引用本文： 李潤欣, 劉華蔚, 鄢榮曾, 胡敏. 誘導多能干細胞體外分化為雪旺細胞的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2015, 29(12): 1560-1563. doi: 10.7507/1002-1892.20150332 復制
面神經缺損易造成患者永久性面癱及其他并發癥，目前神經缺損修復方法均存在一定不足，因此仍是臨床急需攻克的難題。研究證實，面神經缺損修復過程中，雪旺細胞發揮了重要作用[1-3]。在損傷的周圍神經處植入該細胞，能達到促進神經修復及再生的目的[4-5]。目前研究采用的雪旺細胞來源主要包括：① 自體細胞，但來源有限，且損傷供體神經；② 同種異體細胞，存在免疫排斥反應；③ 各類干細胞經誘導形成的雪旺細胞。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是向皮膚組織等細胞中導入特定基因或特定基因產物(蛋白質），使該體細胞重編程為具有多向分化潛能的干細胞。因其具有來源廣泛、全能性等優勢而備受關注。研究表明，在脊椎動物的胚胎期雪旺細胞由遷移的神經嵴細胞分化而來[6-7]。因此在iPS分化為雪旺細胞的研究中，均需將iPS先分化為神經嵴細胞或神經嵴干細胞。現對體內雪旺細胞發育形成的分子機制、iPS體外誘導分化為雪旺細胞的誘導方案以及對分化形成的雪旺細胞的鑒定和功能性檢測方法作一綜述，為相關研究提供參考。
1 體內雪旺細胞形成的分子機制
在脊椎動物的胚胎發育期，神經嵴細胞來源于神經管的背側[8]。神經外胚層的上皮細胞在多種信號通路（如Wnt、TGF、FGF、BMP）以及多種轉錄因子（如c-Myb、Sox9、Msx-1）的作用下發生上皮-間質轉化，這些信號通路間復雜的相互作用使轉錄網絡中關鍵的調節因子發揮作用，引發神經嵴細胞的分層和遷移[9-11]。在特定環境因素影響下，遷移的神經嵴細胞先發育成雪旺細胞前體，數日后轉化為未成熟的雪旺細胞，待動物出生時最終形成成熟的雪旺細胞。在雪旺細胞發育過程中有一些重要的轉錄因子，如Sox10、Egr2/Krox20、Pou3f1或Oct6等。Sox10 是重要的轉錄調節因子，其在遷移的神經嵴細胞及其衍生物如雪旺細胞中均表達[12]。研究表明，Sox10定點缺失會導致神經嵴細胞不能形成雪旺細胞前體；Sox10突變會導致體內的雪旺細胞不足；Sox10對髓鞘形成具有直接調節作用，并與Egr2/Krox20等其他基因具有協同作用[12-13]。Sox10 可直接激活Oct6的表達，使Oct6發揮對雪旺細胞分化及髓鞘形成的重要作用；Sox10 與Oct6、Brn2可以協同作用激活MSE (myelinating Schwann cell element)，進而利于髓鞘的形成[14]。通過多種轉錄因子的共同調控，使雪旺細胞正常發育及形成髓鞘。
神經嵴細胞向雪旺細胞的誘導分化、雪旺細胞的增殖以及雪旺細胞形成髓鞘的過程均需要一些基本調節因子的參與，如神經調節蛋白 1（neuregulin 1，NRG1）、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和層粘連蛋白 1。NRG1能限定神經嵴細胞向雪旺細胞的分化，影響雪旺細胞前體細胞的數量，并促進雪旺細胞的存活和增殖，在一定條件下還可促進雪旺細胞的形成。NRG1通過ERK和PI3-K信號通路刺激雪旺細胞的有絲分裂，并促進髓鞘形成，有效提高了cAMP的信號水平；而cAMP信號水平對于NRG1由增殖信號轉換為髓鞘分化信號的過程有重要作用，cAMP依靠細胞間的信號通路發揮作用[15]。增加細胞內cAMP含量，能夠協同NRG1刺激雪旺細胞增殖；降低NRG1濃度時，則表現為促進雪旺細胞存活[16]。研究表明，單獨使用cAMP 或NRG1均不能產生髓鞘分化形成的標記物，聯合使用時可以引起髓鞘標記蛋白 Krox-20 和P（0）的高度表達[15]。層粘連蛋白1是雪旺細胞分化和形成髓鞘必需的因子，實驗證實條件敲除雪旺細胞的層粘連蛋白1可減少PI3激酶信號，導致細胞凋亡增多，軸突受到損失，運動功能受限，神經再生能力受限；層粘連蛋白1通過p38促絲裂原激活蛋白激酶間接表達轉錄因子Egr2/Krox20和Sox10，可使髓鞘形成和雪旺細胞分化[17-18]。
從理論上說，如果可以模擬或滿足體內雪旺細胞胚胎發育形成時所需的環境因素和條件，就能誘導iPS分化獲得大量雪旺細胞。但目前對胚胎時期發育形成雪旺細胞的具體機制和所需各調節因子的確切作用尚不明確，有待進一步研究。
2 iPS誘導分化為雪旺細胞
iPS能以對稱分裂方式自我更新，在體外可形成擬胚體，并且將形成的擬胚體植入動物體內可形成畸胎瘤，證明其在合適條件下，擁有向三胚層細胞系分化的能力[19]。而神經嵴具有不穩定性、遷移性和多能性[20]。將iPS誘導分化為雪旺細胞，神經嵴的形成是至關重要的中間階段。
截至目前，國內尚無將iPS誘導分化為雪旺細胞的研究報道，國外的成功實驗也較少。2010年Lee等[20]分別采用MS5共培養系統和新型條件培養（NSB培養）系統來抑制iPS中BMP和TGF-β信號通路，從而使其分化為神經嵴細胞。其中，采用MS5共培養系統時會在分化的人多能干細胞(人iPS或人胚胎干細胞)中產生神經花環結構，最終通過睫狀神經營養因子、NRG、FGF-2和cAMP的誘導產生標記為GFAP+和p75+的雪旺細胞。
2011年Wang等[21]通過形成擬胚體和神經花環結構，將胚胎干細胞和iPS分別誘導為表達p75標記的神經嵴干細胞。該研究團隊采用7種iPS細胞系進行相同條件的誘導實驗，其中MRC5-IPS7和hFib2-iPS4細胞未能進行有效的細胞分化，而其余5 種iPS（BJ1-iPS1、ADAfE4-iPS38、ADAfE4-iPS38-2、dH1f-iPS2-2和MSC-iPS1）均能有效分化為神經嵴干細胞。經過睫狀神經營養因子、NRG1β和雙丁酰環磷腺苷聯合誘導產生了標記為GFAP+和S100-β+的雪旺細胞。但該實驗中誘導生成的雪旺細胞存活率較低。
Liu等[19, 22]的研究團隊通過在PA6（SDIA）間質細胞系條件培養基中添加FGF-2、Rock抑制劑和抗壞血酸，以促進人類iPS或胚胎干細胞向神經嵴干細胞的誘導分化。結果顯示從神經花環結構中遷移出的大部分細胞均標記為p75+，將細胞純化后，在含有NRG1β的Mensen PRORSTM培養基中培養40 d后成功分化為雪旺細胞。
Menendez等[23]在未采用間質細胞系條件培養基前提下，將人iPS誘導分化為神經嵴細胞，但未分化形成類雪旺細胞。Ma等[24]在無間質細胞系條件培養基前提下，將iPS分化為雪旺細胞；隨后，他們改進了實驗流程，在擬胚體形成后，使用化學成分明確的形態成型素聯合雙重SMAD（小分子SB435142、LDN-193189共同作用）抑制BMP和TGF-β信號，提高神經嵴形成效率，用層粘連蛋白平鋪培養皿，模擬體內微環境，但尚無具體實驗結果。
上述成功誘導出雪旺細胞的實驗中，采用的試劑和操作流程各不相同，神經嵴細胞及雪旺細胞誘導率也不同。Lee等[20]的實驗耗時最長，達139～164 d，他們先將iPS誘導分化為神經嵴細胞；而其余團隊均先將iPS誘導分化為神經嵴干細胞，之后再進一步分化為雪旺細胞。Wang等[21]報道的神經嵴干細胞誘導率相對較高，達80%～95%，但誘導出的雪旺細胞存活率低。而Liu等[19, 22]的實驗中，神經嵴干細胞誘導率相對較低，僅46%，但雪旺細胞誘導率相對較高，達78%～90%，并且該團隊首次將誘導生成的雪旺細胞進行了功能性驗證。綜合這兩個實驗團隊的方法是否可以提高神經嵴干細胞及雪旺細胞誘導效率，有待研究證實。此外，Liu等[19, 22]采用了間質細胞系條件培養基，該培養方式較難限定條件，易引入外源基因；而其余團隊通過形成擬胚體的形式來誘導分化，擬胚體形成的方法使細胞不均勻地分布在培養基中，導致難以控制細胞的分化，可能造成更高的異質性，但是因擬胚體形成的方法無異種基因污染，更適于臨床應用的發展。所以通過形成擬胚體的方式高效誘導出雪旺細胞將是臨床應用的重要研究方向。
3 雪旺細胞的鑒定和功能性檢驗
3.1 雪旺細胞的鑒定
在iPS向雪旺細胞分化過程中，通常采用倒置顯微鏡觀察神經嵴干細胞誘導前后形態的變化。神經嵴干細胞誘導前表現為多邊形單層細胞，當誘導后產生的細胞呈紡錘體樣時，則被認為是雪旺細胞樣形態[19]。
同時，要對誘導產生的神經嵴干細胞和誘導后產生的細胞進行免疫學鑒定。巢蛋白（nestin）是神經干細胞的標記物，神經嵴干細胞也表達此種蛋白；低親和力的NGF受體p75是神經細胞的表面標記物，在神經干細胞中不表達，但可表達于神經嵴干細胞和雪旺細胞前體[25-26]。S100-β是一種酸性鈣結合蛋白，膠質纖維酸性蛋白（glial fibrilla ry aci dic protein，GFAP）是一種中間絲蛋白，兩者均在雪旺細胞中大量表達，被公認為雪旺細胞的標記物，但中樞神經系統中的星形膠質細胞中也可標記為S100-β+、GFAP+。在誘導實驗中，只有當神經嵴細胞或神經嵴干細胞分化前通過免疫學鑒定可標記為p75+、HNK1+或nestin+，而分化形成的細胞可標記為S100-β+、GFAP+時，才能證實誘導分化的細胞不是星形膠質細胞，再結合形態學觀察顯示的紡錘體樣結構，則可證實誘導分化的細胞是雪旺細胞[20, 22, 27]。
此外，經RT-PCR分析顯示雪旺細胞標記p75、Sox9、EGF受體3和髓鞘質標記物如髓鞘堿性蛋白、鞘磷脂脂質蛋白1、外周髓鞘蛋白均為陽性，則進一步驗證了最終生成的細胞為成熟的雪旺細胞。
3.2 功能性檢驗
在目前檢索到的4個iPS誘導分化為雪旺細胞的研究團隊中，僅有Liu等[19, 22]對誘導產生的雪旺細胞進行了功能性檢測。其通過將雪旺細胞與大鼠胚胎的背根神經節感覺神經元共培養3周，可見雪旺細胞包裹了軸突束，表明分化產生的雪旺細胞能在體外使周圍神經的軸突形成髓鞘，從而證實了其具有一定功能性。
4 小結
目前將iPS誘導分化為雪旺細胞，均需經過神經嵴細胞或神經嵴干細胞的誘導分化階段。在成功的誘導實驗中，通常需要將神經嵴細胞或神經嵴干細胞以及最終誘導產生的細胞進行形態學觀察及免疫學鑒定來確定最終生成的是雪旺細胞。目前尚無將iPS誘導產生的雪旺細胞進行神經缺損修復的實驗研究。提高神經嵴的分化效率，獲得純度較高的神經嵴干細胞或神經嵴細胞，提高iPS誘導分化為雪旺細胞的效率以及提高雪旺細胞的純度，尋找更優化的iPS向雪旺細胞誘導分化的方法，均為目前研究重點。通過誘導獲得臨床級別的雪旺細胞也是解決面神經損傷修復這一難題的重要突破口。
面神經缺損易造成患者永久性面癱及其他并發癥，目前神經缺損修復方法均存在一定不足，因此仍是臨床急需攻克的難題。研究證實，面神經缺損修復過程中，雪旺細胞發揮了重要作用[1-3]。在損傷的周圍神經處植入該細胞，能達到促進神經修復及再生的目的[4-5]。目前研究采用的雪旺細胞來源主要包括：① 自體細胞，但來源有限，且損傷供體神經；② 同種異體細胞，存在免疫排斥反應；③ 各類干細胞經誘導形成的雪旺細胞。誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是向皮膚組織等細胞中導入特定基因或特定基因產物(蛋白質），使該體細胞重編程為具有多向分化潛能的干細胞。因其具有來源廣泛、全能性等優勢而備受關注。研究表明，在脊椎動物的胚胎期雪旺細胞由遷移的神經嵴細胞分化而來[6-7]。因此在iPS分化為雪旺細胞的研究中，均需將iPS先分化為神經嵴細胞或神經嵴干細胞。現對體內雪旺細胞發育形成的分子機制、iPS體外誘導分化為雪旺細胞的誘導方案以及對分化形成的雪旺細胞的鑒定和功能性檢測方法作一綜述，為相關研究提供參考。
1 體內雪旺細胞形成的分子機制
在脊椎動物的胚胎發育期，神經嵴細胞來源于神經管的背側[8]。神經外胚層的上皮細胞在多種信號通路（如Wnt、TGF、FGF、BMP）以及多種轉錄因子（如c-Myb、Sox9、Msx-1）的作用下發生上皮-間質轉化，這些信號通路間復雜的相互作用使轉錄網絡中關鍵的調節因子發揮作用，引發神經嵴細胞的分層和遷移[9-11]。在特定環境因素影響下，遷移的神經嵴細胞先發育成雪旺細胞前體，數日后轉化為未成熟的雪旺細胞，待動物出生時最終形成成熟的雪旺細胞。在雪旺細胞發育過程中有一些重要的轉錄因子，如Sox10、Egr2/Krox20、Pou3f1或Oct6等。Sox10 是重要的轉錄調節因子，其在遷移的神經嵴細胞及其衍生物如雪旺細胞中均表達[12]。研究表明，Sox10定點缺失會導致神經嵴細胞不能形成雪旺細胞前體；Sox10突變會導致體內的雪旺細胞不足；Sox10對髓鞘形成具有直接調節作用，并與Egr2/Krox20等其他基因具有協同作用[12-13]。Sox10 可直接激活Oct6的表達，使Oct6發揮對雪旺細胞分化及髓鞘形成的重要作用；Sox10 與Oct6、Brn2可以協同作用激活MSE (myelinating Schwann cell element)，進而利于髓鞘的形成[14]。通過多種轉錄因子的共同調控，使雪旺細胞正常發育及形成髓鞘。
神經嵴細胞向雪旺細胞的誘導分化、雪旺細胞的增殖以及雪旺細胞形成髓鞘的過程均需要一些基本調節因子的參與，如神經調節蛋白 1（neuregulin 1，NRG1）、環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和層粘連蛋白 1。NRG1能限定神經嵴細胞向雪旺細胞的分化，影響雪旺細胞前體細胞的數量，并促進雪旺細胞的存活和增殖，在一定條件下還可促進雪旺細胞的形成。NRG1通過ERK和PI3-K信號通路刺激雪旺細胞的有絲分裂，并促進髓鞘形成，有效提高了cAMP的信號水平；而cAMP信號水平對于NRG1由增殖信號轉換為髓鞘分化信號的過程有重要作用，cAMP依靠細胞間的信號通路發揮作用[15]。增加細胞內cAMP含量，能夠協同NRG1刺激雪旺細胞增殖；降低NRG1濃度時，則表現為促進雪旺細胞存活[16]。研究表明，單獨使用cAMP 或NRG1均不能產生髓鞘分化形成的標記物，聯合使用時可以引起髓鞘標記蛋白 Krox-20 和P（0）的高度表達[15]。層粘連蛋白1是雪旺細胞分化和形成髓鞘必需的因子，實驗證實條件敲除雪旺細胞的層粘連蛋白1可減少PI3激酶信號，導致細胞凋亡增多，軸突受到損失，運動功能受限，神經再生能力受限；層粘連蛋白1通過p38促絲裂原激活蛋白激酶間接表達轉錄因子Egr2/Krox20和Sox10，可使髓鞘形成和雪旺細胞分化[17-18]。
從理論上說，如果可以模擬或滿足體內雪旺細胞胚胎發育形成時所需的環境因素和條件，就能誘導iPS分化獲得大量雪旺細胞。但目前對胚胎時期發育形成雪旺細胞的具體機制和所需各調節因子的確切作用尚不明確，有待進一步研究。
2 iPS誘導分化為雪旺細胞
iPS能以對稱分裂方式自我更新，在體外可形成擬胚體，并且將形成的擬胚體植入動物體內可形成畸胎瘤，證明其在合適條件下，擁有向三胚層細胞系分化的能力[19]。而神經嵴具有不穩定性、遷移性和多能性[20]。將iPS誘導分化為雪旺細胞，神經嵴的形成是至關重要的中間階段。
截至目前，國內尚無將iPS誘導分化為雪旺細胞的研究報道，國外的成功實驗也較少。2010年Lee等[20]分別采用MS5共培養系統和新型條件培養（NSB培養）系統來抑制iPS中BMP和TGF-β信號通路，從而使其分化為神經嵴細胞。其中，采用MS5共培養系統時會在分化的人多能干細胞(人iPS或人胚胎干細胞)中產生神經花環結構，最終通過睫狀神經營養因子、NRG、FGF-2和cAMP的誘導產生標記為GFAP+和p75+的雪旺細胞。
2011年Wang等[21]通過形成擬胚體和神經花環結構，將胚胎干細胞和iPS分別誘導為表達p75標記的神經嵴干細胞。該研究團隊采用7種iPS細胞系進行相同條件的誘導實驗，其中MRC5-IPS7和hFib2-iPS4細胞未能進行有效的細胞分化，而其余5 種iPS（BJ1-iPS1、ADAfE4-iPS38、ADAfE4-iPS38-2、dH1f-iPS2-2和MSC-iPS1）均能有效分化為神經嵴干細胞。經過睫狀神經營養因子、NRG1β和雙丁酰環磷腺苷聯合誘導產生了標記為GFAP+和S100-β+的雪旺細胞。但該實驗中誘導生成的雪旺細胞存活率較低。
Liu等[19, 22]的研究團隊通過在PA6（SDIA）間質細胞系條件培養基中添加FGF-2、Rock抑制劑和抗壞血酸，以促進人類iPS或胚胎干細胞向神經嵴干細胞的誘導分化。結果顯示從神經花環結構中遷移出的大部分細胞均標記為p75+，將細胞純化后，在含有NRG1β的Mensen PRORSTM培養基中培養40 d后成功分化為雪旺細胞。
Menendez等[23]在未采用間質細胞系條件培養基前提下，將人iPS誘導分化為神經嵴細胞，但未分化形成類雪旺細胞。Ma等[24]在無間質細胞系條件培養基前提下，將iPS分化為雪旺細胞；隨后，他們改進了實驗流程，在擬胚體形成后，使用化學成分明確的形態成型素聯合雙重SMAD（小分子SB435142、LDN-193189共同作用）抑制BMP和TGF-β信號，提高神經嵴形成效率，用層粘連蛋白平鋪培養皿，模擬體內微環境，但尚無具體實驗結果。
上述成功誘導出雪旺細胞的實驗中，采用的試劑和操作流程各不相同，神經嵴細胞及雪旺細胞誘導率也不同。Lee等[20]的實驗耗時最長，達139～164 d，他們先將iPS誘導分化為神經嵴細胞；而其余團隊均先將iPS誘導分化為神經嵴干細胞，之后再進一步分化為雪旺細胞。Wang等[21]報道的神經嵴干細胞誘導率相對較高，達80%～95%，但誘導出的雪旺細胞存活率低。而Liu等[19, 22]的實驗中，神經嵴干細胞誘導率相對較低，僅46%，但雪旺細胞誘導率相對較高，達78%～90%，并且該團隊首次將誘導生成的雪旺細胞進行了功能性驗證。綜合這兩個實驗團隊的方法是否可以提高神經嵴干細胞及雪旺細胞誘導效率，有待研究證實。此外，Liu等[19, 22]采用了間質細胞系條件培養基，該培養方式較難限定條件，易引入外源基因；而其余團隊通過形成擬胚體的形式來誘導分化，擬胚體形成的方法使細胞不均勻地分布在培養基中，導致難以控制細胞的分化，可能造成更高的異質性，但是因擬胚體形成的方法無異種基因污染，更適于臨床應用的發展。所以通過形成擬胚體的方式高效誘導出雪旺細胞將是臨床應用的重要研究方向。
3 雪旺細胞的鑒定和功能性檢驗
3.1 雪旺細胞的鑒定
在iPS向雪旺細胞分化過程中，通常采用倒置顯微鏡觀察神經嵴干細胞誘導前后形態的變化。神經嵴干細胞誘導前表現為多邊形單層細胞，當誘導后產生的細胞呈紡錘體樣時，則被認為是雪旺細胞樣形態[19]。
同時，要對誘導產生的神經嵴干細胞和誘導后產生的細胞進行免疫學鑒定。巢蛋白（nestin）是神經干細胞的標記物，神經嵴干細胞也表達此種蛋白；低親和力的NGF受體p75是神經細胞的表面標記物，在神經干細胞中不表達，但可表達于神經嵴干細胞和雪旺細胞前體[25-26]。S100-β是一種酸性鈣結合蛋白，膠質纖維酸性蛋白（glial fibrilla ry aci dic protein，GFAP）是一種中間絲蛋白，兩者均在雪旺細胞中大量表達，被公認為雪旺細胞的標記物，但中樞神經系統中的星形膠質細胞中也可標記為S100-β+、GFAP+。在誘導實驗中，只有當神經嵴細胞或神經嵴干細胞分化前通過免疫學鑒定可標記為p75+、HNK1+或nestin+，而分化形成的細胞可標記為S100-β+、GFAP+時，才能證實誘導分化的細胞不是星形膠質細胞，再結合形態學觀察顯示的紡錘體樣結構，則可證實誘導分化的細胞是雪旺細胞[20, 22, 27]。
此外，經RT-PCR分析顯示雪旺細胞標記p75、Sox9、EGF受體3和髓鞘質標記物如髓鞘堿性蛋白、鞘磷脂脂質蛋白1、外周髓鞘蛋白均為陽性，則進一步驗證了最終生成的細胞為成熟的雪旺細胞。
3.2 功能性檢驗
在目前檢索到的4個iPS誘導分化為雪旺細胞的研究團隊中，僅有Liu等[19, 22]對誘導產生的雪旺細胞進行了功能性檢測。其通過將雪旺細胞與大鼠胚胎的背根神經節感覺神經元共培養3周，可見雪旺細胞包裹了軸突束，表明分化產生的雪旺細胞能在體外使周圍神經的軸突形成髓鞘，從而證實了其具有一定功能性。
4 小結
目前將iPS誘導分化為雪旺細胞，均需經過神經嵴細胞或神經嵴干細胞的誘導分化階段。在成功的誘導實驗中，通常需要將神經嵴細胞或神經嵴干細胞以及最終誘導產生的細胞進行形態學觀察及免疫學鑒定來確定最終生成的是雪旺細胞。目前尚無將iPS誘導產生的雪旺細胞進行神經缺損修復的實驗研究。提高神經嵴的分化效率，獲得純度較高的神經嵴干細胞或神經嵴細胞，提高iPS誘導分化為雪旺細胞的效率以及提高雪旺細胞的純度，尋找更優化的iPS向雪旺細胞誘導分化的方法，均為目前研究重點。通過誘導獲得臨床級別的雪旺細胞也是解決面神經損傷修復這一難題的重要突破口。