引用本文： 吳培仁, 莊嚴陣, 逯曉暉, 陳波, 張海芳, 盧傳輝, 黃紅浪, 劉凱華. 人乳頭狀瘤病毒感染與閩南人食管癌發生的關系. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(6): 799-802. doi: 10.7507/1007-4848.20140229 復制
自1982年Syrjanen首次報道人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)與食管鱗癌的關系后[1]，大量研究揭示HPV是導致食管鱗癌發病率高的一個重要病因學因素[2-3]，但其致瘤機制尚未完全闡明。HPV是一類雙鏈閉合環狀DNA病毒，具有高度組織特異性和宿主特異性，基因組約為8 000 bp[4]，HPV DNA基因組按其功能分為3個編碼區： (1)早期基因編碼參與病毒DNA復制、轉錄及細胞轉化的蛋白；(2)晚期基因編碼病毒結構蛋白；(3)上游調節區位于E區和L區之間，包含啟動子等調控元件，與病毒DNA復制轉錄的調控有關[5]。現已經明確基因組全序列有80多種DNA病毒分型[6]，其中15種高危致病亞型包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73和HPV-82，而HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-44為低危型[7]；目前已有證實HPV-16和HPV-18病毒分型也是食管鱗癌的主要高危致病亞型[8]。曹邦偉等[9]納入1982~2009年關于HPV感染與食管癌關聯的病例對照進行Meta分析發現，HPV高危型(HPV-16和HPV-18)的感染與食管癌的發生依然顯示出明顯的易感關聯。由于HPV具有高度組織特異性和宿主特異性，至今尚不能在體外培養，又無合適的實驗動物，因而對其檢測主要依賴于形態學方法和分子生物學技術。而實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescenen quantitation polymerase chain reaction，FQ-PCR)技術是近年來發展起來的新核酸檢測技術，主要是應用熒光檢測PCR儀，在PCR反應體系中加入熒光基團，并通過計算機控制，利用熒光信號積累實現對每一個循環的PCR擴增產物進行實時動態檢測和結果自動分析，且PCR擴增和產物分析的全部過程均在單管封閉條件下進行，較好解決普通PCR擴增產物污染和不能定量的問題，是一種高特異性和高敏感性的先進分子生物學技術[10]；崔金環等[11]研究提示FQ-PCR技術具有價格適中、操作簡便等優點，在普通的PCR實驗室均可開展，是臨床檢測HPV感染的另一有效手段。
我們對閩南人食管鱗癌、癌旁正常組織及健康人食管黏膜標本進行HPV檢測，探討HPV在閩南人食管鱗癌和健康閩南人中感染情況及HPV感染與閩南人食管鱗癌發生的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
2009年10月至2012年12月，出生生長于閩南地區并講閩南方言未做任何化學、放射治療經手術病理證實的食管鱗癌100例為食管癌組，按2011年中國食管癌規范化診治指南，食管鱗癌分為高分化、中分化、低分化和未分化癌，本組高分化鱗癌3例、中分化鱗癌77例、低分化鱗癌20例；年齡35~78 (51.62±6.37)歲，男64例、女36例。癌旁組為食管癌組的癌旁正常組織取樣，與食管癌組為同一組患者。同期出生生長于閩南地區并講閩南方言經內窺鏡體檢的健康人100名(取得體檢者知情同意書)為健康組；年齡35~76 (52.35±6.72)歲，男66例、女34例。
1.2 研究方法
將手術切除的新鮮食管鱗癌標本的癌組織及癌旁正常組織各取100份，和體檢內窺鏡獲取健康人食管上皮組織100份，采用FQ-PCR技術進行HPV-DNA檢測，檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產。按照試劑盒提供的操作流程提取各份樣本DNA，每份樣本分別構建兩個PCR體系，兩個體系的通用引物和探針包含的亞型分別為低危HPV-6型和HPV-11型，高危HPV-16型和HPV-18型；同時在羅氏480PCR擴增儀上進行擴增，擴增程序按試劑要求編輯。陽性結果判斷：如果增長曲線呈S型曲線且Ct值<40，則試驗結果判為陽性，最終根據每份樣本兩個體系的陽性結果情況綜合判斷HPV型別組合情況。
1.3 統計學分析
統計分析采用SPSS16.0軟件包，計數資料采用實際例數及百分比表示，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 食管鱗癌患者、癌旁組織及健康人HPV感染情況
食管鱗癌患者中有22例癌組織HPV感染，感染率為22.0%；健康人中有6例HPV感染，感染率為6.0%，兩組差異有統計學意義(χ2=10.63，P < 0.01)。另有8例為癌旁組織感染HPV，感染率為8.0%；癌旁組與健康組的差異無統計學意義(χ2=0.307，P > 0.05)。食管癌組與癌旁組的差異有統計學意義(χ2=7.686，P < 0.01)，見表 1。
表1
食管鱗癌、癌旁組織和健康人HPV感染情況
2.2 食管癌患者、癌旁組織和健康人各型HPV感染情況
食管癌組食管上皮組織HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18陽性感染者分別為11例、11例、14例、15例，健康人組分別為5例、5例、6例、6例，兩組差異無統計學意義(χ2=0.013，P > 0.05)。癌旁組的各型HPV陽性感染者分別為5例、6例、7例、8例，癌旁組和健康人組的各型HPV陽性率差異也無統計學意義(χ2=0.144，P > 0.05)。癌旁組和食管癌組的各型HPV陽性率差異亦無統計學意義(χ2=0.077，P > 0.05)，見表 2。
表2
食管癌患者、癌旁組織和健康人各型HPV感染例數(例)
2.3 食管鱗癌細胞分化程度的HPV感染情況
在100例食管癌中，高、中、低分化鱗癌分別有1例、21例、5例HPV陽性，感染率分別為33.33% (1/3)、27.27% (21/77)、25.0% (5/20)。高、中分化鱗癌兩組間HPV陽性率差異無統計學意義(χ2=0.869，P > 0.05)；高、低分化鱗癌兩組間HPV陽性率差異無統計學意義(χ2=1.679，P > 0.05)；中、低分化鱗癌兩組間HPV陽性率差異無統計學意義(χ2=0.0133，P > 0.05)，見表 3。
表3
食管鱗癌細胞分化程度的HPV感染情況(例)
3 討論
食管癌是我國常見惡性腫瘤之一，病理類型以鱗狀細胞癌為主，占食管癌的90%以上。而食管癌的發生具有明顯的民族、地域性差異，其發生與遺傳、環境、飲食和某些微生物感染密切相關。閩南地區也是我國食管癌高發區之一，近年發病率達26.37/10萬，死亡率高達57.12/10萬。HPV是人類易感病毒，它與人類鱗狀上皮具有高度親和性。人們通過分子生物學方法對食管癌HPV DNA進行檢測后發現，在不同地區及同一地區的食管癌，不同試驗組檢測陽性率相差很大，在0%~100%之間均有報道[12]，造成這些感染率差異的原因可能與標本來源、標本數量、環境地理因素、遺傳易感性和檢測方法不同等有關。
本研究結果顯示100例閩南人的食管鱗癌和對應100例癌旁正常鱗狀上皮組織及100例健康人食管黏膜組織HPV感染陽性率分別為22%、8%和6%，表明HPV感染在食管癌發生、發展的不同階段可能產生一定的作用。陳衛剛等[13]應用巢式PCR法檢測哈薩克族食管鱗癌及哈薩克族正常食管組織HPV感染情況，結果顯示：HPV在哈薩克族食管鱗癌及哈薩克族正常食管組織感染率分別為66.67%和12.12%，且兩組感染HPV的陽性率差異有統計學意義(P <0.01)，提示HPV感染在食管癌發生發展不同階段可能發揮重要作用。吳發福等[14]應用免疫組織化學ABC法檢測江蘇淮安地區食管鱗癌及正常食管黏膜HPV感染率分別為74.0%和0.0%，且兩組感染HPV的陽性率差異有統計學意義(P < 0.05)，提示HPV感染可能為江蘇淮安地區食管癌發病的一個獨立的危險因素。王悅冬等[15]研究梅州市客家人食管癌與HPV感染有關。崔明辰等[16]研究也提示食管鱗癌與HPV感染有關，認為造成食管HPV感染率差異的原因可能與標本來源、標本數量、環境地理因素、遺傳易感性和檢測方法不同有關。
本研究顯示閩南食管鱗癌HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18各型感染率分別為11%、11%、14%、15%，與健康人的HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18各型感染率為5%、5%、6%、6%，其差異無統計學意義(P > 0.05)；食管癌旁組的各型HPV感染率為5%、6%、7%、8%，與健康組差異也無統計學意義(P > 0.05)。楊蘭等[17]認為：HPV DNA在良性和癌前病變中以游離形式存在，而在惡性腫瘤中整合于基因細胞中，下游區域HPV-16、HPV-18E6和E7整合入宿主細胞后參與細胞的增殖與轉化，E7基因可通過與Rb家族相互作用使細胞周期失控，DNA大量合成并喪失DNA復制的保真度；E6基因則通過結合并降解P53，阻止DNA的修復或阻止細胞進入程序性死亡。顯示HPV-18在已有HPV-16感染的食管鱗癌中可加強HPV-16的致癌作用，即當HPV-16，HPV-18合并感染時提高了細胞病變的風險，說明HPV-16、HPV-18感染在致癌功能上存在協同互補作用。由于HPV一般要在感染二、三十年后致癌，這么長的潛伏期可能與病毒整合到宿主適當的位置需要很長的時間有關；在同一細胞內可以有多條染色體的病毒整合，體現了腫瘤發生為多步驟、多基因的特點。
本研究顯示閩南食管癌細胞分化程度的HPV感染率分別為高分化鱗癌33.33%，中分化鱗癌27.27%，低分化鱗癌25.0%，在組織病理學分級的差異上無統計學意義(P > 0.05)。提示病毒的復制與細胞的成熟、角化程度有關，細胞角化程度越高，病毒越大量復制，細胞分化越差，越不利于病毒的復制。姚品芳等[18]研究湖北鐘祥河南移民與湖北本地居民的HPV感染與食管鱗癌細胞的分化程度無明顯相關性(P > 0.05)，認為HPV感染主要與病毒的細胞轉化功能及致癌性有關。陳云昭等[19]在研究HPV感染與新疆哈薩克族食管鱗癌發生關系的探討中也發現，HPV感染陽性率在食管鱗癌的分化程度之間差異無統計學意義(P > 0.05)。周素明等[20]在研究HPV感染與新疆維吾爾族食管鱗癌發生關系中，也發現HPV感染陽性率與食管鱗癌的分化程度之間差異無統計學意義(P > 0.05)。這提示在某些分化程度較低的食管鱗癌組織中，HPV檢測可能為陰性，但細胞的惡變還是由HPV導致的。
本研究認為，HPV感染為閩南地區食管癌發病的一個因素，但食管癌的發生、發展是多因素介入及多個基因改變多步驟的過程，即食管癌變被認為是一個多階段、進行性的發展過程。要確定HPV感染與閩南食管癌的關系，需要大量檢測正常人群和高發區人群中HPV感染情況，并收集更多的流行病學資料進行追蹤隨訪，同時檢測食管癌其他相關因素與食管癌及HPV感染相互作用關系，從基因、遺傳、環境、飲食等多方面探討HPV與閩南食管癌發生發展的關系。
自1982年Syrjanen首次報道人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)與食管鱗癌的關系后[1]，大量研究揭示HPV是導致食管鱗癌發病率高的一個重要病因學因素[2-3]，但其致瘤機制尚未完全闡明。HPV是一類雙鏈閉合環狀DNA病毒，具有高度組織特異性和宿主特異性，基因組約為8 000 bp[4]，HPV DNA基因組按其功能分為3個編碼區： (1)早期基因編碼參與病毒DNA復制、轉錄及細胞轉化的蛋白；(2)晚期基因編碼病毒結構蛋白；(3)上游調節區位于E區和L區之間，包含啟動子等調控元件，與病毒DNA復制轉錄的調控有關[5]。現已經明確基因組全序列有80多種DNA病毒分型[6]，其中15種高危致病亞型包括HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-68、HPV-73和HPV-82，而HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-44為低危型[7]；目前已有證實HPV-16和HPV-18病毒分型也是食管鱗癌的主要高危致病亞型[8]。曹邦偉等[9]納入1982~2009年關于HPV感染與食管癌關聯的病例對照進行Meta分析發現，HPV高危型(HPV-16和HPV-18)的感染與食管癌的發生依然顯示出明顯的易感關聯。由于HPV具有高度組織特異性和宿主特異性，至今尚不能在體外培養，又無合適的實驗動物，因而對其檢測主要依賴于形態學方法和分子生物學技術。而實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescenen quantitation polymerase chain reaction，FQ-PCR)技術是近年來發展起來的新核酸檢測技術，主要是應用熒光檢測PCR儀，在PCR反應體系中加入熒光基團，并通過計算機控制，利用熒光信號積累實現對每一個循環的PCR擴增產物進行實時動態檢測和結果自動分析，且PCR擴增和產物分析的全部過程均在單管封閉條件下進行，較好解決普通PCR擴增產物污染和不能定量的問題，是一種高特異性和高敏感性的先進分子生物學技術[10]；崔金環等[11]研究提示FQ-PCR技術具有價格適中、操作簡便等優點，在普通的PCR實驗室均可開展，是臨床檢測HPV感染的另一有效手段。
我們對閩南人食管鱗癌、癌旁正常組織及健康人食管黏膜標本進行HPV檢測，探討HPV在閩南人食管鱗癌和健康閩南人中感染情況及HPV感染與閩南人食管鱗癌發生的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
2009年10月至2012年12月，出生生長于閩南地區并講閩南方言未做任何化學、放射治療經手術病理證實的食管鱗癌100例為食管癌組，按2011年中國食管癌規范化診治指南，食管鱗癌分為高分化、中分化、低分化和未分化癌，本組高分化鱗癌3例、中分化鱗癌77例、低分化鱗癌20例；年齡35~78 (51.62±6.37)歲，男64例、女36例。癌旁組為食管癌組的癌旁正常組織取樣，與食管癌組為同一組患者。同期出生生長于閩南地區并講閩南方言經內窺鏡體檢的健康人100名(取得體檢者知情同意書)為健康組；年齡35~76 (52.35±6.72)歲，男66例、女34例。
1.2 研究方法
將手術切除的新鮮食管鱗癌標本的癌組織及癌旁正常組織各取100份，和體檢內窺鏡獲取健康人食管上皮組織100份，采用FQ-PCR技術進行HPV-DNA檢測，檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產。按照試劑盒提供的操作流程提取各份樣本DNA，每份樣本分別構建兩個PCR體系，兩個體系的通用引物和探針包含的亞型分別為低危HPV-6型和HPV-11型，高危HPV-16型和HPV-18型；同時在羅氏480PCR擴增儀上進行擴增，擴增程序按試劑要求編輯。陽性結果判斷：如果增長曲線呈S型曲線且Ct值<40，則試驗結果判為陽性，最終根據每份樣本兩個體系的陽性結果情況綜合判斷HPV型別組合情況。
1.3 統計學分析
統計分析采用SPSS16.0軟件包，計數資料采用實際例數及百分比表示，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 食管鱗癌患者、癌旁組織及健康人HPV感染情況
食管鱗癌患者中有22例癌組織HPV感染，感染率為22.0%；健康人中有6例HPV感染，感染率為6.0%，兩組差異有統計學意義(χ2=10.63，P < 0.01)。另有8例為癌旁組織感染HPV，感染率為8.0%；癌旁組與健康組的差異無統計學意義(χ2=0.307，P > 0.05)。食管癌組與癌旁組的差異有統計學意義(χ2=7.686，P < 0.01)，見表 1。
表1
食管鱗癌、癌旁組織和健康人HPV感染情況
2.2 食管癌患者、癌旁組織和健康人各型HPV感染情況
食管癌組食管上皮組織HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18陽性感染者分別為11例、11例、14例、15例，健康人組分別為5例、5例、6例、6例，兩組差異無統計學意義(χ2=0.013，P > 0.05)。癌旁組的各型HPV陽性感染者分別為5例、6例、7例、8例，癌旁組和健康人組的各型HPV陽性率差異也無統計學意義(χ2=0.144，P > 0.05)。癌旁組和食管癌組的各型HPV陽性率差異亦無統計學意義(χ2=0.077，P > 0.05)，見表 2。
表2
食管癌患者、癌旁組織和健康人各型HPV感染例數(例)
2.3 食管鱗癌細胞分化程度的HPV感染情況
在100例食管癌中，高、中、低分化鱗癌分別有1例、21例、5例HPV陽性，感染率分別為33.33% (1/3)、27.27% (21/77)、25.0% (5/20)。高、中分化鱗癌兩組間HPV陽性率差異無統計學意義(χ2=0.869，P > 0.05)；高、低分化鱗癌兩組間HPV陽性率差異無統計學意義(χ2=1.679，P > 0.05)；中、低分化鱗癌兩組間HPV陽性率差異無統計學意義(χ2=0.0133，P > 0.05)，見表 3。
表3
食管鱗癌細胞分化程度的HPV感染情況(例)
3 討論
食管癌是我國常見惡性腫瘤之一，病理類型以鱗狀細胞癌為主，占食管癌的90%以上。而食管癌的發生具有明顯的民族、地域性差異，其發生與遺傳、環境、飲食和某些微生物感染密切相關。閩南地區也是我國食管癌高發區之一，近年發病率達26.37/10萬，死亡率高達57.12/10萬。HPV是人類易感病毒，它與人類鱗狀上皮具有高度親和性。人們通過分子生物學方法對食管癌HPV DNA進行檢測后發現，在不同地區及同一地區的食管癌，不同試驗組檢測陽性率相差很大，在0%~100%之間均有報道[12]，造成這些感染率差異的原因可能與標本來源、標本數量、環境地理因素、遺傳易感性和檢測方法不同等有關。
本研究結果顯示100例閩南人的食管鱗癌和對應100例癌旁正常鱗狀上皮組織及100例健康人食管黏膜組織HPV感染陽性率分別為22%、8%和6%，表明HPV感染在食管癌發生、發展的不同階段可能產生一定的作用。陳衛剛等[13]應用巢式PCR法檢測哈薩克族食管鱗癌及哈薩克族正常食管組織HPV感染情況，結果顯示：HPV在哈薩克族食管鱗癌及哈薩克族正常食管組織感染率分別為66.67%和12.12%，且兩組感染HPV的陽性率差異有統計學意義(P <0.01)，提示HPV感染在食管癌發生發展不同階段可能發揮重要作用。吳發福等[14]應用免疫組織化學ABC法檢測江蘇淮安地區食管鱗癌及正常食管黏膜HPV感染率分別為74.0%和0.0%，且兩組感染HPV的陽性率差異有統計學意義(P < 0.05)，提示HPV感染可能為江蘇淮安地區食管癌發病的一個獨立的危險因素。王悅冬等[15]研究梅州市客家人食管癌與HPV感染有關。崔明辰等[16]研究也提示食管鱗癌與HPV感染有關，認為造成食管HPV感染率差異的原因可能與標本來源、標本數量、環境地理因素、遺傳易感性和檢測方法不同有關。
本研究顯示閩南食管鱗癌HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18各型感染率分別為11%、11%、14%、15%，與健康人的HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18各型感染率為5%、5%、6%、6%，其差異無統計學意義(P > 0.05)；食管癌旁組的各型HPV感染率為5%、6%、7%、8%，與健康組差異也無統計學意義(P > 0.05)。楊蘭等[17]認為：HPV DNA在良性和癌前病變中以游離形式存在，而在惡性腫瘤中整合于基因細胞中，下游區域HPV-16、HPV-18E6和E7整合入宿主細胞后參與細胞的增殖與轉化，E7基因可通過與Rb家族相互作用使細胞周期失控，DNA大量合成并喪失DNA復制的保真度；E6基因則通過結合并降解P53，阻止DNA的修復或阻止細胞進入程序性死亡。顯示HPV-18在已有HPV-16感染的食管鱗癌中可加強HPV-16的致癌作用，即當HPV-16，HPV-18合并感染時提高了細胞病變的風險，說明HPV-16、HPV-18感染在致癌功能上存在協同互補作用。由于HPV一般要在感染二、三十年后致癌，這么長的潛伏期可能與病毒整合到宿主適當的位置需要很長的時間有關；在同一細胞內可以有多條染色體的病毒整合，體現了腫瘤發生為多步驟、多基因的特點。
本研究顯示閩南食管癌細胞分化程度的HPV感染率分別為高分化鱗癌33.33%，中分化鱗癌27.27%，低分化鱗癌25.0%，在組織病理學分級的差異上無統計學意義(P > 0.05)。提示病毒的復制與細胞的成熟、角化程度有關，細胞角化程度越高，病毒越大量復制，細胞分化越差，越不利于病毒的復制。姚品芳等[18]研究湖北鐘祥河南移民與湖北本地居民的HPV感染與食管鱗癌細胞的分化程度無明顯相關性(P > 0.05)，認為HPV感染主要與病毒的細胞轉化功能及致癌性有關。陳云昭等[19]在研究HPV感染與新疆哈薩克族食管鱗癌發生關系的探討中也發現，HPV感染陽性率在食管鱗癌的分化程度之間差異無統計學意義(P > 0.05)。周素明等[20]在研究HPV感染與新疆維吾爾族食管鱗癌發生關系中，也發現HPV感染陽性率與食管鱗癌的分化程度之間差異無統計學意義(P > 0.05)。這提示在某些分化程度較低的食管鱗癌組織中，HPV檢測可能為陰性，但細胞的惡變還是由HPV導致的。
本研究認為，HPV感染為閩南地區食管癌發病的一個因素，但食管癌的發生、發展是多因素介入及多個基因改變多步驟的過程，即食管癌變被認為是一個多階段、進行性的發展過程。要確定HPV感染與閩南食管癌的關系，需要大量檢測正常人群和高發區人群中HPV感染情況，并收集更多的流行病學資料進行追蹤隨訪，同時檢測食管癌其他相關因素與食管癌及HPV感染相互作用關系，從基因、遺傳、環境、飲食等多方面探討HPV與閩南食管癌發生發展的關系。
