引用本文： 王建華, 袁林靜, 鐘志敏, 梁榮鑫, 李伯海, 溫哲盛. GOLPH3通過EMT促進食管癌轉移的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(7): 672-676. doi: 10.7507/1007-4848.20150171 復制
食管癌是發展中國家最為高發的惡性腫瘤之一，其發病率在男性惡性腫瘤中排第5，在女性中排第8。而死亡率在男性中排第4，在女性中排第7。食管癌發病率最高的地區包括我國中部及北方地區，其中90%以上病理類型為鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），這與發達國家以食管腺癌為主的發病特點有所不同[1]。《2013年中國腫瘤登記年報》中通過對2010年全國腫瘤患者資料的統計顯示，食管癌占男性新發惡性腫瘤病例的10.01%，占死亡病例的10.39%；占女性新發惡性腫瘤病例的5.05%，死亡病例的7.24%[2]。由此可見，雖然由于近年來癌癥早期篩查手段的進步，食管癌的發病率有所下降[3]，食管癌治療仍是難題。目前食管癌最有效的治療手段為手術治療[4-5]，化療和放療為輔助治療手段。通過對食管癌發病機制的深入研究，來尋找更多更有針對性的治療靶點，是目前臨床亟待解決的問題。在食管癌轉移患者中，分子靶向藥物應用已有一些臨床研究，Cetuximab、Trastuzumab、Bevacizumab等分子靶向藥物的臨床應用開始進入Ⅲ期臨床試驗階段[6]。然而關于食管癌發病及其轉移相關的分子機制，仍有待進一步探索。
為研究食管鱗癌發生發展的分子機制，我們在前期工作的基礎上進一步研究Golgi phosphoprotein 3 （GOLPH3，也被命名為GPP34/GMx33/MIDAS）對食管鱗癌生物學行為的影響。GOLPH3因其高爾基體膜結合定位的特性，在2000年首次報道[7]。由于其蛋白序列從酵母到人類高度保守，因此被認為它在高爾基體膜的功能中發揮重要作用。研究發現，GOLPH3最主要的作用在與反面高爾基體膜上最主要的脂質成份Ptdlns （4） P直接結合，它同時與MYO18A結合，為維持高爾基體的正常伸展結構提供張力[8]，同時參與反面高爾基體在蛋白轉運、加工修飾及蛋白反向運輸（trans-golgh network，TGN）等一系列細胞生物學行為[9-14]。目前研究顯示GOLPH3是一個癌基因，在多種腫瘤組織中高表達，而且腫瘤組織中GOLPH3表達升高的患者預后較差[15-21]，但有關GOLPH3在腫瘤轉移機制方面的研究較少見。
我們的前期研究發現，GOLPH3在食管鱗癌中高表達，GOLPH3表達水平越高，患者臨床分期越晚，預后越差，且GOLPH3是食管鱗癌患者的獨立預后因素[22]。在此基礎上，我們構建了食管鱗癌KYSE-140穩定過表達及穩定敲降GOLPH3細胞系，并進一步研究了GOLPH3對食管鱗癌細胞轉移能力的影響。
1 材料與方法
1.1 細胞培養
GOLPH3各穩定細胞系均以KYSE-140食管鱗癌細胞系為基礎[23]，以慢病毒顆粒感染并嘌呤霉素（EMD Millipore,Billerica,MA,USA）篩選建立。KYSE-140-vector、KYSE-140-GOLPH3細胞系為我實驗室前期實驗中所構建穩定過表達GOLPH3細胞系及其空白對照；KYSE-140-scramble、KYSE-140-GOLPH3-RNAi細胞系為我實驗室前期實驗中所構建穩定敲降GOLPH3細胞系。篩選成功后以含0.5 μg/ml嘌呤霉素的DMEM完全培養基（DMEM+10%FBS；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）37℃，95%相對濕度，5%CO2細胞培養箱中維持加壓培養。
1.2 劃痕實驗
消化后收集細胞：以 2×105細胞接種到六孔板培養。待細胞達100%的融合度時，于細胞中央筆直劃痕，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗懸浮細胞，每孔加入無血清DMEM培養基（life technologies），在37℃，95%相對濕度，5%CO2細胞培養箱中繼續培養，0 h、24 h觀察各組細胞的遷移變化。
1.3 Transwell侵襲實驗
Matrigel （BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA） 4℃過夜溶解后，以完全培養基1︰3稀釋，每個24孔板小室上下室膜之間加入50 μl，并放入37℃細胞培養箱中，靜置30 min凝固。消化并收集對數生長期細胞，取2×104細胞以200 μl無血清培養基清洗，并重懸細胞加入上室，下室加入完全培養基600 μl，并將細胞培養板放入37℃，95%相對濕度，5%CO2培養箱中培養，24 h后擦去上室中Matrigel及細胞，膜下室面結晶紫染色后拍照計數，檢測各組細胞侵襲能力的變化。
1.4 3D培養
Matrigel 4℃過夜溶解后，于24孔板中每孔加入 100 μl，于37℃細胞培養箱中靜置30 min凝固。消化收集對數生長期細胞，每孔加入2×104/ml細胞懸液 500 μl，37℃，95%相對濕度，5%CO2細胞培養箱中培養，每 3～4 d換培養基培養，10～14 d后顯微鏡下觀察。
1.5 qRT-PCR
消化收集對數期細胞后，1×PBS洗細胞2次，加入Trizol （Life Technologies）后逐步提取細胞總RNA。20 μl應體系中加入2×Mix SYBR Green I 10μl（Promega，Madison，WI，USA），上、下游引物（10 pM）各0.25 μl，樣品模板RNA 100 ng，滅菌無酶水補足20μl。反應條件95℃ 2 min預變性，循環內95℃ 30 s變性，60℃退火35 s，PCR反應設置40個循環。以β-actin為內參檢測各基因的相對表達水平。
1.6 統計學分析
本文中實驗結果均為3次獨立重復實驗結果，統計方法采用重復測量方差分析。統計學分析采用PASW Statistics 18軟件，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 食管鱗癌中GOLPH3促進細胞遷移
通過劃痕實驗檢測GOLPH3對食管鱗癌細胞遷移能力的影響。KYSE-140-GOLPH3為穩定過表達GOLPH3食管鱗癌細胞系，并以空載體包裝病毒并構建KYSE-140-vector作為空白對照。KYSE-140-GOLPH3-RNAi為穩定敲降GOLPH3食管鱗癌細胞系，并以Scramble序列構建陰性對照KYSE-140-scramble細胞系。劃痕后24 h，KYSE-140-GOLPH3劃痕面積最小，細胞遷移速度較KYSE-140-vector明顯增快，而KYSE-140-GOLPH3-RNAi遷移速度較KYSE-140-scramble明顯受到抑制（圖 1 A）。兩對照組細胞間劃痕愈合速度無明顯差別。
圖1
GOLPH3促進食管癌細胞系KYSE-140的轉移
注：A為各穩定細胞系劃痕后24 h 400倍放大下觀察劃痕愈合情況；B為各穩定細胞系Matrigel Transwell 侵襲實驗，穿過24 h 后400倍放大拍照（左），1個高倍鏡視野下穿過細胞計數（右）；C為各穩定細胞系3D培養14 d后200倍放大觀察細胞團形態；*
2.2 食管鱗癌中GOLPH3促進細胞侵襲
通過Transwell小室中鋪Matrigell的實驗，來檢測GOLPH3對食管癌細胞侵襲能力的影響。24 h后KYSE-140-GOLPH3穿過細胞數為KYSE-140-vector的2.4倍，KYSE-140-GOLPH3-RNAi穿過細胞數僅為KYSE-140-scramble細胞的一半，而KYSE-140-vector與KYSE-140-scramble間無明顯差別（圖 1B）。結果表明，GOLPH3過表達促進食管癌細胞的侵襲，而GOLPH3表達下調則對食管細胞遷移產生抑制作用。
進一步用3D培養的方法，觀察GOLPH3在模擬體內微環境的Matrigel基質中對細胞侵襲能力的影響。經過4 d培養，細胞在基質中形成單克隆。KYSE-140-GOLPH3細胞可形成向外侵襲生長的單克隆細胞團，KYSE-140-vector所形成的細胞團更為不規則并產生更多的偽足狀突起。KYSE-140-GOLPH3-RNAi所形成的細胞團則呈圓形，基本沒有向外侵襲生長的趨勢（圖 1C）。實驗結果表明，在更接近體內的環境中，GOLPH3的表達升高同樣增加細胞的侵襲能力。
2.3 GOLPH3促進食管鱗癌細胞轉移的分子機制
在穩定調控GOLPH3表達的細胞系中，我們檢測了轉移相關分子的mRNA表達水平，以初步探索GOLPH3對ESCC細胞轉移能力調控的分子機制。qRT-PCR結果顯示，KYSE-140-GOLPH3細胞中CYR61、CD44及Snail表達水平均較KYSE-140-vector中明顯升高，差異有統計學意義。而在KYSE-140-GOLPH3-RNAi細胞中，這3者的表達均較KYSE-140-scramble中明顯抑制。KYSE-140-vector與KYSE-140-scramble間CYR61、CD44及Snail表達水平無明顯差別（圖 2）。
圖2
各穩定調控GOLPH3 KYSE-140細胞系中細胞轉移相關信號分子表達
3 討論
GOLPH3是一個新發現的癌基因，通過調節高爾基體的功能及高爾基體膜上酶的定位參與到蛋白質糖基化修飾中，從而對細胞功能產生影響[24]。GOLPH3對腫瘤發生發展的促進作用已經在多種腫瘤中被報道，例如在神經膠質瘤、前列腺癌、舌癌、乳腺癌、胃癌、肝癌中均發現，GOLPH3升高時患者的總生存時間和無瘤生存時間均明顯縮短，在這些腫瘤中，GOLPH3的升高與腫瘤組織分化差、臨床分級晚均有相關性[19-21, 25-26]。目前對GOLPH3在腫瘤中作用的研究主要集中在分析患者腫瘤組織中GOLPH3與臨床各指標之間的關系，有關GOLPH3對腫瘤生物學行為影響的分子機制僅有少量報道，例如乳腺癌GOLPH3的升高調節細胞周期相關分子的表達[25]。關于GOLPH3對細胞生長促進作用的研究已證實GOLPH3的高表達與細胞中mTOR通路的激活有關[9, 11]，主要通過激活mTOR通路促進細胞的生長與增殖，這也與GOLPH3在腫瘤發揮癌基因作用的研究結果相符合。有趣的是，除了與腫瘤生長相關因素有關外，在胃癌及肝癌患者病例的研究中也發現，GOLPH3升高的患者更易發生淋巴結和遠處轉移[19-20]。我們的前期工作中也發現，GOLPH3能成為食管鱗癌患者的獨立預后因素，其表達的食管鱗癌患者癌組織分化程度較差，臨床及手術分期較晚，而且較多出現淋巴結轉移[22]。這些結果均提示，GOLPH3不僅促進細胞生長，還與細胞轉移能力有關。目前有關GOLPH3對腫瘤細胞轉移機制方面的研究，僅有Zhou及同事報道，認為GOLPH3通過上調RhoA促進細胞骨架的重構，從而促進膠質瘤細胞的遷移與侵襲[27]。我們已經研究過GOLPH3對食管鱗癌細胞KYSE-140生長的促進作用，并將進一步研究GOLPH3對食管鱗癌細胞轉移功能的影響。
前期工作中我們已建立了GOLPH3穩定高表達與低表達的KYSE-140細胞系，利用這些細胞系，我們對GOLPH3表達水平對KYSE-140細胞轉移能力的影響進行了研究。劃痕實驗通過無血清環境排除了細胞生長對實驗結果的干擾，檢測GOLPH3對細胞遷移能力的影響。在GOLPH3穩定過表達細胞系中，細胞向劃痕中間遷移的速度明顯加快，相應的，GOLPH3穩定敲降細胞系的遷移則受到抑制。除遷移能力外，細胞的侵襲能力也是腫瘤細胞得以轉移的基礎。Transwell侵襲實驗中我們看到，GOLPH3過表達后KYSE-140細胞更容易穿過Matrigel形成的基質層而穿過Transwell小室的膜出現在下層小室中，而GOLPH3敲降后，細胞的侵襲力下降。兩個分開的實驗分別從遷移能力和侵襲能力兩方面顯示出GOLPH3在體外對ESCC細胞轉移的促進作用。我們又進一步以Matrigel為基質3D培養的方式，在體外模擬細胞在體內的微環境[28]，GOLPH3過表達后，細胞團在Matrigel中呈現向外侵襲的生長方式，形成偽足樣結構，侵襲至周圍基質成份中，而GOLPH3敲降的細胞則較其陰性對照細胞更加缺乏向外侵襲性生長的特性。
我們的研究顯示GOLPH3可促進食管鱗癌細胞的轉移，目前普遍認為腫瘤細胞發生EMT是腫瘤細胞轉移的一種重要途徑[29-32]。為了解GOLPH3促進食管鱗癌細胞轉移的機制，我們進一步檢測了與EMT發生有關的幾個重要基因CYR61，CD44及Snail在食管鱗癌細胞的mRNA表達水平。Cysteine-rich angiogenic inducer 61 （CYR61）可促進腫瘤細胞發生上皮間質細胞轉化[33-25]，Snail則是EMT發生的關鍵分子[36]，CD44不直接參與細胞的轉移與侵襲過程，卻與細胞外基質有廣泛的相互作用，從而促進細胞的運動與轉移[37-39]，除此之外CD44還有可能通過更為復雜的機制促進細胞生物學行為的改變[40]，而CD44本身也是腫瘤干細胞最為經典的標志物之一[41-44]。我們的研究結果證實三者的mRNA表達水平均與GOLPH3mRNA表達水平呈正相關，提示GOLPH3可能是通過EMT的發生與腫瘤細胞向干細胞的轉化而促進食管鱗癌細胞的轉移。然而，更為成熟的理論仍需要進一步驗證。
我們的前期工作驗證了GOLPH3在食管鱗癌腫瘤進展中對腫瘤細胞轉移的促進作用，并提出這種促進作用可能是通過CYR61、CD44及Snail的上調，促進細胞EMT及干細胞轉化而實現的。這些研究將成為我們新的工作的基石，為找到食管鱗癌新的治療靶點提供理論依據。
食管癌是發展中國家最為高發的惡性腫瘤之一，其發病率在男性惡性腫瘤中排第5，在女性中排第8。而死亡率在男性中排第4，在女性中排第7。食管癌發病率最高的地區包括我國中部及北方地區，其中90%以上病理類型為鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC），這與發達國家以食管腺癌為主的發病特點有所不同[1]。《2013年中國腫瘤登記年報》中通過對2010年全國腫瘤患者資料的統計顯示，食管癌占男性新發惡性腫瘤病例的10.01%，占死亡病例的10.39%；占女性新發惡性腫瘤病例的5.05%，死亡病例的7.24%[2]。由此可見，雖然由于近年來癌癥早期篩查手段的進步，食管癌的發病率有所下降[3]，食管癌治療仍是難題。目前食管癌最有效的治療手段為手術治療[4-5]，化療和放療為輔助治療手段。通過對食管癌發病機制的深入研究，來尋找更多更有針對性的治療靶點，是目前臨床亟待解決的問題。在食管癌轉移患者中，分子靶向藥物應用已有一些臨床研究，Cetuximab、Trastuzumab、Bevacizumab等分子靶向藥物的臨床應用開始進入Ⅲ期臨床試驗階段[6]。然而關于食管癌發病及其轉移相關的分子機制，仍有待進一步探索。
為研究食管鱗癌發生發展的分子機制，我們在前期工作的基礎上進一步研究Golgi phosphoprotein 3 （GOLPH3，也被命名為GPP34/GMx33/MIDAS）對食管鱗癌生物學行為的影響。GOLPH3因其高爾基體膜結合定位的特性，在2000年首次報道[7]。由于其蛋白序列從酵母到人類高度保守，因此被認為它在高爾基體膜的功能中發揮重要作用。研究發現，GOLPH3最主要的作用在與反面高爾基體膜上最主要的脂質成份Ptdlns （4） P直接結合，它同時與MYO18A結合，為維持高爾基體的正常伸展結構提供張力[8]，同時參與反面高爾基體在蛋白轉運、加工修飾及蛋白反向運輸（trans-golgh network，TGN）等一系列細胞生物學行為[9-14]。目前研究顯示GOLPH3是一個癌基因，在多種腫瘤組織中高表達，而且腫瘤組織中GOLPH3表達升高的患者預后較差[15-21]，但有關GOLPH3在腫瘤轉移機制方面的研究較少見。
我們的前期研究發現，GOLPH3在食管鱗癌中高表達，GOLPH3表達水平越高，患者臨床分期越晚，預后越差，且GOLPH3是食管鱗癌患者的獨立預后因素[22]。在此基礎上，我們構建了食管鱗癌KYSE-140穩定過表達及穩定敲降GOLPH3細胞系，并進一步研究了GOLPH3對食管鱗癌細胞轉移能力的影響。
1 材料與方法
1.1 細胞培養
GOLPH3各穩定細胞系均以KYSE-140食管鱗癌細胞系為基礎[23]，以慢病毒顆粒感染并嘌呤霉素（EMD Millipore,Billerica,MA,USA）篩選建立。KYSE-140-vector、KYSE-140-GOLPH3細胞系為我實驗室前期實驗中所構建穩定過表達GOLPH3細胞系及其空白對照；KYSE-140-scramble、KYSE-140-GOLPH3-RNAi細胞系為我實驗室前期實驗中所構建穩定敲降GOLPH3細胞系。篩選成功后以含0.5 μg/ml嘌呤霉素的DMEM完全培養基（DMEM+10%FBS；Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）37℃，95%相對濕度，5%CO2細胞培養箱中維持加壓培養。
1.2 劃痕實驗
消化后收集細胞：以 2×105細胞接種到六孔板培養。待細胞達100%的融合度時，于細胞中央筆直劃痕，1×磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗懸浮細胞，每孔加入無血清DMEM培養基（life technologies），在37℃，95%相對濕度，5%CO2細胞培養箱中繼續培養，0 h、24 h觀察各組細胞的遷移變化。
1.3 Transwell侵襲實驗
Matrigel （BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA） 4℃過夜溶解后，以完全培養基1︰3稀釋，每個24孔板小室上下室膜之間加入50 μl，并放入37℃細胞培養箱中，靜置30 min凝固。消化并收集對數生長期細胞，取2×104細胞以200 μl無血清培養基清洗，并重懸細胞加入上室，下室加入完全培養基600 μl，并將細胞培養板放入37℃，95%相對濕度，5%CO2培養箱中培養，24 h后擦去上室中Matrigel及細胞，膜下室面結晶紫染色后拍照計數，檢測各組細胞侵襲能力的變化。
1.4 3D培養
Matrigel 4℃過夜溶解后，于24孔板中每孔加入 100 μl，于37℃細胞培養箱中靜置30 min凝固。消化收集對數生長期細胞，每孔加入2×104/ml細胞懸液 500 μl，37℃，95%相對濕度，5%CO2細胞培養箱中培養，每 3～4 d換培養基培養，10～14 d后顯微鏡下觀察。
1.5 qRT-PCR
消化收集對數期細胞后，1×PBS洗細胞2次，加入Trizol （Life Technologies）后逐步提取細胞總RNA。20 μl應體系中加入2×Mix SYBR Green I 10μl（Promega，Madison，WI，USA），上、下游引物（10 pM）各0.25 μl，樣品模板RNA 100 ng，滅菌無酶水補足20μl。反應條件95℃ 2 min預變性，循環內95℃ 30 s變性，60℃退火35 s，PCR反應設置40個循環。以β-actin為內參檢測各基因的相對表達水平。
1.6 統計學分析
本文中實驗結果均為3次獨立重復實驗結果，統計方法采用重復測量方差分析。統計學分析采用PASW Statistics 18軟件，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 食管鱗癌中GOLPH3促進細胞遷移
通過劃痕實驗檢測GOLPH3對食管鱗癌細胞遷移能力的影響。KYSE-140-GOLPH3為穩定過表達GOLPH3食管鱗癌細胞系，并以空載體包裝病毒并構建KYSE-140-vector作為空白對照。KYSE-140-GOLPH3-RNAi為穩定敲降GOLPH3食管鱗癌細胞系，并以Scramble序列構建陰性對照KYSE-140-scramble細胞系。劃痕后24 h，KYSE-140-GOLPH3劃痕面積最小，細胞遷移速度較KYSE-140-vector明顯增快，而KYSE-140-GOLPH3-RNAi遷移速度較KYSE-140-scramble明顯受到抑制（圖 1 A）。兩對照組細胞間劃痕愈合速度無明顯差別。
圖1
GOLPH3促進食管癌細胞系KYSE-140的轉移
注：A為各穩定細胞系劃痕后24 h 400倍放大下觀察劃痕愈合情況；B為各穩定細胞系Matrigel Transwell 侵襲實驗，穿過24 h 后400倍放大拍照（左），1個高倍鏡視野下穿過細胞計數（右）；C為各穩定細胞系3D培養14 d后200倍放大觀察細胞團形態；*
2.2 食管鱗癌中GOLPH3促進細胞侵襲
通過Transwell小室中鋪Matrigell的實驗，來檢測GOLPH3對食管癌細胞侵襲能力的影響。24 h后KYSE-140-GOLPH3穿過細胞數為KYSE-140-vector的2.4倍，KYSE-140-GOLPH3-RNAi穿過細胞數僅為KYSE-140-scramble細胞的一半，而KYSE-140-vector與KYSE-140-scramble間無明顯差別（圖 1B）。結果表明，GOLPH3過表達促進食管癌細胞的侵襲，而GOLPH3表達下調則對食管細胞遷移產生抑制作用。
進一步用3D培養的方法，觀察GOLPH3在模擬體內微環境的Matrigel基質中對細胞侵襲能力的影響。經過4 d培養，細胞在基質中形成單克隆。KYSE-140-GOLPH3細胞可形成向外侵襲生長的單克隆細胞團，KYSE-140-vector所形成的細胞團更為不規則并產生更多的偽足狀突起。KYSE-140-GOLPH3-RNAi所形成的細胞團則呈圓形，基本沒有向外侵襲生長的趨勢（圖 1C）。實驗結果表明，在更接近體內的環境中，GOLPH3的表達升高同樣增加細胞的侵襲能力。
2.3 GOLPH3促進食管鱗癌細胞轉移的分子機制
在穩定調控GOLPH3表達的細胞系中，我們檢測了轉移相關分子的mRNA表達水平，以初步探索GOLPH3對ESCC細胞轉移能力調控的分子機制。qRT-PCR結果顯示，KYSE-140-GOLPH3細胞中CYR61、CD44及Snail表達水平均較KYSE-140-vector中明顯升高，差異有統計學意義。而在KYSE-140-GOLPH3-RNAi細胞中，這3者的表達均較KYSE-140-scramble中明顯抑制。KYSE-140-vector與KYSE-140-scramble間CYR61、CD44及Snail表達水平無明顯差別（圖 2）。
圖2
各穩定調控GOLPH3 KYSE-140細胞系中細胞轉移相關信號分子表達
3 討論
GOLPH3是一個新發現的癌基因，通過調節高爾基體的功能及高爾基體膜上酶的定位參與到蛋白質糖基化修飾中，從而對細胞功能產生影響[24]。GOLPH3對腫瘤發生發展的促進作用已經在多種腫瘤中被報道，例如在神經膠質瘤、前列腺癌、舌癌、乳腺癌、胃癌、肝癌中均發現，GOLPH3升高時患者的總生存時間和無瘤生存時間均明顯縮短，在這些腫瘤中，GOLPH3的升高與腫瘤組織分化差、臨床分級晚均有相關性[19-21, 25-26]。目前對GOLPH3在腫瘤中作用的研究主要集中在分析患者腫瘤組織中GOLPH3與臨床各指標之間的關系，有關GOLPH3對腫瘤生物學行為影響的分子機制僅有少量報道，例如乳腺癌GOLPH3的升高調節細胞周期相關分子的表達[25]。關于GOLPH3對細胞生長促進作用的研究已證實GOLPH3的高表達與細胞中mTOR通路的激活有關[9, 11]，主要通過激活mTOR通路促進細胞的生長與增殖，這也與GOLPH3在腫瘤發揮癌基因作用的研究結果相符合。有趣的是，除了與腫瘤生長相關因素有關外，在胃癌及肝癌患者病例的研究中也發現，GOLPH3升高的患者更易發生淋巴結和遠處轉移[19-20]。我們的前期工作中也發現，GOLPH3能成為食管鱗癌患者的獨立預后因素，其表達的食管鱗癌患者癌組織分化程度較差，臨床及手術分期較晚，而且較多出現淋巴結轉移[22]。這些結果均提示，GOLPH3不僅促進細胞生長，還與細胞轉移能力有關。目前有關GOLPH3對腫瘤細胞轉移機制方面的研究，僅有Zhou及同事報道，認為GOLPH3通過上調RhoA促進細胞骨架的重構，從而促進膠質瘤細胞的遷移與侵襲[27]。我們已經研究過GOLPH3對食管鱗癌細胞KYSE-140生長的促進作用，并將進一步研究GOLPH3對食管鱗癌細胞轉移功能的影響。
前期工作中我們已建立了GOLPH3穩定高表達與低表達的KYSE-140細胞系，利用這些細胞系，我們對GOLPH3表達水平對KYSE-140細胞轉移能力的影響進行了研究。劃痕實驗通過無血清環境排除了細胞生長對實驗結果的干擾，檢測GOLPH3對細胞遷移能力的影響。在GOLPH3穩定過表達細胞系中，細胞向劃痕中間遷移的速度明顯加快，相應的，GOLPH3穩定敲降細胞系的遷移則受到抑制。除遷移能力外，細胞的侵襲能力也是腫瘤細胞得以轉移的基礎。Transwell侵襲實驗中我們看到，GOLPH3過表達后KYSE-140細胞更容易穿過Matrigel形成的基質層而穿過Transwell小室的膜出現在下層小室中，而GOLPH3敲降后，細胞的侵襲力下降。兩個分開的實驗分別從遷移能力和侵襲能力兩方面顯示出GOLPH3在體外對ESCC細胞轉移的促進作用。我們又進一步以Matrigel為基質3D培養的方式，在體外模擬細胞在體內的微環境[28]，GOLPH3過表達后，細胞團在Matrigel中呈現向外侵襲的生長方式，形成偽足樣結構，侵襲至周圍基質成份中，而GOLPH3敲降的細胞則較其陰性對照細胞更加缺乏向外侵襲性生長的特性。
我們的研究顯示GOLPH3可促進食管鱗癌細胞的轉移，目前普遍認為腫瘤細胞發生EMT是腫瘤細胞轉移的一種重要途徑[29-32]。為了解GOLPH3促進食管鱗癌細胞轉移的機制，我們進一步檢測了與EMT發生有關的幾個重要基因CYR61，CD44及Snail在食管鱗癌細胞的mRNA表達水平。Cysteine-rich angiogenic inducer 61 （CYR61）可促進腫瘤細胞發生上皮間質細胞轉化[33-25]，Snail則是EMT發生的關鍵分子[36]，CD44不直接參與細胞的轉移與侵襲過程，卻與細胞外基質有廣泛的相互作用，從而促進細胞的運動與轉移[37-39]，除此之外CD44還有可能通過更為復雜的機制促進細胞生物學行為的改變[40]，而CD44本身也是腫瘤干細胞最為經典的標志物之一[41-44]。我們的研究結果證實三者的mRNA表達水平均與GOLPH3mRNA表達水平呈正相關，提示GOLPH3可能是通過EMT的發生與腫瘤細胞向干細胞的轉化而促進食管鱗癌細胞的轉移。然而，更為成熟的理論仍需要進一步驗證。
我們的前期工作驗證了GOLPH3在食管鱗癌腫瘤進展中對腫瘤細胞轉移的促進作用，并提出這種促進作用可能是通過CYR61、CD44及Snail的上調，促進細胞EMT及干細胞轉化而實現的。這些研究將成為我們新的工作的基石，為找到食管鱗癌新的治療靶點提供理論依據。
