介 CREn 臨床菌株；020122：多黏菌素耐藥 CREn 臨床菌株。ATM：氨曲南，AVI：阿維巴坦，COL：多黏菌素 E，對照組：未加抗菌藥物的菌液。藥物后面的數字為終濃度（μg/mL），例如 ATM 0.25/AVI 4 代表 0.25 μg/mL 氨曲南和 4 μg/mL 阿維巴坦；COL 1 代表1 μg/mL 多黏菌素 E
多黏菌素中介菌株 020038 在氨曲南-阿維巴坦濃度為 1×MIC 組中，菌量在 8 h 內隨時間緩慢下降約 3 log10 CFU/mL，隨后開始上升，24 h 上升至約 6 log10 CFU/mL。在氨曲南-阿維巴坦濃度為 2×MIC 及 4×MIC 組中，菌量隨時間呈緩慢下降趨勢（曲線無反彈），下降幅度與藥物濃度無明顯關聯，12 h 均下降約 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 濃度為 1、2 和 4 μg/mL 時，2 h 內均能使 020038 的菌量下降 5 log10 CFU/mL 左右，直到 24 h 菌量均未出現反彈。
多黏菌素耐藥菌株 020122 在氨曲南-阿維巴坦濃度為 1～4 倍 MIC 時菌量隨時間緩慢下降（無反彈），24 h 均下降約 5 log10 CFU/mL。而多黏菌素 E 無論 1、2、4 μg/mL，菌量在 2 h 內下降約 3 log10 CFU/mL ，隨后均出現反彈，然后迅速上升，24 h 上升至對照組水平，與其多黏菌素耐藥的表型一致。
對多黏菌素中介菌株，多黏菌素相比氨曲南-阿維巴坦能在更短時間內達到殺菌效果（圖1），但無論菌株是否對多黏菌素耐藥，2 μg/mL 的氨曲南-阿維巴坦在 24 h 的殺菌率均能超過 99%。
3 討論
腸桿菌屬細菌是醫院感染的常見病原體，也是腸桿菌科細菌中僅次于埃希菌屬和克雷伯菌屬的第三常見菌屬[3]。本研究中，腸桿菌屬細菌的呼吸道來源樣本最多，與其他報道一致[15]。重癥監護病房是分離 CREn 最多的科室，因此臨床工作中需注意病房環境、人員儀器是否存在 CREn 潛伏的“儲存庫”。
我國流行的腸桿菌屬細菌因其多產金屬酶而對碳青霉烯類耐藥[16-17]，如何治療 CREn 所致感染已成為臨床難點[18]。本研究中，華西醫院 6 年內分離的所有 CREn 藥敏結果顯示其對臨床常用的大多數種類的抗菌藥物耐藥率都很高，僅少數耐藥率低于 10%，可選藥物十分有限。其中臨床常用的治療藥物多黏菌素 E 的耐藥率達 23.64%，并且可能存在異質性耐藥菌株使患者治療效果同體外藥敏結果不一致[3]。而阿米卡星和替加環素雖耐藥率較低，但與多黏菌素一樣因嚴重副作用、適應證局限性或治療效果不確切而未被美國感染病學會和歐洲臨床微生物與感染性疾病學會指南推薦用于產金屬酶的革蘭陰性桿菌所致嚴重感染[19-20]。
氨曲南-阿維巴坦是目前正在進行 3 期臨床試驗的新抗菌藥物-酶抑制劑組合，氨曲南對金屬酶穩定，而阿維巴坦可抑制其他絲氨酸類β-內酰胺酶以保護氨曲南不被水解[21]，因此這一組合被視為對抗耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌的有效方案。歐美指南均推薦使用已用于臨床的頭孢他啶-阿維巴坦聯合氨曲南，以實現事實上的氨曲南-阿維巴坦來治療產金屬酶的腸桿菌科細菌所致嚴重感染[19-20]。研究表明氨曲南-阿維巴坦對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE）有優秀的體外抗菌活性[21-22]，臨床研究也發現氨曲南-阿維巴坦治療產金屬酶 CRE 感染的患者相比傳統藥物有更高的臨床緩解率和更低的死亡率[23]。本研究中，對 CREn 的藥敏結果顯示其對氨曲南-阿維巴坦的敏感率超過 99%，而對多黏菌素的耐藥率達到 23.64%。因此，相比多黏菌素，選擇氨曲南-阿維巴坦治療產金屬酶 CRE 感染更可能使患者獲益，尤其是多黏菌素耐藥菌株所致感染。本研究中，對多黏菌素耐藥的 CREn 臨床菌株的殺菌試驗顯示，2 μg/mL（小于治療濃度及敏感的折點濃度 4 μg/mL）的氨曲南-阿維巴坦對多黏菌素耐藥菌株即有殺菌活性，可用于多黏菌素耐藥菌株的治療。對多黏菌素中介的 CREn 菌株，治療濃度的氨曲南-阿維巴坦和多黏菌素 E（2 μg/mL，也是其判讀為中介的折點濃度）都具有殺菌作用，但氨曲南-阿維巴坦達到殺菌效果的時間要長于多黏菌素 E。這提示多黏菌素對其中介的菌株有殺菌作用，臨床治療可能有效。研究表明氨曲南聯合阿維巴坦對產新德里金屬β-內酰胺酶的腸桿菌科細菌殺菌作用良好，時間-殺菌曲線顯示菌量下降超過 3 log10 CFU/mL 后在 24 h 內無明顯反彈[24]，而部分多黏菌素敏感的腸桿菌屬細菌應用多黏菌素菌量降為 0 之后的 24 h 內菌量可再次上升至對照組水平[25]。
與 CLSI 標準中僅有中介和耐藥而沒有敏感分類不同，歐洲抗菌藥敏試驗委員會對多黏菌素保留了敏感這一分類（MIC≤2 μg/mL）。因此在治療產金屬酶的 CREn 所致感染時，多黏菌素仍有其價值。尤其是雖然本研究中并未發現對氨曲南-阿維巴坦耐藥的 CREn 菌株，但此種耐藥菌已有報道[12, 26-27]。因此，氨曲南-阿維巴坦和多黏菌素作為治療 CREn 的 2 種選擇時，若 CREn 對其中一種藥物耐藥或療效不佳，則另一種可作為替代選擇。值得注意的是，氨曲南為β-內酰胺類，是時間依賴性抗菌藥物。體外殺菌試驗也表明 1×MIC 濃度的氨曲南-阿維巴坦作用下 8 h 有菌株的菌量出現反彈，提示至少需要每 8 小時給藥一次。
本研究也存在一些局限性：① 相應菌株尚未行進一步深度測序分析；② 殺菌快慢僅為觀察性研究結果，尚需納入更多菌株進行統計學分析得出更為可靠的結論；③ 還缺少體內試驗的相應結果來進一步說明多黏菌素和氨曲南-阿維巴坦的優劣。
綜上，CREn 最常見于呼吸道樣本中，重癥監護病房是分離最多的科室。藥敏結果顯示 CREn 對多黏菌素有約 1/4 的耐藥率，但其對氨曲南-阿維巴坦的敏感率接近 100%。多黏菌素相比氨曲南-阿維巴坦更快達到殺菌效果，但無法抑制耐藥菌株的生長。氨曲南-阿維巴坦在 24 h 內對多黏菌素中介或敏感的 CREn 殺菌率超過 99%，提示臨床上在治療 CREn 所致感染時可首選氨曲南-阿維巴坦。多黏菌素 E 對其中介的 CREn 菌株也有殺菌作用，但考慮到不良反應，可以作為對多黏菌素中介菌株所致感染的替代選擇。總之，本研究為治療 CREn 所致臨床感染的藥物選擇提供了體外試驗證據，但尚需更多體內試驗及臨床研究予以驗證。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
