脊髓損傷修復迄今仍是世界性的醫學難題。戴建武教授團隊近 20 年來專注脊髓損傷再生修復研究，建立了哺乳動物脊髓大段缺損全橫斷損傷模型，包括嚙齒類、犬及非人靈長類全橫斷脊髓損傷模型，并于 2015 年 1 月 16 日在國際上首先開展了神經再生膠原支架材料修復完全性脊髓損傷的臨床研究。文章依據領域研究進展，分析了脊髓完全性損傷后運動功能恢復的 3 種可能機制：① 運動神經長軸突再生通過損傷區域；② 損傷區新生的神經元連接損傷的兩個斷端，形成連接；③ 前述兩種機制都存在。大量不同動物全橫斷脊髓損傷模型及再生修復研究結果均表明，神經再生膠原支架移植治療全橫斷脊髓損傷動物是通過引導內源神經元形成橋接改善運動功能。在不同脊髓損傷模型中，特別是大段缺損全橫斷脊髓損傷模型中，長的軸突生長非常有限，無法滿足動物運動功能恢復的要求。在全橫斷脊髓損傷動物模型中，通過功能修飾的神經再生膠原支架移植促進新神經元產生并形成橋接改善運動功能相比引導運動軸突再生更可行，是全橫斷脊髓損傷后運動功能恢復的主要機制。但在再生修復時如何促進更多的神經元產生、形成正確的橋接并實現更好的運動功能恢復等都是亟待解決的重要問題。
引用本文： 李佳音, 李星, 肖志峰, 戴建武. 完全性脊髓損傷再生機制的探討. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(6): 641-649. doi: 10.7507/1002-1892.201805069 復制
脊髓損傷后，因脊髓組織受損會導致損傷節段以下部分或完全性的感覺及運動功能缺失[1]。由外部物理撞擊導致的創傷性脊髓損傷，傷后早期主要表現為嚴重的脊髓組織損傷及神經細胞死亡，之后會引發嚴重的繼發性損傷，如局部缺血、炎癥、大量神經元和少突膠質細胞死亡、膠質瘢痕以及囊性空洞形成等[2]。近年研究發現，成年哺乳動物創傷性脊髓損傷后的原發及繼發性損傷會逐漸改變損傷部位的細胞組成及組織結構，最終在損傷部位形成一個阻止軸突再生的抑制微環境。此外，除了抑制微環境形成外，成年神經元的內在生長潛力較差也是導致脊髓自發再生可能性低的重要因素，最終導致永久性神經缺損[3-6]。但有研究發現，通過調節神經細胞的內在生長潛力或移除脊髓損傷微環境中的某些抑制因素（單一或組合），一些成年神經元和軸突仍具有一定再生能力[5, 7-11]。
雖然脊髓損傷不會顯著影響患者壽命，但可能導致患者生理和心理問題，高昂的治療費用也會給患者家庭及社會帶來沉重負擔[12]。目前，脊髓損傷的臨床治療仍集中在穩定病變組織結構，防止對鄰近脊髓組織的進一步損害，以及通過康復提高患者生活自理能力[13-14]，尚缺少有效促進神經再生和功能恢復的治療方案，而完全性脊髓損傷的修復被認為是臨床研究中最具挑戰性的問題之一[15]。
近年，動物實驗研究已為創傷性脊髓損傷的治療提供了一些新的概念和可行方案，并顯示出臨床轉化潛力。我們團隊在近 20 年的脊髓損傷再生修復研究中，成功建立了哺乳動物脊髓大段缺損完全損傷模型，包括嚙齒類、犬及非人靈長類模型，在臨床研究中也取得了突破性進展。現對神經再生膠原支架移植治療完全性脊髓損傷動物實驗研究的成果，以及通過引導內源性神經元形成橋接改善運動功能的相關研究進展進行總結，并探討完全性脊髓損傷動物中運動功能改善的機制，旨在為下一步完全性脊髓損傷的相關研究提供參考。
1 全橫斷脊髓損傷動物模型制備相關研究
近年用于脊髓損傷修復基礎研究及治療評價的創傷性脊髓損傷動物模型較多，包括挫傷、擠壓傷、橫切及化學損傷等不同致傷因素制備的模型[16-17]。與上述創傷性脊髓損傷模型相比，完全性脊髓損傷模型完全排除了軸突芽生的可能性，可以真實反映軸突再生情況，為研究軸突再生提供了最理想的平臺[18]。目前，許多研究人員將完全性脊髓損傷動物模型作為檢驗神經再生的金標準。與嚙齒類動物模型相比，大動物（如犬）模型在損傷癥狀、不良預后和康復訓練等方面與臨床患者更相似[19]，近十年間完全性脊髓損傷模型從嚙齒動物到大動物逐漸得到改進和完善[20]。但是，由于軸突纖維和脊髓神經元的缺失，完全性脊髓損傷模型制備后實驗動物會出現永久性癱瘓以及一系列繼發性并發癥，如褥瘡、骨質疏松、深靜脈血栓、尿路感染、肌肉痙攣和呼吸并發癥等[20]，因此術后護理要求極高，提高了該類模型使用的難度[21-23]。
在完全性脊髓損傷模型修復研究過程中，我們團隊建立了大鼠 3～6 mm 缺損的全橫斷急性及陳舊性脊髓損傷模型，通過自主研發的神經再生膠原支架結合再生因子或生物拮抗分子[24-27]、人 MSCs[28]、神經干細胞[27, 29]等進行修復，治療后大鼠運動功能均不同程度恢復[30]。我們還率先建立了犬 5 mm～2 cm 急性及陳舊性脊髓損傷模型[20, 31-36]，通過 6 批次近 300 只犬的實驗，證實神經再生膠原支架結合神經再生因子或生物拮抗分子[31-32, 36]、人 MSCs[33]可有效促進損傷部位神經再生及犬運動功能的恢復[20]。此外，我們還成功制備了恒河猴 T9 長段（6 mm）急性全橫斷脊髓損傷模型，并通過此模型驗證了神經再生膠原支架復合生長因子 NT3 在神經損傷修復中的作用。術后 10 個月，與空白對照組以及單純支架材料組相比，實驗組恒河猴運動誘發電位以及后肢運動功能明顯改善，損傷區內的膠質瘢痕沉積明顯減少，而且可見更多的有序神經纖維再生、軸突髓鞘化以及突觸形成。
2 用于修復完全性脊髓損傷的神經再生膠原支架制備及相關研究
隨著生物材料領域的發展，許多生物支架也應用于各種類型脊髓損傷修復，部分生物支架顯示出了一定的臨床應用潛力。研究表明，功能生物支架移植可促使損傷部位產生運動神經元，包括五羥色胺能（5-HT 陽性）、乙酰膽堿能（chAT 陽性）、多巴胺能（TH 陽性）神經元[26, 33, 36-37]。這表明基于功能修飾的生物材料治療方案可以有效促進脊髓損傷部位的神經再生，恢復運動功能。
在脊髓損傷修復中使用的生物支架大多是由重復單元組成的天然聚合物，其具有容易獲得、抗原性低、生物相容性好和可降解等優勢[38]。一種理想的修復脊髓損傷的生物支架需要具備以下性質：① 生物支架能為受損的軸突和神經元的重新生長和遷移提供結構上的支持；② 生物支架具有可調節的生化特性，與脊髓組織機械特性相匹配，而且能夠引導神經元及軸突的生長及遷移[39]；③ 生物支架應易于使用某些具有生物活性的多肽或蛋白因子進行修飾或功能化，實現特定的修復效果；④ 移植入體內的生物支架可以在適當時間內降解，被再生神經組織所替代；⑤ 生物支架及其降解產物無細胞毒性且免疫原性低。我們團隊在近 20 年的研究中，設計研發了一系列神經再生膠原支架，將其移植至損傷造成的缺口時能起到連接兩斷端的作用。這些功能修飾后的神經再生膠原支架不僅能在脊髓橫斷或瘢痕切除后起到物理連接的作用，而且還可以引導內源性神經干細胞分化，促進組織再生及運動功能恢復[40]。
特定的生長因子對組織再生修復具有促進作用。為了實現結合在功能膠原生物支架上的生長因子能長時間緩釋，我們構建了膠原結合肽（collagen-binding domain，CBD）修飾的生長因子 BDNF（CBD-BDNF），與神經再生膠原支架結合治療完全性脊髓損傷比格犬（實驗組），觀察發現治療 38 周后，與空白對照組相比，實驗組膠質瘢痕明顯減少，而且大量神經纖維可以長入損傷區域，超過 40% 的犬在 26～38 周可以站立甚至行走[32]。
由于完全性脊髓損傷后激活的神經干細胞表達 EGF 受體（EGF receptor，EGFR），因此我們利用臨床藥物西妥昔單抗（一種 EGFR 的抗體）與神經再生膠原支架共同孵育，并將修飾后支架移植至大鼠全橫斷脊髓損傷模型的損傷部位。損傷后 15 d，可見內源激活的神經干細胞在損傷部位富集和分化。而在犬全橫斷脊髓損傷模型中，移植西妥昔單抗修飾功能生物材料 9 個月后，可以部分恢復運動誘發電位反應，顯著改善后肢的運動功能[36]。
為了進一步實現結合在膠原支架上的西妥昔單抗長時間緩釋，我們構建了特異性結合 EGFR 抗體的神經再生膠原支架。我們選取了 EGFR 抗體西妥昔單抗蛋白上的功能單元 Fab，結合一段 CBD，成功構建 CBD-Fab 表達載體。在確認修飾后的蛋白生物活性保持不變后，我們將 CBD-Fab 修飾的神經再生膠原支架移植入完全性脊髓損傷大鼠中。結果表明，該支架可以通過與神經干細胞表面 EGFR 結合，特異性吸附神經干細胞，促進其在損傷部位存留及向神經元分化，同時還可以降低膠質瘢痕的沉積，改善大鼠運動功能[26]。而且，將該神經再生膠原支架與外源性神經干細胞一同移植入完全性脊髓損傷大鼠的損傷區，體外移植及體內損傷激活的神經干細胞均會被特異性吸附并存留在支架上，且外源及內源神經干細胞均能分化為神經元[27]。
除了西妥昔單抗及其功能單元外，我們近期研究還證實載有抗癌藥物紫杉醇的神經再生膠原支架能夠有效促進犬長距離脊髓全橫斷損傷后的軸突再生、神經元再生、電生理和運動功能恢復[34]。此外，將人 MSCs 及外源神經干細胞復合膠原神經再生支架進行移植，同樣可以促進大鼠及犬的神經纖維再生、軸突髓鞘化以及突觸形成，經過治療的比格犬可以用癱瘓的后肢站立甚至行走[28-29, 33, 35]。
在臨床前研究的基礎上，我們于 2015 年 1 月 16 日首次開展了神經再生膠原支架移植治療完全性脊髓損傷的臨床研究。在前期 5 例患者中，首次采用術中電生理等手段鑒定神經組織和瘢痕組織，并實施了對瘢痕組織的安全清除，同時進行神經再生膠原支架的移植。經過 1 年的隨訪，結果表明神經再生膠原支架移植治療脊髓損傷安全可行[41]。隨后的研究表明，神經再生膠原支架結合 MSCs 可以促進部分陳舊性完全性脊髓損傷患者植物神經功能改善、感覺平面下降以及手指的運動功能改善等[42]。在急性脊髓損傷臨床研究中，建立了綜合 ASIA 評分、影像學和電生理等的嚴格急性完全性脊髓損傷判定標準，目前已入組 10 余例急性脊髓損傷患者，部分入組患者出現較準確的大小便感覺，下肢出現自主的運動功能恢復，并伴隨有中斷的感覺誘發電位和運動誘發電位的恢復。
綜上所述，經過因子、拮抗劑修飾或復合干細胞的神經再生膠原支架可以有效促進神經再生，實現全橫斷損傷嚙齒動物及犬的運動功能恢復。
3 完全性脊髓損傷運動功能恢復機制研究
鑒于完全性脊髓損傷模型在軸突再生驗證研究中的有效作用，近年來已有越來越多的研究人員運用這種完全性脊髓損傷，尤其是應用胸段完全性脊髓損傷模型（可以完全截斷下肢的上行及下行神經傳導）來研究神經再生及下肢運動功能的恢復。這些研究使用了很多單一或者組合的治療策略，如生長因子[43]、生物活性拮抗劑或多肽[18, 24-27]、臨床用藥[36, 44]、外源細胞移植[27, 33, 35, 37, 45-51]，以及功能性生物支架移植[24-27, 29, 32-36, 52-56]，這些治療策略對完全性脊髓損傷動物的神經再生或運動功能恢復均有不同程度的作用，也對脊髓損傷后功能恢復的機制進行了初步探討。目前研究認為完全性脊髓損傷運動功能恢復機制有 3 種可能的理論，分別為長的運動軸突再生穿過損傷區，損傷區神經元形成橋接連接損傷的兩個斷端，或者兩者兼具。
3.1 運動神經軸突再生理論
研究表明，損傷區的抑制微環境阻礙了軸突再次生長，在無有效干預下，切斷的軸突不太可能自發延伸甚至穿過損傷區，更不可能與它原定的或新的靶向神經元形成連接[57]。因此，一些研究人員嘗試通過改善完全性橫斷后的微環境來促進運動功能的恢復，如通過外周神經搭橋、細胞移植、生物工程方法構建基質或支架等。
在完全性脊髓損傷動物治療研究中，在損傷部位常能檢測到再生的運動性軸突，主要包括組成皮質脊髓束（corticospinal tract，CST）、縫核脊髓束、網狀脊髓束和紅核脊髓束的軸突。這些調節運動功能的下行神經纖維束對改善動物的運動功能非常重要。其中，CST 由于在自主性運動功能恢復中的關鍵作用備受關注。許多研究者認為，在嚴重脊髓損傷后，CST 的再生可能是恢復前肢和后肢運動功能的方法。
回顧分析近十年來完全性脊髓損傷動物軸突再生及運動功能恢復的研究[18, 24-27, 33, 35-37, 43-50, 52-54, 56, 58-65]，我們發現超過一半的研究通過不同的治療策略顯著改善了完全性脊髓損傷動物的運動功能，常用方法包括人工構建神經支架或基質移植修復，同時還可以結合藥物、蛋白因子、各種外源性細胞（如雪旺細胞、嗅神經鞘膠質細胞、神經干細胞、MSCs、少突膠質前體細胞、骨髓基質細胞）以及其他替代物。這些研究均表明，某些截斷的軸突在損傷后會繼續生長，包括五羥色胺能、乙酰膽堿能及多巴胺能的軸突。但是，這些研究中幾乎都沒能發現完全性截斷后的脊髓中有 CST 軸突延伸或穿過損傷區。
早期研究結果表明，只有將大鼠胚胎期脊髓移植至大鼠全橫斷損傷模型的損傷部位，才有可能支持 CST 軸突的再生[66]。在近期的一項研究中，Kadoya 等[59]將從胚胎期 14 d 的大鼠脊髓原基中分離獲得的神經前體細胞移植入 T3 段完全截斷的大鼠模型中，發現部分 CST 軸突可以再生，最長達 1.5 mm。除了胚胎期脊髓移植外，Yang 等[54]將殼聚糖材料復合神經營養因子 NT3 移植至完全性橫斷脊髓大鼠損傷區，發現治療 1 個月后小部分 CST 纖維可以從頭端長入損傷區域，穿過 5 mm 長的損傷區域，進入大鼠尾椎脊髓。但是，CST 纖維的這種再生仍需要通過標記技術得到更準確的結果，以驗證其可信度和可重復性。
在對 CST 軸突再生或芽生的研究中，人們發現了許多抑制或促進因素。在抑制信號通路中研究最多的是 Nogo 介導的抑制信號通路[67-70] 以及雷帕霉素靶蛋白 mTOR 的抑制因子磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN） [71-74]。但是，這些研究使用的模型并非完全性橫斷脊髓損傷，而是擠壓傷或背側半橫切損傷。在 CST 軸突再生的研究中，即使是脊髓完全性擠壓傷模型中，仍有可能存在殘留的 CST 軸突，其結果也備受爭議。
即使不考慮模型類型及 CST 能否再生，CST 軸突的再生或芽生與運動功能恢復間的關系同樣難以定論。Jin 等[75]的研究發現，條件性敲除感覺運動皮層中細胞因子激活通路的抑制因子 SOCS3，可以促進未損傷的 CST 軸突向去神經化的脊髓中芽生。此外，如果同時敲除 PTEN，CST 軸突芽生的數量及訓練后的運動功能恢復程度都會顯著提高。同時，Geoffroy 等[76]也發現 PTEN 及 PTEN/Nogo 敲除的小鼠中，雖然 CST 軸突的芽生明顯增強，但小鼠功能恢復并不明顯。上述研究報道結果中運動功能恢復的差異可能與不同基因敲除小鼠的運動功能恢復程度不同，以及 CST 軸突的芽生數量及其與尾端靶向神經元的成功連接與否有關，但也使學者們對嚙齒動物中 CST 在運動功能中的作用提出了質疑。
目前，研究發現了越來越多可以促進 CST 軸突芽生或再生的蛋白因子，如肝配蛋白 B3 及其受體 EphA4[77-78]、Krüppel 樣因子 7[79]、信號轉導及轉錄激活因子 3[80]、傳統型蛋白激酶 C[81]、轉錄因子 Sox11[82]及 mTOR 的靶蛋白核糖體 S6 激酶 1[83]。雖然這些研究都表明在非完全性脊髓損傷的嚙齒動物中 CST 軸突可以延伸穿過損傷區，但由于模型的局限性，這些結論都很難證實是否是截斷的 CST 軸突的再生。因此，仍需在完全性橫斷的脊髓損傷模型中證實是否存在與運動功能相關的 CST 軸突的再生。
迄今為止，最新的關于 CST 再生的綜述為 2012 年由 Tuszynski 及 Steward 發表的[57]。有一些研究認為觀察到 CST 再生的現象缺乏時間及可重復性的檢驗。因此，在完全性脊髓損傷動物中通過脊髓移植或人工構建支架移植使 CST 纖維再生缺乏足夠的文獻證實。
綜上所述，對于脊髓損傷后 CST 軸突的生長，已有的研究大多認為其主要是通過殘存的完整的神經纖維芽生來實現功能恢復；而即使是有部分橫斷的 CST 生長，其再生距離和數量也非常有限，迄今尚缺乏客觀研究證實全橫斷后運動軸突（如 CST 軸突）可以再生穿過損傷缺口實現運動功能恢復。由目前的研究結果來看，通過 CST 軸突長距離再生實現完全性脊髓損傷動物的運動功能恢復的可行性仍未可知。
3.2 內源性神經橋接理論
在全橫斷脊髓損傷的嚙齒動物及犬模型中，很多治療方案都可以顯著改善動物模型運動功能。由于全橫斷后運動軸突（如 CST 軸突）再生機制至今仍未明確，有些學者提出在重新連接截斷的脊髓束并恢復運動功能中起重要作用的并非運動軸突再生，而是外源或內源神經元分化形成橋接，連接損傷的兩個斷端[36-37, 51, 54, 84]。移植或內源的神經干細胞可以定向分化成多種神經元，在損傷部位形成神經橋接，促使新的突觸連接，形成環路，改善脊髓損傷后動物的運動功能[36-37, 54]。基于這種理論，外源神經干細胞/神經前體細胞近年來被廣泛應用于脊髓損傷的治療。在動物實驗中，外源神經干細胞/神經前體細胞移植后可分化為神經細胞，補充損傷部位缺失的神經元及營養因子，重新形成神經橋接，促進運動功能的恢復[37, 47, 85-86]。
但是，外源神經干細胞/神經前體細胞移植應用于臨床還面臨巨大的挑戰。首先，除存在的倫理問題外，從人的胚胎組織中獲得的神經前體細胞仍存在成瘤的風險；其次，由于成人自體神經前體細胞很難獲得，接受同種異體神經前體細胞移植的患者必須通過免疫抑制來減弱免疫排斥反應；再次，成人神經前體細胞的體外擴增目前還非常困難，使得臨床上很難獲得足夠量的細胞進行移植[87]。最后，移植用神經前體細胞最合適的來源、數量，給藥途徑及移植的方式目前都不清楚[87]。因此，我們重點關注人工構建的神經再生膠原支架引導內源神經干細胞發揮作用，來改善嚙齒動物和犬的運動功能的進展。
3.2.1 內源神經干細胞來源
許多研究已證明，位于成體脊髓中央管中的室管膜細胞具有神經干細胞樣潛能[88-89]。這些細胞在正常組織中并不活動，但在損傷后的脊髓組織中會被激活并遷移至損傷部位[88, 90-91]。在腦缺血或中風后，腦組織中的神經干細胞會分化為神經元，并替代受損的神經元，修復神經連接[92-93]。但是，被激活的室管膜細胞在損傷后 4 周內傾向于分化為膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陰性（未成熟的）的星形膠質細胞（占所有星形膠質細胞的 53%），并未分化為神經元[94]。其余 47% 由幼稚星形膠質細胞分化的 GFAP 陽性（成熟的）的星形膠質細胞會積聚在損傷區中央，并形成密集的膠質瘢痕，這是小鼠受傷 2 周后軸突再生的主要障礙[95-96]。
近年來，研究認為巢蛋白（nestin）/腦脂質結合蛋白（brain lipid binding protein，BLBP）陽性的神經干細胞存在于中央管及正常脊髓中，據此我們在 T8 段脊髓全橫斷損傷的大鼠模型中發現了體內脊髓來源的神經干細胞的激活時間軸[36]。損傷發生后，nestin 陽性的神經干細胞在損傷脊髓的鄰近節段中大量聚集，在第 5 天達高峰，并隨著離損傷部位的距離增加而逐漸減少。此外，中央管及脊髓中的神經干細胞與室管膜細胞的特征有所區別，中央管中由損傷激活的神經干細胞可被常規的神經干細胞標記物 nestin 和 BLBP 所標記，但卻不能被干細胞的標記物 Sox2 標記，而中央管中的室管膜細胞可以被這 3 種標記物同時標記。Yang 等及我們近期研究均表明，脊髓完全性截斷后，小部分 nestin 陽性的神經干細胞會自發分化為神經元，這種分化效率會隨著藥物的使用而提高[36, 54]。上述研究結果提示，如果經過適當的引導，內源神經干細胞可能相比室管膜細胞更有可能成為治療完全性脊髓損傷的一種細胞來源。
3.2.2 神經再生膠原支架作用
通過嚙齒動物及犬的全橫斷脊髓損傷模型進行大量脊髓損傷再生修復研究后，我們發現雖然神經再生膠原支架很難在脊髓完全性橫斷后促進運動軸突的再生，但研究結果均支持完全性脊髓損傷后運動功能恢復機制中的第 2 種理論，即經過功能性修飾后的神經再生膠原支架可以引導內源性神經干細胞分化，形成神經橋接，重新連接損傷的兩個斷端，實現完全性橫斷的脊髓損傷動物的運動功能改善。
在將小鼠 T8 段脊髓完全截斷 5 d 后，大部分被激活的神經干細胞會聚集在鄰近損傷部位的脊髓組織中，而只有很少一部分出現在損傷區中心[36]。這是由于完全性橫斷會造成脊髓組織中一定長度缺口，如果缺乏適合的引導，被損傷激活的神經干細胞就無法遷移。在利用神經再生膠原支架結合西妥昔單抗治療完全性脊髓損傷大鼠的研究中，在損傷后 15 d，雖然不同治療組損傷部位的頭端及尾端都觀察到相似數量的神經干細胞，但功能修飾的神經再生膠原支架移植組與單純神經再生膠原支架移植組相比，損傷中心部位神經干細胞的密度明顯更高[36]。我們近期的一系列研究表明，被損傷激活的神經干細胞不會自發地遷移至損傷部位，而經過適當修飾的功能支架可以在適當的時間釋放和分布生物活性因子，引導內源神經干細胞的遷移路線[26-27, 30, 36, 97]。
除了在大鼠完全性脊髓損傷模型中證明了特定修飾的神經再生膠原支架可以促進內源損傷激活的神經干細胞在損傷部位富集及分化外，我們研究還證實了大動物（犬）的完全性脊髓損傷模型中同樣存在神經發生。在移植后 9 個月，我們在損傷部位同樣觀察到了更多成熟的神經元[36]，而且這些神經元可以在損傷部位發育為具有髓鞘化軸突及突觸結構的各種功能神經元，如五羥色胺能、乙酰膽堿能及多巴胺能神經元[36]。基于以上研究結果，我們提出了功能修飾的神經再生膠原支架可以引導損傷激活的神經干細胞分化為神經元，形成神經橋接，連接損傷的兩個斷端，進而促進運動功能恢復的理論[40, 42, 98]。
綜上述，相關研究提示在完全性脊髓損傷動物模型中，尚缺少客觀充分證據證實運動軸突，尤其是 CST 軸突可以再生。因此，3 種完全性脊髓損傷運動功能恢復的可能機制中，只有第 2 種內源神經橋接機制更可行（圖 1）。
圖1
完全性脊髓損傷后，皮質脊髓束無法再生穿過損傷部 位；功能修飾的神經再生膠原支架可以引導損傷激活的 內源神經干細胞分化為神經元，形成神經橋接，連接 損傷的兩個斷端，促進運動功能恢復
Figure1.
Guiding neuronal relays formation by bio-scaffolds implantation is more feasible than directing long motor axons regeneration in improving motor function of animals with complete spinal cord transection
成功引導內源脊髓神經干細胞遷移至損傷部位只是完全性脊髓損傷后形成新的神經橋接并恢復運動功能的第一步，這些遷移至損傷部位的神經干細胞及其子代如何才能向神經元分化、成熟并形成新的功能連接，是接下來需要考慮和解決的問題。
4 展望
大量研究表明，僅阻斷細胞外抑制因素促進受傷軸突或長脊髓束再生無明顯效果，在神經元中可能存在重要細胞和分子機制來控制軸突再生[8-9, 11, 15, 99-102]。目前報道的組合治療策略中，尚無一種能很好地在全橫斷脊髓損傷動物中促進運動軸突（如 CST）長距離生長并穿過損傷區。由于 CST 軸突是控制人體自主運動功能最重要的運動軸突，可能必須有足夠的 CST 纖維再生穿過損傷區，并與原定的尾端靶向神經元精確聯接，才能顯著地促進運動功能的恢復。
因此，引導內源神經干細胞的再生可能是除了 CST 軸突再生之外更為可行的恢復運動功能的策略。雖然嚴重的脊髓損傷使大量的神經元丟失、神經回路被擾亂、運動功能嚴重受損，但也同時激活了處于靜息狀態的內源脊髓神經干細胞。如果能夠引導這些神經干細胞及其子代遷移至損傷部位，它們就會為神經功能重建提供充足的細胞來源。因此，損傷激活的內源神經干細胞是一種潛在的治療細胞源。然而，將這種方法用于臨床尚有大量問題需要解決。成體動物脊髓損傷后，內源脊髓神經干細胞（包括室管膜細胞）已被證實可以被損傷激活并大量擴增[103]，但尚無研究報道導致脊髓神經干細胞激活和向損傷區邊緣遷移的原因或誘導因素，相關機制也未明確。此外，不同內源神經干細胞的分化能力及分化特性可能也存在差異。成年室管膜細胞在體外培養時會表現出類似神經干細胞的特性，具有多能性，可分化為星形膠質細胞、少突膠質細胞及神經元[93]，但體內的室管膜細胞在脊髓損傷后并不能分化為神經元，而且我們的研究也發現，與有定向神經元分化能力的神經干細胞相比，室管膜細胞在體內表現出非常不同的分化特性[36]。
完全性脊髓損傷后修復的主要目的是重建受損的神經環路。因此，明確損傷后激活的內源性脊髓神經干細胞的分化能力和特性，以及影響不同細胞向神經元分化的因子和信號通路對于形成神經元橋接、連接損傷斷端來說是亟待解決的問題。將修飾后的功能神經膠原支架移植入損傷部位，構建適合神經元分化的微環境，可以有效引導損傷激活的神經干細胞分化形成更多的神經元及少突膠質細胞，進而促進損傷部位的神經再生、髓鞘化，重建損傷部位的神經橋接。
即使在損傷部位有足夠的神經再生、軸突髓鞘化，形成充足的神經橋接，有時運動功能的恢復也不如預期。如 Lu 等的研究發現，在大鼠 T3 全橫斷脊髓損傷的亞急性期，通過移植過表達 BDNF 大鼠 MSCs 后可以觀察到損傷部位神經橋接及突觸的形成，但運動功能反而變得更差。事實上，一些關于促進軸突再生的研究也表明，CST 再生也直接導致了運動功能惡化[49, 104]。這種神經橋接的形成與運動功能惡化之間矛盾的原因可能是由于再生的軸突未能與下游靶向神經元形成正確的突觸連接造成的。因此，如何在重建神經橋接中促進新生軸突與下游靶向神經元間形成正確而有效的連接，是今后設計全橫斷脊髓損傷治療方案時必須要考慮的重要問題。
脊髓損傷后，因脊髓組織受損會導致損傷節段以下部分或完全性的感覺及運動功能缺失[1]。由外部物理撞擊導致的創傷性脊髓損傷，傷后早期主要表現為嚴重的脊髓組織損傷及神經細胞死亡，之后會引發嚴重的繼發性損傷，如局部缺血、炎癥、大量神經元和少突膠質細胞死亡、膠質瘢痕以及囊性空洞形成等[2]。近年研究發現，成年哺乳動物創傷性脊髓損傷后的原發及繼發性損傷會逐漸改變損傷部位的細胞組成及組織結構，最終在損傷部位形成一個阻止軸突再生的抑制微環境。此外，除了抑制微環境形成外，成年神經元的內在生長潛力較差也是導致脊髓自發再生可能性低的重要因素，最終導致永久性神經缺損[3-6]。但有研究發現，通過調節神經細胞的內在生長潛力或移除脊髓損傷微環境中的某些抑制因素（單一或組合），一些成年神經元和軸突仍具有一定再生能力[5, 7-11]。
雖然脊髓損傷不會顯著影響患者壽命，但可能導致患者生理和心理問題，高昂的治療費用也會給患者家庭及社會帶來沉重負擔[12]。目前，脊髓損傷的臨床治療仍集中在穩定病變組織結構，防止對鄰近脊髓組織的進一步損害，以及通過康復提高患者生活自理能力[13-14]，尚缺少有效促進神經再生和功能恢復的治療方案，而完全性脊髓損傷的修復被認為是臨床研究中最具挑戰性的問題之一[15]。
近年，動物實驗研究已為創傷性脊髓損傷的治療提供了一些新的概念和可行方案，并顯示出臨床轉化潛力。我們團隊在近 20 年的脊髓損傷再生修復研究中，成功建立了哺乳動物脊髓大段缺損完全損傷模型，包括嚙齒類、犬及非人靈長類模型，在臨床研究中也取得了突破性進展。現對神經再生膠原支架移植治療完全性脊髓損傷動物實驗研究的成果，以及通過引導內源性神經元形成橋接改善運動功能的相關研究進展進行總結，并探討完全性脊髓損傷動物中運動功能改善的機制，旨在為下一步完全性脊髓損傷的相關研究提供參考。
1 全橫斷脊髓損傷動物模型制備相關研究
近年用于脊髓損傷修復基礎研究及治療評價的創傷性脊髓損傷動物模型較多，包括挫傷、擠壓傷、橫切及化學損傷等不同致傷因素制備的模型[16-17]。與上述創傷性脊髓損傷模型相比，完全性脊髓損傷模型完全排除了軸突芽生的可能性，可以真實反映軸突再生情況，為研究軸突再生提供了最理想的平臺[18]。目前，許多研究人員將完全性脊髓損傷動物模型作為檢驗神經再生的金標準。與嚙齒類動物模型相比，大動物（如犬）模型在損傷癥狀、不良預后和康復訓練等方面與臨床患者更相似[19]，近十年間完全性脊髓損傷模型從嚙齒動物到大動物逐漸得到改進和完善[20]。但是，由于軸突纖維和脊髓神經元的缺失，完全性脊髓損傷模型制備后實驗動物會出現永久性癱瘓以及一系列繼發性并發癥，如褥瘡、骨質疏松、深靜脈血栓、尿路感染、肌肉痙攣和呼吸并發癥等[20]，因此術后護理要求極高，提高了該類模型使用的難度[21-23]。
在完全性脊髓損傷模型修復研究過程中，我們團隊建立了大鼠 3～6 mm 缺損的全橫斷急性及陳舊性脊髓損傷模型，通過自主研發的神經再生膠原支架結合再生因子或生物拮抗分子[24-27]、人 MSCs[28]、神經干細胞[27, 29]等進行修復，治療后大鼠運動功能均不同程度恢復[30]。我們還率先建立了犬 5 mm～2 cm 急性及陳舊性脊髓損傷模型[20, 31-36]，通過 6 批次近 300 只犬的實驗，證實神經再生膠原支架結合神經再生因子或生物拮抗分子[31-32, 36]、人 MSCs[33]可有效促進損傷部位神經再生及犬運動功能的恢復[20]。此外，我們還成功制備了恒河猴 T9 長段（6 mm）急性全橫斷脊髓損傷模型，并通過此模型驗證了神經再生膠原支架復合生長因子 NT3 在神經損傷修復中的作用。術后 10 個月，與空白對照組以及單純支架材料組相比，實驗組恒河猴運動誘發電位以及后肢運動功能明顯改善，損傷區內的膠質瘢痕沉積明顯減少，而且可見更多的有序神經纖維再生、軸突髓鞘化以及突觸形成。
2 用于修復完全性脊髓損傷的神經再生膠原支架制備及相關研究
隨著生物材料領域的發展，許多生物支架也應用于各種類型脊髓損傷修復，部分生物支架顯示出了一定的臨床應用潛力。研究表明，功能生物支架移植可促使損傷部位產生運動神經元，包括五羥色胺能（5-HT 陽性）、乙酰膽堿能（chAT 陽性）、多巴胺能（TH 陽性）神經元[26, 33, 36-37]。這表明基于功能修飾的生物材料治療方案可以有效促進脊髓損傷部位的神經再生，恢復運動功能。
在脊髓損傷修復中使用的生物支架大多是由重復單元組成的天然聚合物，其具有容易獲得、抗原性低、生物相容性好和可降解等優勢[38]。一種理想的修復脊髓損傷的生物支架需要具備以下性質：① 生物支架能為受損的軸突和神經元的重新生長和遷移提供結構上的支持；② 生物支架具有可調節的生化特性，與脊髓組織機械特性相匹配，而且能夠引導神經元及軸突的生長及遷移[39]；③ 生物支架應易于使用某些具有生物活性的多肽或蛋白因子進行修飾或功能化，實現特定的修復效果；④ 移植入體內的生物支架可以在適當時間內降解，被再生神經組織所替代；⑤ 生物支架及其降解產物無細胞毒性且免疫原性低。我們團隊在近 20 年的研究中，設計研發了一系列神經再生膠原支架，將其移植至損傷造成的缺口時能起到連接兩斷端的作用。這些功能修飾后的神經再生膠原支架不僅能在脊髓橫斷或瘢痕切除后起到物理連接的作用，而且還可以引導內源性神經干細胞分化，促進組織再生及運動功能恢復[40]。
特定的生長因子對組織再生修復具有促進作用。為了實現結合在功能膠原生物支架上的生長因子能長時間緩釋，我們構建了膠原結合肽（collagen-binding domain，CBD）修飾的生長因子 BDNF（CBD-BDNF），與神經再生膠原支架結合治療完全性脊髓損傷比格犬（實驗組），觀察發現治療 38 周后，與空白對照組相比，實驗組膠質瘢痕明顯減少，而且大量神經纖維可以長入損傷區域，超過 40% 的犬在 26～38 周可以站立甚至行走[32]。
由于完全性脊髓損傷后激活的神經干細胞表達 EGF 受體（EGF receptor，EGFR），因此我們利用臨床藥物西妥昔單抗（一種 EGFR 的抗體）與神經再生膠原支架共同孵育，并將修飾后支架移植至大鼠全橫斷脊髓損傷模型的損傷部位。損傷后 15 d，可見內源激活的神經干細胞在損傷部位富集和分化。而在犬全橫斷脊髓損傷模型中，移植西妥昔單抗修飾功能生物材料 9 個月后，可以部分恢復運動誘發電位反應，顯著改善后肢的運動功能[36]。
為了進一步實現結合在膠原支架上的西妥昔單抗長時間緩釋，我們構建了特異性結合 EGFR 抗體的神經再生膠原支架。我們選取了 EGFR 抗體西妥昔單抗蛋白上的功能單元 Fab，結合一段 CBD，成功構建 CBD-Fab 表達載體。在確認修飾后的蛋白生物活性保持不變后，我們將 CBD-Fab 修飾的神經再生膠原支架移植入完全性脊髓損傷大鼠中。結果表明，該支架可以通過與神經干細胞表面 EGFR 結合，特異性吸附神經干細胞，促進其在損傷部位存留及向神經元分化，同時還可以降低膠質瘢痕的沉積，改善大鼠運動功能[26]。而且，將該神經再生膠原支架與外源性神經干細胞一同移植入完全性脊髓損傷大鼠的損傷區，體外移植及體內損傷激活的神經干細胞均會被特異性吸附并存留在支架上，且外源及內源神經干細胞均能分化為神經元[27]。
除了西妥昔單抗及其功能單元外，我們近期研究還證實載有抗癌藥物紫杉醇的神經再生膠原支架能夠有效促進犬長距離脊髓全橫斷損傷后的軸突再生、神經元再生、電生理和運動功能恢復[34]。此外，將人 MSCs 及外源神經干細胞復合膠原神經再生支架進行移植，同樣可以促進大鼠及犬的神經纖維再生、軸突髓鞘化以及突觸形成，經過治療的比格犬可以用癱瘓的后肢站立甚至行走[28-29, 33, 35]。
在臨床前研究的基礎上，我們于 2015 年 1 月 16 日首次開展了神經再生膠原支架移植治療完全性脊髓損傷的臨床研究。在前期 5 例患者中，首次采用術中電生理等手段鑒定神經組織和瘢痕組織，并實施了對瘢痕組織的安全清除，同時進行神經再生膠原支架的移植。經過 1 年的隨訪，結果表明神經再生膠原支架移植治療脊髓損傷安全可行[41]。隨后的研究表明，神經再生膠原支架結合 MSCs 可以促進部分陳舊性完全性脊髓損傷患者植物神經功能改善、感覺平面下降以及手指的運動功能改善等[42]。在急性脊髓損傷臨床研究中，建立了綜合 ASIA 評分、影像學和電生理等的嚴格急性完全性脊髓損傷判定標準，目前已入組 10 余例急性脊髓損傷患者，部分入組患者出現較準確的大小便感覺，下肢出現自主的運動功能恢復，并伴隨有中斷的感覺誘發電位和運動誘發電位的恢復。
綜上所述，經過因子、拮抗劑修飾或復合干細胞的神經再生膠原支架可以有效促進神經再生，實現全橫斷損傷嚙齒動物及犬的運動功能恢復。
3 完全性脊髓損傷運動功能恢復機制研究
鑒于完全性脊髓損傷模型在軸突再生驗證研究中的有效作用，近年來已有越來越多的研究人員運用這種完全性脊髓損傷，尤其是應用胸段完全性脊髓損傷模型（可以完全截斷下肢的上行及下行神經傳導）來研究神經再生及下肢運動功能的恢復。這些研究使用了很多單一或者組合的治療策略，如生長因子[43]、生物活性拮抗劑或多肽[18, 24-27]、臨床用藥[36, 44]、外源細胞移植[27, 33, 35, 37, 45-51]，以及功能性生物支架移植[24-27, 29, 32-36, 52-56]，這些治療策略對完全性脊髓損傷動物的神經再生或運動功能恢復均有不同程度的作用，也對脊髓損傷后功能恢復的機制進行了初步探討。目前研究認為完全性脊髓損傷運動功能恢復機制有 3 種可能的理論，分別為長的運動軸突再生穿過損傷區，損傷區神經元形成橋接連接損傷的兩個斷端，或者兩者兼具。
3.1 運動神經軸突再生理論
研究表明，損傷區的抑制微環境阻礙了軸突再次生長，在無有效干預下，切斷的軸突不太可能自發延伸甚至穿過損傷區，更不可能與它原定的或新的靶向神經元形成連接[57]。因此，一些研究人員嘗試通過改善完全性橫斷后的微環境來促進運動功能的恢復，如通過外周神經搭橋、細胞移植、生物工程方法構建基質或支架等。
在完全性脊髓損傷動物治療研究中，在損傷部位常能檢測到再生的運動性軸突，主要包括組成皮質脊髓束（corticospinal tract，CST）、縫核脊髓束、網狀脊髓束和紅核脊髓束的軸突。這些調節運動功能的下行神經纖維束對改善動物的運動功能非常重要。其中，CST 由于在自主性運動功能恢復中的關鍵作用備受關注。許多研究者認為，在嚴重脊髓損傷后，CST 的再生可能是恢復前肢和后肢運動功能的方法。
回顧分析近十年來完全性脊髓損傷動物軸突再生及運動功能恢復的研究[18, 24-27, 33, 35-37, 43-50, 52-54, 56, 58-65]，我們發現超過一半的研究通過不同的治療策略顯著改善了完全性脊髓損傷動物的運動功能，常用方法包括人工構建神經支架或基質移植修復，同時還可以結合藥物、蛋白因子、各種外源性細胞（如雪旺細胞、嗅神經鞘膠質細胞、神經干細胞、MSCs、少突膠質前體細胞、骨髓基質細胞）以及其他替代物。這些研究均表明，某些截斷的軸突在損傷后會繼續生長，包括五羥色胺能、乙酰膽堿能及多巴胺能的軸突。但是，這些研究中幾乎都沒能發現完全性截斷后的脊髓中有 CST 軸突延伸或穿過損傷區。
早期研究結果表明，只有將大鼠胚胎期脊髓移植至大鼠全橫斷損傷模型的損傷部位，才有可能支持 CST 軸突的再生[66]。在近期的一項研究中，Kadoya 等[59]將從胚胎期 14 d 的大鼠脊髓原基中分離獲得的神經前體細胞移植入 T3 段完全截斷的大鼠模型中，發現部分 CST 軸突可以再生，最長達 1.5 mm。除了胚胎期脊髓移植外，Yang 等[54]將殼聚糖材料復合神經營養因子 NT3 移植至完全性橫斷脊髓大鼠損傷區，發現治療 1 個月后小部分 CST 纖維可以從頭端長入損傷區域，穿過 5 mm 長的損傷區域，進入大鼠尾椎脊髓。但是，CST 纖維的這種再生仍需要通過標記技術得到更準確的結果，以驗證其可信度和可重復性。
在對 CST 軸突再生或芽生的研究中，人們發現了許多抑制或促進因素。在抑制信號通路中研究最多的是 Nogo 介導的抑制信號通路[67-70] 以及雷帕霉素靶蛋白 mTOR 的抑制因子磷酸酶-張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN） [71-74]。但是，這些研究使用的模型并非完全性橫斷脊髓損傷，而是擠壓傷或背側半橫切損傷。在 CST 軸突再生的研究中，即使是脊髓完全性擠壓傷模型中，仍有可能存在殘留的 CST 軸突，其結果也備受爭議。
即使不考慮模型類型及 CST 能否再生，CST 軸突的再生或芽生與運動功能恢復間的關系同樣難以定論。Jin 等[75]的研究發現，條件性敲除感覺運動皮層中細胞因子激活通路的抑制因子 SOCS3，可以促進未損傷的 CST 軸突向去神經化的脊髓中芽生。此外，如果同時敲除 PTEN，CST 軸突芽生的數量及訓練后的運動功能恢復程度都會顯著提高。同時，Geoffroy 等[76]也發現 PTEN 及 PTEN/Nogo 敲除的小鼠中，雖然 CST 軸突的芽生明顯增強，但小鼠功能恢復并不明顯。上述研究報道結果中運動功能恢復的差異可能與不同基因敲除小鼠的運動功能恢復程度不同，以及 CST 軸突的芽生數量及其與尾端靶向神經元的成功連接與否有關，但也使學者們對嚙齒動物中 CST 在運動功能中的作用提出了質疑。
目前，研究發現了越來越多可以促進 CST 軸突芽生或再生的蛋白因子，如肝配蛋白 B3 及其受體 EphA4[77-78]、Krüppel 樣因子 7[79]、信號轉導及轉錄激活因子 3[80]、傳統型蛋白激酶 C[81]、轉錄因子 Sox11[82]及 mTOR 的靶蛋白核糖體 S6 激酶 1[83]。雖然這些研究都表明在非完全性脊髓損傷的嚙齒動物中 CST 軸突可以延伸穿過損傷區，但由于模型的局限性，這些結論都很難證實是否是截斷的 CST 軸突的再生。因此，仍需在完全性橫斷的脊髓損傷模型中證實是否存在與運動功能相關的 CST 軸突的再生。
迄今為止，最新的關于 CST 再生的綜述為 2012 年由 Tuszynski 及 Steward 發表的[57]。有一些研究認為觀察到 CST 再生的現象缺乏時間及可重復性的檢驗。因此，在完全性脊髓損傷動物中通過脊髓移植或人工構建支架移植使 CST 纖維再生缺乏足夠的文獻證實。
綜上所述，對于脊髓損傷后 CST 軸突的生長，已有的研究大多認為其主要是通過殘存的完整的神經纖維芽生來實現功能恢復；而即使是有部分橫斷的 CST 生長，其再生距離和數量也非常有限，迄今尚缺乏客觀研究證實全橫斷后運動軸突（如 CST 軸突）可以再生穿過損傷缺口實現運動功能恢復。由目前的研究結果來看，通過 CST 軸突長距離再生實現完全性脊髓損傷動物的運動功能恢復的可行性仍未可知。
3.2 內源性神經橋接理論
在全橫斷脊髓損傷的嚙齒動物及犬模型中，很多治療方案都可以顯著改善動物模型運動功能。由于全橫斷后運動軸突（如 CST 軸突）再生機制至今仍未明確，有些學者提出在重新連接截斷的脊髓束并恢復運動功能中起重要作用的并非運動軸突再生，而是外源或內源神經元分化形成橋接，連接損傷的兩個斷端[36-37, 51, 54, 84]。移植或內源的神經干細胞可以定向分化成多種神經元，在損傷部位形成神經橋接，促使新的突觸連接，形成環路，改善脊髓損傷后動物的運動功能[36-37, 54]。基于這種理論，外源神經干細胞/神經前體細胞近年來被廣泛應用于脊髓損傷的治療。在動物實驗中，外源神經干細胞/神經前體細胞移植后可分化為神經細胞，補充損傷部位缺失的神經元及營養因子，重新形成神經橋接，促進運動功能的恢復[37, 47, 85-86]。
但是，外源神經干細胞/神經前體細胞移植應用于臨床還面臨巨大的挑戰。首先，除存在的倫理問題外，從人的胚胎組織中獲得的神經前體細胞仍存在成瘤的風險；其次，由于成人自體神經前體細胞很難獲得，接受同種異體神經前體細胞移植的患者必須通過免疫抑制來減弱免疫排斥反應；再次，成人神經前體細胞的體外擴增目前還非常困難，使得臨床上很難獲得足夠量的細胞進行移植[87]。最后，移植用神經前體細胞最合適的來源、數量，給藥途徑及移植的方式目前都不清楚[87]。因此，我們重點關注人工構建的神經再生膠原支架引導內源神經干細胞發揮作用，來改善嚙齒動物和犬的運動功能的進展。
3.2.1 內源神經干細胞來源
許多研究已證明，位于成體脊髓中央管中的室管膜細胞具有神經干細胞樣潛能[88-89]。這些細胞在正常組織中并不活動，但在損傷后的脊髓組織中會被激活并遷移至損傷部位[88, 90-91]。在腦缺血或中風后，腦組織中的神經干細胞會分化為神經元，并替代受損的神經元，修復神經連接[92-93]。但是，被激活的室管膜細胞在損傷后 4 周內傾向于分化為膠質細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）陰性（未成熟的）的星形膠質細胞（占所有星形膠質細胞的 53%），并未分化為神經元[94]。其余 47% 由幼稚星形膠質細胞分化的 GFAP 陽性（成熟的）的星形膠質細胞會積聚在損傷區中央，并形成密集的膠質瘢痕，這是小鼠受傷 2 周后軸突再生的主要障礙[95-96]。
近年來，研究認為巢蛋白（nestin）/腦脂質結合蛋白（brain lipid binding protein，BLBP）陽性的神經干細胞存在于中央管及正常脊髓中，據此我們在 T8 段脊髓全橫斷損傷的大鼠模型中發現了體內脊髓來源的神經干細胞的激活時間軸[36]。損傷發生后，nestin 陽性的神經干細胞在損傷脊髓的鄰近節段中大量聚集，在第 5 天達高峰，并隨著離損傷部位的距離增加而逐漸減少。此外，中央管及脊髓中的神經干細胞與室管膜細胞的特征有所區別，中央管中由損傷激活的神經干細胞可被常規的神經干細胞標記物 nestin 和 BLBP 所標記，但卻不能被干細胞的標記物 Sox2 標記，而中央管中的室管膜細胞可以被這 3 種標記物同時標記。Yang 等及我們近期研究均表明，脊髓完全性截斷后，小部分 nestin 陽性的神經干細胞會自發分化為神經元，這種分化效率會隨著藥物的使用而提高[36, 54]。上述研究結果提示，如果經過適當的引導，內源神經干細胞可能相比室管膜細胞更有可能成為治療完全性脊髓損傷的一種細胞來源。
3.2.2 神經再生膠原支架作用
通過嚙齒動物及犬的全橫斷脊髓損傷模型進行大量脊髓損傷再生修復研究后，我們發現雖然神經再生膠原支架很難在脊髓完全性橫斷后促進運動軸突的再生，但研究結果均支持完全性脊髓損傷后運動功能恢復機制中的第 2 種理論，即經過功能性修飾后的神經再生膠原支架可以引導內源性神經干細胞分化，形成神經橋接，重新連接損傷的兩個斷端，實現完全性橫斷的脊髓損傷動物的運動功能改善。
在將小鼠 T8 段脊髓完全截斷 5 d 后，大部分被激活的神經干細胞會聚集在鄰近損傷部位的脊髓組織中，而只有很少一部分出現在損傷區中心[36]。這是由于完全性橫斷會造成脊髓組織中一定長度缺口，如果缺乏適合的引導，被損傷激活的神經干細胞就無法遷移。在利用神經再生膠原支架結合西妥昔單抗治療完全性脊髓損傷大鼠的研究中，在損傷后 15 d，雖然不同治療組損傷部位的頭端及尾端都觀察到相似數量的神經干細胞，但功能修飾的神經再生膠原支架移植組與單純神經再生膠原支架移植組相比，損傷中心部位神經干細胞的密度明顯更高[36]。我們近期的一系列研究表明，被損傷激活的神經干細胞不會自發地遷移至損傷部位，而經過適當修飾的功能支架可以在適當的時間釋放和分布生物活性因子，引導內源神經干細胞的遷移路線[26-27, 30, 36, 97]。
除了在大鼠完全性脊髓損傷模型中證明了特定修飾的神經再生膠原支架可以促進內源損傷激活的神經干細胞在損傷部位富集及分化外，我們研究還證實了大動物（犬）的完全性脊髓損傷模型中同樣存在神經發生。在移植后 9 個月，我們在損傷部位同樣觀察到了更多成熟的神經元[36]，而且這些神經元可以在損傷部位發育為具有髓鞘化軸突及突觸結構的各種功能神經元，如五羥色胺能、乙酰膽堿能及多巴胺能神經元[36]。基于以上研究結果，我們提出了功能修飾的神經再生膠原支架可以引導損傷激活的神經干細胞分化為神經元，形成神經橋接，連接損傷的兩個斷端，進而促進運動功能恢復的理論[40, 42, 98]。
綜上述，相關研究提示在完全性脊髓損傷動物模型中，尚缺少客觀充分證據證實運動軸突，尤其是 CST 軸突可以再生。因此，3 種完全性脊髓損傷運動功能恢復的可能機制中，只有第 2 種內源神經橋接機制更可行（圖 1）。
圖1
完全性脊髓損傷后，皮質脊髓束無法再生穿過損傷部 位；功能修飾的神經再生膠原支架可以引導損傷激活的 內源神經干細胞分化為神經元，形成神經橋接，連接 損傷的兩個斷端，促進運動功能恢復
Figure1.
Guiding neuronal relays formation by bio-scaffolds implantation is more feasible than directing long motor axons regeneration in improving motor function of animals with complete spinal cord transection
成功引導內源脊髓神經干細胞遷移至損傷部位只是完全性脊髓損傷后形成新的神經橋接并恢復運動功能的第一步，這些遷移至損傷部位的神經干細胞及其子代如何才能向神經元分化、成熟并形成新的功能連接，是接下來需要考慮和解決的問題。
4 展望
大量研究表明，僅阻斷細胞外抑制因素促進受傷軸突或長脊髓束再生無明顯效果，在神經元中可能存在重要細胞和分子機制來控制軸突再生[8-9, 11, 15, 99-102]。目前報道的組合治療策略中，尚無一種能很好地在全橫斷脊髓損傷動物中促進運動軸突（如 CST）長距離生長并穿過損傷區。由于 CST 軸突是控制人體自主運動功能最重要的運動軸突，可能必須有足夠的 CST 纖維再生穿過損傷區，并與原定的尾端靶向神經元精確聯接，才能顯著地促進運動功能的恢復。
因此，引導內源神經干細胞的再生可能是除了 CST 軸突再生之外更為可行的恢復運動功能的策略。雖然嚴重的脊髓損傷使大量的神經元丟失、神經回路被擾亂、運動功能嚴重受損，但也同時激活了處于靜息狀態的內源脊髓神經干細胞。如果能夠引導這些神經干細胞及其子代遷移至損傷部位，它們就會為神經功能重建提供充足的細胞來源。因此，損傷激活的內源神經干細胞是一種潛在的治療細胞源。然而，將這種方法用于臨床尚有大量問題需要解決。成體動物脊髓損傷后，內源脊髓神經干細胞（包括室管膜細胞）已被證實可以被損傷激活并大量擴增[103]，但尚無研究報道導致脊髓神經干細胞激活和向損傷區邊緣遷移的原因或誘導因素，相關機制也未明確。此外，不同內源神經干細胞的分化能力及分化特性可能也存在差異。成年室管膜細胞在體外培養時會表現出類似神經干細胞的特性，具有多能性，可分化為星形膠質細胞、少突膠質細胞及神經元[93]，但體內的室管膜細胞在脊髓損傷后并不能分化為神經元，而且我們的研究也發現，與有定向神經元分化能力的神經干細胞相比，室管膜細胞在體內表現出非常不同的分化特性[36]。
完全性脊髓損傷后修復的主要目的是重建受損的神經環路。因此，明確損傷后激活的內源性脊髓神經干細胞的分化能力和特性，以及影響不同細胞向神經元分化的因子和信號通路對于形成神經元橋接、連接損傷斷端來說是亟待解決的問題。將修飾后的功能神經膠原支架移植入損傷部位，構建適合神經元分化的微環境，可以有效引導損傷激活的神經干細胞分化形成更多的神經元及少突膠質細胞，進而促進損傷部位的神經再生、髓鞘化，重建損傷部位的神經橋接。
即使在損傷部位有足夠的神經再生、軸突髓鞘化，形成充足的神經橋接，有時運動功能的恢復也不如預期。如 Lu 等的研究發現，在大鼠 T3 全橫斷脊髓損傷的亞急性期，通過移植過表達 BDNF 大鼠 MSCs 后可以觀察到損傷部位神經橋接及突觸的形成，但運動功能反而變得更差。事實上，一些關于促進軸突再生的研究也表明，CST 再生也直接導致了運動功能惡化[49, 104]。這種神經橋接的形成與運動功能惡化之間矛盾的原因可能是由于再生的軸突未能與下游靶向神經元形成正確的突觸連接造成的。因此，如何在重建神經橋接中促進新生軸突與下游靶向神經元間形成正確而有效的連接，是今后設計全橫斷脊髓損傷治療方案時必須要考慮的重要問題。
