引用本文： 魏波, 康銀輝, 宋麗君, 王朝軍, 郭偉雄, 向旻, 李廣盛, 林林顥, 曾榮. BMSCs條件培養基改善地塞米松對成骨細胞成骨功能抑制效應的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 761-766. doi: 10.7507/1002-1892.20160155 復制
目前，糖皮質激素已廣泛用于治療過敏性、自身免疫性和炎癥性疾病，但長時間應用會引起不同程度骨量丟失，甚至發生骨壞死[1-2]。而由糖皮質激素導致的骨壞死發病機制仍不明確。成骨細胞在調節骨生長和形成中具有至關重要的作用，是糖皮質激素作用的重要靶細胞[3-4]，體外實驗證明糖皮質激素能抑制成骨細胞功能[5-7]。BMSCs 來源于中胚層，具有自我更新和多向分化能力，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、成纖維細胞等[8]。BMSCs移植治療激素性股骨頭缺血性壞死已成為研究熱點，這種治療作用可能是通過細胞和細胞間分泌的某種因子產生的[9-10]。這些生物活性因子包括小分子蛋白、生長因子、細胞因子和其他細胞調節劑[9, 11]，有調節多種細胞生理活性的能力，包括誘導骨形成及血管發生、發育[12-14]。目前，關于BMSCs旁分泌作用對糖皮質激素造成的成骨細胞成骨能力改變是否存在影響，尚無研究報道。MC3T3-E1細胞是從C57BL/6小鼠顱頂骨細胞中建株的成骨細胞，常作為骨代謝研究的細胞模型[15]。本實驗以MC3T3-E1細胞為研究對象，初步探討BMSCs條件培養基對地塞米松所致成骨細胞成骨功能抑制效應的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
MC3T3-E1細胞購自上海生命科學院；C57BL/6小鼠BMSCs購自賽業（廣州）生物科技有限公司。地塞米松（Sigma公司，美國）；C57BL/6小鼠BMSCs完全培養基（含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素雙抗和1%谷氨酰胺）、茜素紅S[賽業（廣州）生物科技有限公司]；α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；青霉素/鏈霉素雙抗、FBS（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Dojindo公司，日本）；ALP活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；SYBR?Green qPCR熒光染料（大連寶生物公司）；兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠骨鈣素（Osteocalcin）一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Roche LightCycler480熒光定量PCR儀[羅氏（上海）有限公司]；酶標儀（Thermofisher公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 MC3T3-E1細胞培養及BMSCs條件培養基制備
取MC3T3-E1細胞，用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的α-MEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長達80%～90%時傳代。
取C57BL/6小鼠BMSCs，用C57BL/6小鼠BMSCs完全培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長達80%～90%時傳代。取對數生長期BMSCs，以5.5×106個/皿的密度接種于10?cm培養皿中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養 ，待細胞生長達80%后棄培養基，加入BMSCs基礎培養基，24 h后收集上清，4℃保存，3 d內使用。
1.3 地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響
取對數生長期MC3T3-E1細胞，以5×103個/孔接種于96孔板，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養6 h，使細胞完全貼壁。分別以濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L地塞米松100?μL培養24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養箱內孵育1 h，用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，比較不同濃度地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖的抑制作用，選擇對細胞增殖影響最小的最大濃度用于后續實驗。每個濃度設5個復孔。
1.4 實驗分組及方法
1.4.1 實驗分組
根據不同培養條件，實驗分為4 組。A組為對照組，以α-MEM培養基培養；B組添加1?μmol/L地塞米松；C組按1:1比例添加1?μmol/L地塞米松和BMSCs條件培養基；D組僅添加BMSCs條件培養基。
1.4.2 茜素紅染色
將第3代MC3T3-E1細胞以5×104個/孔接種于6孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養6 h后，按上述分組方法分別培養，每隔3 d換液。培養21 d后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2遍，0.1%茜素紅溶液染色5 min，PBS沖洗2遍[16]，倒置顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。
1.4.3 細胞內ALP含量測定
按1.4.2方法分組培養細胞24 h后測定蛋白濃度，按以下步驟測定細胞內ALP含量。在96孔板中設置空白孔（雙蒸水5?μL）、標準孔（0.1 mg/mL酚標準應用液5 μL）和測定孔（樣本5 μL），測定孔設5個復孔；再依次加入緩沖液、基質液各50 μL，搖床混勻后在37℃水浴中放置15 min（待測樣品中ALP活性較低時，可適當延長孵育時間至30 min），各孔加入顯色劑150 μL，混勻后用酶標儀測定520 nm處A值，根據以下公式計算ALP含量： （測定孔A值－空白孔A值） /（標準孔A值－空白孔A值）×校準品濃度×待測樣本蛋白濃度。
1.4.4 Western blot檢測
按1.4.2方法分組培養細胞24?h后，PBS沖洗3遍，冰上用裂解液裂解30?min后提取細胞總蛋白。蛋白濃度用BCA法測定，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性5 min。取等量蛋白經SDS-PAGE電泳后，將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉過夜。加入兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠Osteocalcin一抗（1:1 000）和內參GAPDH（1:2?000），4℃過夜，室溫孵育1?h，洗膜后經相應二抗（1:5 000）孵育1 h，洗膜后ECL顯影液顯影，曝光成像，Image J軟件分析目的條帶，以目的蛋白與GAPDH比值作為蛋白相對表達量。
1.4.5 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測
將生長狀態良好的第3代MC3T3-E1細胞以 1×105個/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后按分組方法培養24?h后，用Trizol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，分光光度計測定濃度，逆轉錄為cDNA，獲得反應體系模版。α1-Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ-α 1，COL1A1）、RUNX2、ALP、Osteocalcin和內參β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。采用兩步法進行分析，反應總體系20 μL，反應條件：預變性95℃、2 min，95℃、15?s，60℃、30 s，40個循環。每個樣本設5個復孔。采用2-ΔΔCt標準化法計算各目的基因相對表達量。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for RT-qPCR
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響
各濃度地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖均有抑制作用，且隨著濃度增加，細胞活性逐漸降低。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L濃度組細胞存活率均低于0?μmol/L濃度組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 1。其中0.5、1.0 μmol/L濃度組培養細胞存活率超過80%，故選擇1.0 μmol/L作為后續實驗用濃度。
圖1
不同濃度地塞米松培養24 h后對MC3T3-E1細胞增殖的影響
Figure1.
Effect of different concentrations of dexamethasone on MC3T3-E1 cell proliferation cultured for 24 hours
2.2 茜素紅染色
培養6 d時A組細胞死亡；21 d時B、C、D組均可見茜素紅陽性染色，且逐漸增強。見圖 2。
圖2
培養21 d B、C、D組鈣結節形成觀察（茜素紅染色×40） ? B組 ? C組 ? D組 圖 3 Western blot檢測細胞內RUNX2、Osteocalcin蛋白表達 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 ? RUNX2 ? Osteocalcin
Figure2.
Observation of calcium nodules formation in groups B, C, and D at 21 days (Alizarin red staining×40) ? Group B ? Group C ? Group D Fig. 3 The protein expressions of RUNX2 and Osteocalcin by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ? RUNX2 ? Osteocalcin
2.3 細胞內ALP含量測定
培養24 h后，A、B、C、D組ALP含量分別為3.870±0.135、2.443±0.101、3.310±0.161和3.580±0.155。B、C、D組ALP含量均顯著低于A組，B組低于C、D組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
2.4 Western blot檢測細胞內RUNX2、Osteocalcin蛋白表達
培養24 h后，A、B、C、D組RUNX2蛋白相對表達量分別為0.725±0.055、0.590±0.067、0.662±0.052、0.723±0.038，B組顯著低于A、C、D組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C、D組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。A、B、C、D組Osteocalcin蛋白相對表達量分別為0.691±0.084、0.343±0.043、0.688±0.106、1.286±0.125，B組顯著低于A、C、D組，A、C組低于D組，差異均有統計學意義（P < 0.05）； A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.5 RT-qPCR檢測細胞內RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表達
B、C、D組RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相對表達量均顯著低于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）。D組RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相對表達量均顯著高于B、C組，C組顯著高于B 組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；D組COL1A1基因相對表達量顯著高于B組（P < 0.05），B、C組間及C、D組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
RT-qPCR檢測細胞內各基因相對表達量（n=5，3 討論
激素性骨壞死已成為臨床上常見的骨骼疾病，然而其發病機制尚未完全闡明。Ogoshi等[17]發現地塞米松能誘導成骨細胞凋亡，這種作用與地塞米松的濃度密切相關。Weinstein等[18]通過對7月齡鼠連續注射潑尼松龍約4周后，發現鼠椎體成骨細胞凋亡增加3倍，28%的皮質骨干骺端骨細胞凋亡。已有大量研究表明，糖皮質激素能抑制成骨細胞的骨生成活性，促進破骨細胞的骨吸收活性，最終導致骨量不可逆丟失，形成骨質疏松癥[19-21]。
BMSCs移植被認為是一項具有前景的治療骨壞死方法。移植后BMSCs除分化為功能細胞外，其旁分泌作用對周圍環境中的細胞亦有重要影響。研究表明，BMSCs的旁分泌作用能促進細胞增殖[22]，并有抗炎、抑制凋亡的作用[23-24]。但BMSCs移植后對糖皮質激素作用的成骨細胞的影響，尚未見文獻報道。
成骨細胞功能標志指標較多，其中ALP高表達是成骨細胞分化的特異性標志[25-26]，其含量可間接反映成骨細胞的功能。RUNX2被認為是成骨細胞骨形成過程中其他成骨因子調節的主開關[27]。COL1A1是骨組織中最豐富的細胞外蛋白，并在成骨細胞發育的所有階段表達[28]。Osteocalcin由成骨細胞分泌，是成骨細胞骨形成的重要標志物[29]。對這些指標的測定能了解成骨細胞的功能。本研究以MC3T3-E1細胞為研究對象，觀察BMSCs條件培養基對地塞米松作用MC3T3-E1細胞后，細胞內ALP含量，RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表達，RUNX2、Osteocalcin蛋白和鈣結節形成的影響。結果發現，地塞米松作用后成骨細胞內ALP含量，RUNX2、Osteocalcin蛋白相對表達量及COL1A1、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因相對表達量均下降，21 d后鈣結節染色減少；同時用BMSCs條件培養基干預時，呈現逆轉效應，表現為成骨細胞內ALP含量和上述蛋白、基因表達增多，鈣化結節染色增強等效應。因此可認為，BMSCs旁分泌作用能夠改善地塞米松所致的成骨細胞成骨功能抑制效應。
綜上述，BMSCs條件培養基能夠逆轉地塞米松所致MC3T3-E1細胞成骨能力下降，BMSCs具有保護成骨細胞免受激素損害而抑制骨壞死的發生，提示BMSCs在移植治療激素性骨壞死方面具有巨大潛力，但其作用機制尚需進一步研究探討。
目前，糖皮質激素已廣泛用于治療過敏性、自身免疫性和炎癥性疾病，但長時間應用會引起不同程度骨量丟失，甚至發生骨壞死[1-2]。而由糖皮質激素導致的骨壞死發病機制仍不明確。成骨細胞在調節骨生長和形成中具有至關重要的作用，是糖皮質激素作用的重要靶細胞[3-4]，體外實驗證明糖皮質激素能抑制成骨細胞功能[5-7]。BMSCs 來源于中胚層，具有自我更新和多向分化能力，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、成纖維細胞等[8]。BMSCs移植治療激素性股骨頭缺血性壞死已成為研究熱點，這種治療作用可能是通過細胞和細胞間分泌的某種因子產生的[9-10]。這些生物活性因子包括小分子蛋白、生長因子、細胞因子和其他細胞調節劑[9, 11]，有調節多種細胞生理活性的能力，包括誘導骨形成及血管發生、發育[12-14]。目前，關于BMSCs旁分泌作用對糖皮質激素造成的成骨細胞成骨能力改變是否存在影響，尚無研究報道。MC3T3-E1細胞是從C57BL/6小鼠顱頂骨細胞中建株的成骨細胞，常作為骨代謝研究的細胞模型[15]。本實驗以MC3T3-E1細胞為研究對象，初步探討BMSCs條件培養基對地塞米松所致成骨細胞成骨功能抑制效應的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
MC3T3-E1細胞購自上海生命科學院；C57BL/6小鼠BMSCs購自賽業（廣州）生物科技有限公司。地塞米松（Sigma公司，美國）；C57BL/6小鼠BMSCs完全培養基（含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素雙抗和1%谷氨酰胺）、茜素紅S[賽業（廣州）生物科技有限公司]；α-MEM培養基（HyClone公司，美國）；青霉素/鏈霉素雙抗、FBS（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Dojindo公司，日本）；ALP活性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；SYBR?Green qPCR熒光染料（大連寶生物公司）；兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠骨鈣素（Osteocalcin）一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Roche LightCycler480熒光定量PCR儀[羅氏（上海）有限公司]；酶標儀（Thermofisher公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 MC3T3-E1細胞培養及BMSCs條件培養基制備
取MC3T3-E1細胞，用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的α-MEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長達80%～90%時傳代。
取C57BL/6小鼠BMSCs，用C57BL/6小鼠BMSCs完全培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待細胞生長達80%～90%時傳代。取對數生長期BMSCs，以5.5×106個/皿的密度接種于10?cm培養皿中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養 ，待細胞生長達80%后棄培養基，加入BMSCs基礎培養基，24 h后收集上清，4℃保存，3 d內使用。
1.3 地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響
取對數生長期MC3T3-E1細胞，以5×103個/孔接種于96孔板，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養6 h，使細胞完全貼壁。分別以濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L地塞米松100?μL培養24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養箱內孵育1 h，用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，比較不同濃度地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖的抑制作用，選擇對細胞增殖影響最小的最大濃度用于后續實驗。每個濃度設5個復孔。
1.4 實驗分組及方法
1.4.1 實驗分組
根據不同培養條件，實驗分為4 組。A組為對照組，以α-MEM培養基培養；B組添加1?μmol/L地塞米松；C組按1:1比例添加1?μmol/L地塞米松和BMSCs條件培養基；D組僅添加BMSCs條件培養基。
1.4.2 茜素紅染色
將第3代MC3T3-E1細胞以5×104個/孔接種于6孔板中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養6 h后，按上述分組方法分別培養，每隔3 d換液。培養21 d后PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2遍，0.1%茜素紅溶液染色5 min，PBS沖洗2遍[16]，倒置顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。
1.4.3 細胞內ALP含量測定
按1.4.2方法分組培養細胞24 h后測定蛋白濃度，按以下步驟測定細胞內ALP含量。在96孔板中設置空白孔（雙蒸水5?μL）、標準孔（0.1 mg/mL酚標準應用液5 μL）和測定孔（樣本5 μL），測定孔設5個復孔；再依次加入緩沖液、基質液各50 μL，搖床混勻后在37℃水浴中放置15 min（待測樣品中ALP活性較低時，可適當延長孵育時間至30 min），各孔加入顯色劑150 μL，混勻后用酶標儀測定520 nm處A值，根據以下公式計算ALP含量： （測定孔A值－空白孔A值） /（標準孔A值－空白孔A值）×校準品濃度×待測樣本蛋白濃度。
1.4.4 Western blot檢測
按1.4.2方法分組培養細胞24?h后，PBS沖洗3遍，冰上用裂解液裂解30?min后提取細胞總蛋白。蛋白濃度用BCA法測定，與5×上樣緩沖液混合，100℃變性5 min。取等量蛋白經SDS-PAGE電泳后，將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉過夜。加入兔抗鼠RUNX2一抗、鼠抗鼠Osteocalcin一抗（1:1 000）和內參GAPDH（1:2?000），4℃過夜，室溫孵育1?h，洗膜后經相應二抗（1:5 000）孵育1 h，洗膜后ECL顯影液顯影，曝光成像，Image J軟件分析目的條帶，以目的蛋白與GAPDH比值作為蛋白相對表達量。
1.4.5 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測
將生長狀態良好的第3代MC3T3-E1細胞以 1×105個/孔接種于6孔板中，待細胞貼壁后按分組方法培養24?h后，用Trizol試劑提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，分光光度計測定濃度，逆轉錄為cDNA，獲得反應體系模版。α1-Ⅰ型膠原（collagen typeⅠ-α 1，COL1A1）、RUNX2、ALP、Osteocalcin和內參β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。采用兩步法進行分析，反應總體系20 μL，反應條件：預變性95℃、2 min，95℃、15?s，60℃、30 s，40個循環。每個樣本設5個復孔。采用2-ΔΔCt標準化法計算各目的基因相對表達量。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for RT-qPCR
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響
各濃度地塞米松對MC3T3-E1細胞增殖均有抑制作用，且隨著濃度增加，細胞活性逐漸降低。0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L濃度組細胞存活率均低于0?μmol/L濃度組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 1。其中0.5、1.0 μmol/L濃度組培養細胞存活率超過80%，故選擇1.0 μmol/L作為后續實驗用濃度。
圖1
不同濃度地塞米松培養24 h后對MC3T3-E1細胞增殖的影響
Figure1.
Effect of different concentrations of dexamethasone on MC3T3-E1 cell proliferation cultured for 24 hours
2.2 茜素紅染色
培養6 d時A組細胞死亡；21 d時B、C、D組均可見茜素紅陽性染色，且逐漸增強。見圖 2。
圖2
培養21 d B、C、D組鈣結節形成觀察（茜素紅染色×40） ? B組 ? C組 ? D組 圖 3 Western blot檢測細胞內RUNX2、Osteocalcin蛋白表達 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 ? RUNX2 ? Osteocalcin
Figure2.
Observation of calcium nodules formation in groups B, C, and D at 21 days (Alizarin red staining×40) ? Group B ? Group C ? Group D Fig. 3 The protein expressions of RUNX2 and Osteocalcin by Western blot 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D ? RUNX2 ? Osteocalcin
2.3 細胞內ALP含量測定
培養24 h后，A、B、C、D組ALP含量分別為3.870±0.135、2.443±0.101、3.310±0.161和3.580±0.155。B、C、D組ALP含量均顯著低于A組，B組低于C、D組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
2.4 Western blot檢測細胞內RUNX2、Osteocalcin蛋白表達
培養24 h后，A、B、C、D組RUNX2蛋白相對表達量分別為0.725±0.055、0.590±0.067、0.662±0.052、0.723±0.038，B組顯著低于A、C、D組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、C、D組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。A、B、C、D組Osteocalcin蛋白相對表達量分別為0.691±0.084、0.343±0.043、0.688±0.106、1.286±0.125，B組顯著低于A、C、D組，A、C組低于D組，差異均有統計學意義（P < 0.05）； A、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.5 RT-qPCR檢測細胞內RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表達
B、C、D組RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相對表達量均顯著低于A組，差異有統計學意義（P < 0.05）。D組RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相對表達量均顯著高于B、C組，C組顯著高于B 組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；D組COL1A1基因相對表達量顯著高于B組（P < 0.05），B、C組間及C、D組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
RT-qPCR檢測細胞內各基因相對表達量（n=5，3 討論
激素性骨壞死已成為臨床上常見的骨骼疾病，然而其發病機制尚未完全闡明。Ogoshi等[17]發現地塞米松能誘導成骨細胞凋亡，這種作用與地塞米松的濃度密切相關。Weinstein等[18]通過對7月齡鼠連續注射潑尼松龍約4周后，發現鼠椎體成骨細胞凋亡增加3倍，28%的皮質骨干骺端骨細胞凋亡。已有大量研究表明，糖皮質激素能抑制成骨細胞的骨生成活性，促進破骨細胞的骨吸收活性，最終導致骨量不可逆丟失，形成骨質疏松癥[19-21]。
BMSCs移植被認為是一項具有前景的治療骨壞死方法。移植后BMSCs除分化為功能細胞外，其旁分泌作用對周圍環境中的細胞亦有重要影響。研究表明，BMSCs的旁分泌作用能促進細胞增殖[22]，并有抗炎、抑制凋亡的作用[23-24]。但BMSCs移植后對糖皮質激素作用的成骨細胞的影響，尚未見文獻報道。
成骨細胞功能標志指標較多，其中ALP高表達是成骨細胞分化的特異性標志[25-26]，其含量可間接反映成骨細胞的功能。RUNX2被認為是成骨細胞骨形成過程中其他成骨因子調節的主開關[27]。COL1A1是骨組織中最豐富的細胞外蛋白，并在成骨細胞發育的所有階段表達[28]。Osteocalcin由成骨細胞分泌，是成骨細胞骨形成的重要標志物[29]。對這些指標的測定能了解成骨細胞的功能。本研究以MC3T3-E1細胞為研究對象，觀察BMSCs條件培養基對地塞米松作用MC3T3-E1細胞后，細胞內ALP含量，RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因表達，RUNX2、Osteocalcin蛋白和鈣結節形成的影響。結果發現，地塞米松作用后成骨細胞內ALP含量，RUNX2、Osteocalcin蛋白相對表達量及COL1A1、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因相對表達量均下降，21 d后鈣結節染色減少；同時用BMSCs條件培養基干預時，呈現逆轉效應，表現為成骨細胞內ALP含量和上述蛋白、基因表達增多，鈣化結節染色增強等效應。因此可認為，BMSCs旁分泌作用能夠改善地塞米松所致的成骨細胞成骨功能抑制效應。
綜上述，BMSCs條件培養基能夠逆轉地塞米松所致MC3T3-E1細胞成骨能力下降，BMSCs具有保護成骨細胞免受激素損害而抑制骨壞死的發生，提示BMSCs在移植治療激素性骨壞死方面具有巨大潛力，但其作用機制尚需進一步研究探討。
