引用本文： 黃駿榮, 祝忠群, 劉剛, 陳會文, 馮林音. 新生小鼠腦切片體外循環灌流模型中白質損傷的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(4): 295-300. doi: 10.7507/1007-4848.201605007 復制
以往認為腦白質損傷是早產兒特有的神經損傷，近年隨著新生兒先天性心臟病手術的開展，核磁共振研究發現，在足月新生兒體外循環手術后也發生腦白質損傷，而且發生率高達 25%～50% 以上[1-2]，嚴重影響患兒神經和心理發育，導致在手術近、遠期出現包括精細和粗大運動缺陷等在內的嚴重神經發育障礙和心理行為問題[3]。
盡管在臨床上觀察到體外循環后白質損傷現象，但是在人體研究中，由于技術和倫理等因素的影響，至今還沒有直接的人類體外循環下白質損傷的病理學和細胞學證據，因此人們只有通過借助動物體外循環模型來證實白質損傷的存在。先前研究者往往采用大動物或小動物進行模擬人類體外循環灌注的方式來研究腦損傷[4-6]，由于這類模型影響因素眾多，實驗條件控制難度也比較大，對腦組織損傷的評價很難做到精確定位和實時取材，近年來許多研究者采用腦組織切片進行體外灌流的模型來研究白質損傷[7-9]，為此我們擬建立新生大鼠離體腦切片體外灌注模型，通過控制灌流溫度及采用氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）方法來模擬不同溫度體外循環灌注以及停循環狀態[10-11]，研究這一模型是否可以模擬體外循環和停循環的病理生理過程，并探討在 OGD 狀態下是否可以造成白質中少突膠質前體細胞（preoligodendrocytes，preOL）損傷，為體外循環白質損傷提供直接的細胞學證據。
1 材料及方法
1.1 實驗動物、試劑及分組
1.1.1 實驗動物 7 天齡 Sprague-Dawley（SD）大鼠，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗操作嚴格遵守中國科學院上海藥物研究所實驗動物管理委員會規定。
1.1.2 實驗試劑 少突膠質細胞標記物 O4（O4 為腦硫脂）抗體購自 Millipore 公司。髓鞘堿性蛋白 MBP 抗體購自 Abcam 公司。羊抗兔 IgG 熒光二抗購自 Invitrogen 公司。其他相關試劑均由 Sigma-Aldrich 公司提供。
1.1.3 分組 將 40 只 SD 大鼠隨機制作活體腦切片，每只大鼠約切出 3～5 片腦切片，后將腦切片隨機分為 5 組，每組含腦切片 24 片，包括 36℃ 氧合人工腦脊液對照組及 60 min 不同溫度下（36℃，32℃，25℃，15℃）的OGD組。
1.2 腦切片灌流模型建立
1.2.1 實驗方法 將大鼠麻醉，無菌條件下迅速解剖動物的大腦，并立即置入冰冷的切片用人工腦脊液（SaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，25 mmol/L 葡萄糖，75 mmol/L 蔗糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）內。用 Mcllwain 組織切割器將大腦以冠狀切面切成 400 μm 厚腦切片，并將其置于含有氧合 SaCSF 的培養皿，在 37℃，95% 濕度及 5% CO2 濃度下培養至少 1 h。最后將腦切片轉移至含有灌流用人工腦脊液（PaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L葡萄糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）的定制灌流培養皿中，連接管道建立灌流系統，并將其放置于可調控溫度的培養箱（上海博訊實業有限公司，中國）中，模擬體外循環灌流及其溫度變化。
表1
人工腦脊液灌流液成分
1.2.2 氧糖剝奪 OGD被用于復制深低溫停循環在心臟手術中的應用。通過改變灌流溶液，其中 PaCSF 中的葡萄糖被取代為 10 mmol/L 的蔗糖，并以 95% 氮氣/5% 二氧化碳進行氣體混合。當 OGD 結束后將灌流溶液更換回 PaCSF 溶液，并進行 24 h 持續灌流。
1.2.3 灌流系統和流程 在 36℃ 下建立平衡灌流系統后，用約 30 min 降溫至目標溫度，之后在目標溫度水平更換 OGD 溶液，以此進行 60 min 氧糖剝奪過程。當 OGD 結束時，將灌流溶液更換為氧合 PaCSF，進行 10 min 再氧合，隨后用約 30 min 復溫至 36℃，并維持持續灌注約 24 h。對照組為在 36℃ 及相同周期下持續灌流氧合 PaCSF。灌流系統和流程見圖 1、圖 2。
圖1
實驗灌流系統示意圖
圖2
灌流程序示意圖
1.3 免疫鑒定方法
灌流程序結束后，取出腦切片并加入 4% 多聚甲醛（PFA）于室溫固定 1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.4）清洗 3 遍；然后加入 30% 蔗糖溶液 4℃ 冰箱過夜孵育；切底脫水后用組織冰凍切片包埋劑（OCT）在冰凍切片機包埋，將腦片切成 20 μm 切片并置于載玻片上；室溫下用含 10% 葡萄糖及 5% 牛血清白蛋白的封閉液封閉 1 h。將稀釋好的一抗孵育玻片上的腦切片，濕盒中 4℃ 冰箱過夜孵育。少突膠質細胞標記物 O4 抗體及髓鞘堿性蛋白 MBP 抗體的稀釋濃度分別為：1：100 及 1：200。次日，用 PBS 清洗玻片 3 次，再以 1：200 比例稀釋聯有熒光的二抗，用與一抗相同的方法加 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育玻片，室溫避光 1 h，用 PBS 洗 3 遍后用防淬滅封片劑 Dako Cytomation 封片，Olympus 倒置熒光顯微鏡觀察。圖形的定量處理用 Image-pro plus 5.1 軟件完成。每一張腦切片在胼胝體部位隨機選取 3 個視野采 400 倍照片，并計算每個視野的 O4 陽性染色數量與 DAPI 陽性染色數量的百分比值。熒光綠色提示為 O4 陽性表達，藍色提示為 DAPI 陽性表達。
1.4 統計學分析
對免疫熒光染色的實驗結果進行統計學分析，各組數據之間利用 GraphPad Prism 6 軟件通過 one way ANOVA 及 Bonferroni post hoc test 進行差異性檢驗。計量資料以均數±標準差（ ）表示。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 腦切片灌流 OGD 后髓鞘堿性蛋白 MBP 熒光表達及形態
MBP 表達的變化可作為腦白質損傷程度的指標。為探討本實驗腦切片模型能否有效復制體外循環 DHCA 所引起的腦白質損傷，測試了在灌流程序后髓鞘 MBP 的表達程度。MBP 免疫熒光染色表明，MBP 陽性細胞的形態學和熒光表達改變在對照組及 15℃ OGD 組之間差異無統計學意義。然而，MBP 陽性細胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 組均出現不同程度的形態改變以及熒光表達減少，并與 OGD 溫度呈顯著正相關（圖 3）。
圖3
離體腦切片 OGD 灌流模型 MBP 免疫熒光鑒定 ×400，MBP 陽性免疫熒光染色呈白色； a. 對照組； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD；e. 36℃ OGD
2.2 腦切片灌流 OGD 后 O4 熒光表達
少突膠質細胞前體細胞（preOL，O4+）是在人類孕中后期及嬰幼兒期腦白質損傷的主要目標細胞。腦切片以 O4 抗體標記來評價 OGD 對 preOL 細胞的損傷程度。O4 陽性細胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 組均出現不同程度的熒光表達減少，并與 OGD 溫度呈顯著正相關。O4 陽性細胞的形態學和熒光表達改變在對照組及 15℃ OGD 組之間差異無統計學意義（圖 4）。
圖4
離體腦切片 OGD 灌流模型 O4 免疫熒光鑒定 ×400，O4 陽性免疫熒光染色呈綠色，DAPI 陽性免疫熒光染色呈藍色； a. 對照組； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD； e. 36℃ OGD； f. 統計圖，各組 O4 陽性細胞與 DAPI 陽性細胞百分比，與對照組比較，*P<0.01
3 討論
3.1 離體腦切片灌流模型的建立與意義
在小兒心臟外科體外循環腦損傷研究中，一般采用大動物如幼年豬、狗和羊或者小動物如幼年大鼠和豚鼠等在體外利用氧合器和滾軸泵建立類似手術中體外循環，來模擬體外循環和深低溫停循環過程，進而研究和評價腦損傷及其程度以及各種防治方法有效性[4-6]。這一模型完全模擬病人手術中體外循環狀態，較準確反映了體外循環下全身器官灌注和損傷，但是這種模型雖然反映了腦整體器官的病理生理狀態，但是在評價腦組織細微結構以及組織和分子生物學方面，不能做到腦區域精確定位、不能及時有效地獲得腦組織、而且在取材時腦組織容易受損從而影響腦損傷的評價，同時在動物模型干擾因素眾多、費用較貴。
近年來，腦切片灌流方法廣泛應用各種腦病理生理以及各種藥物評價研究中[12-14]，其優點在于：（1）能夠較為精確定位病變區域，在組織、細胞以及分子水平上觀察腦損傷狀況；（2）灌流系統能夠很好控制實驗條件，如腦組織灌流溫度、PH 值、灌流液體化學成份、氧合情況以及灌流時間等，實驗重復性好；（3）取材方便、簡單易行且費用低廉。最近美國國立兒童醫院也采用腦切片灌流模型用于研究腦白質損傷[7-9]，通過控制灌流溫度和采用 OGD，較好地模擬類似手術中體外循環和 DHCA 腦損傷的特點。受到這些研究的啟發，我們在中國科學院上海藥物研究所的幫助下，建立了新生小鼠腦切片灌流系統，并采用 OGD 方法模擬 DHCA，研究結果發現，調整不同的灌注和 OGD 溫度時，腦白質中形成軸突髓鞘的成熟少突膠質細胞（MBP 陽性）受損，而且隨著溫度上升，細胞形態變化和熒光表達明顯減低，這種細胞損傷程度變化與體外循環和停循環病理生理完全灌注模型較好地復制了手術中體外循環及 DHCA 病理生理過程和效應。
相比一些體外細胞實驗模型，腦切片灌流模型仍有相對較完整的組織細胞結構，更全面地反應腦細胞在損傷過程中的共同作用，狀態更接近體內實驗，可以達到體內動物模型同樣的研究效應能力，在研究白質損傷中具有得天獨厚的優勢。但是這一模型在研究整體機體狀態，如血流動力學、腦組織變化以及長期神經系統發育等方面較為欠缺[15-16]。
3.2 CPB/DHCA 對白質的損傷
本研究部分應用離體腦切片灌流模型，研究 CPB/DHCA 對腦白質 preOL 損傷。我們首先利用 MBP 免疫熒光初步檢測腦白質在 OGD 灌流后的損傷程度，結果顯示 MBP 陽性細胞在不同溫度 OGD 設置呈現不同程度的損傷，在 25℃、32℃ 及 36℃ 出現顯著的細胞損失及形態改變，包括突觸消失及細胞膜變薄碎化等。結果提示腦白質細胞會受 OGD 影響出現急性損傷，更為重要的是我們發現利用 O4 免疫熒光染色觀察腦切片模型在實施不同溫度的 OGD 灌流后（O4+）損傷狀態，可見在 36℃ OGD 下 preOL 有顯著損失，在 15℃ OGD 損失程度則顯著減少，可見 preOL 損傷與各溫度 OGD 組中呈現正性相關。從以上數據表明 CPB/DHCA 能引起 preOL 損傷。
preOL 是少突膠質細胞（OL）細胞系發育的重要階段，在人胚胎后 3 個月是腦白質中 OL 細胞中的主要細胞，約占 90%，到出生時達到 50%[17]。在 OL 細胞系中，PreOL 對缺血缺氧損傷最敏感，也是感染和炎癥損傷的靶細胞[6,18]。preOL 損傷可有以下 3 種結局[19]：（1）preOL 急性死亡；（2）preOL 存活但正常細胞進程喪失，隨后的細胞分化和髓鞘化失敗；（3）preOL 異常。無論何種損傷，由于 preOL 數量急劇減少，其隨后的細胞分化為成熟 OL 也明顯減少，結果是髓磷脂合成減少和軸突髓鞘化障礙，最終導致腦白質低髓鞘化和白質損傷[18-20]。因此 PreOL 損傷是最終導致白質損傷的細胞學基礎。在本研究中我們發現體外循環和停循環模型中的確存在 preOL 損傷和數量減少以及成熟 OL 明顯減少，從而進一步導致整個白質低髓鞘化和損傷。
本研究建立了新生小鼠腦切片體外灌流和 OGD 模型，證實這種模型可有效模擬和復制臨床心臟手術中 CPB 和 DHCA 腦細胞損傷相似特征，簡單易行、且實驗結果具有良好重復性。同時我們發現，這種灌流模型確實可以導致腦白質 preOL 損傷和數量減少，從而觸發一系列 OL 細胞系細胞的改變，出現成熟 OL 細胞數量減少和軸突髓鞘化障礙，最終可導致白質損傷，為體外循環及停循環白質損傷提供了直接的細胞學損傷證據。
以往認為腦白質損傷是早產兒特有的神經損傷，近年隨著新生兒先天性心臟病手術的開展，核磁共振研究發現，在足月新生兒體外循環手術后也發生腦白質損傷，而且發生率高達 25%～50% 以上[1-2]，嚴重影響患兒神經和心理發育，導致在手術近、遠期出現包括精細和粗大運動缺陷等在內的嚴重神經發育障礙和心理行為問題[3]。
盡管在臨床上觀察到體外循環后白質損傷現象，但是在人體研究中，由于技術和倫理等因素的影響，至今還沒有直接的人類體外循環下白質損傷的病理學和細胞學證據，因此人們只有通過借助動物體外循環模型來證實白質損傷的存在。先前研究者往往采用大動物或小動物進行模擬人類體外循環灌注的方式來研究腦損傷[4-6]，由于這類模型影響因素眾多，實驗條件控制難度也比較大，對腦組織損傷的評價很難做到精確定位和實時取材，近年來許多研究者采用腦組織切片進行體外灌流的模型來研究白質損傷[7-9]，為此我們擬建立新生大鼠離體腦切片體外灌注模型，通過控制灌流溫度及采用氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）方法來模擬不同溫度體外循環灌注以及停循環狀態[10-11]，研究這一模型是否可以模擬體外循環和停循環的病理生理過程，并探討在 OGD 狀態下是否可以造成白質中少突膠質前體細胞（preoligodendrocytes，preOL）損傷，為體外循環白質損傷提供直接的細胞學證據。
1 材料及方法
1.1 實驗動物、試劑及分組
1.1.1 實驗動物 7 天齡 Sprague-Dawley（SD）大鼠，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。實驗操作嚴格遵守中國科學院上海藥物研究所實驗動物管理委員會規定。
1.1.2 實驗試劑 少突膠質細胞標記物 O4（O4 為腦硫脂）抗體購自 Millipore 公司。髓鞘堿性蛋白 MBP 抗體購自 Abcam 公司。羊抗兔 IgG 熒光二抗購自 Invitrogen 公司。其他相關試劑均由 Sigma-Aldrich 公司提供。
1.1.3 分組 將 40 只 SD 大鼠隨機制作活體腦切片，每只大鼠約切出 3～5 片腦切片，后將腦切片隨機分為 5 組，每組含腦切片 24 片，包括 36℃ 氧合人工腦脊液對照組及 60 min 不同溫度下（36℃，32℃，25℃，15℃）的OGD組。
1.2 腦切片灌流模型建立
1.2.1 實驗方法 將大鼠麻醉，無菌條件下迅速解剖動物的大腦，并立即置入冰冷的切片用人工腦脊液（SaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，25 mmol/L 葡萄糖，75 mmol/L 蔗糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）內。用 Mcllwain 組織切割器將大腦以冠狀切面切成 400 μm 厚腦切片，并將其置于含有氧合 SaCSF 的培養皿，在 37℃，95% 濕度及 5% CO2 濃度下培養至少 1 h。最后將腦切片轉移至含有灌流用人工腦脊液（PaCSF，成分：125 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L CaCl2，25 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L葡萄糖，95% O2+5% CO2 混合，pH 7.4）的定制灌流培養皿中，連接管道建立灌流系統，并將其放置于可調控溫度的培養箱（上海博訊實業有限公司，中國）中，模擬體外循環灌流及其溫度變化。
表1
人工腦脊液灌流液成分
1.2.2 氧糖剝奪 OGD被用于復制深低溫停循環在心臟手術中的應用。通過改變灌流溶液，其中 PaCSF 中的葡萄糖被取代為 10 mmol/L 的蔗糖，并以 95% 氮氣/5% 二氧化碳進行氣體混合。當 OGD 結束后將灌流溶液更換回 PaCSF 溶液，并進行 24 h 持續灌流。
1.2.3 灌流系統和流程 在 36℃ 下建立平衡灌流系統后，用約 30 min 降溫至目標溫度，之后在目標溫度水平更換 OGD 溶液，以此進行 60 min 氧糖剝奪過程。當 OGD 結束時，將灌流溶液更換為氧合 PaCSF，進行 10 min 再氧合，隨后用約 30 min 復溫至 36℃，并維持持續灌注約 24 h。對照組為在 36℃ 及相同周期下持續灌流氧合 PaCSF。灌流系統和流程見圖 1、圖 2。
圖1
實驗灌流系統示意圖
圖2
灌流程序示意圖
1.3 免疫鑒定方法
灌流程序結束后，取出腦切片并加入 4% 多聚甲醛（PFA）于室溫固定 1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS，pH=7.4）清洗 3 遍；然后加入 30% 蔗糖溶液 4℃ 冰箱過夜孵育；切底脫水后用組織冰凍切片包埋劑（OCT）在冰凍切片機包埋，將腦片切成 20 μm 切片并置于載玻片上；室溫下用含 10% 葡萄糖及 5% 牛血清白蛋白的封閉液封閉 1 h。將稀釋好的一抗孵育玻片上的腦切片，濕盒中 4℃ 冰箱過夜孵育。少突膠質細胞標記物 O4 抗體及髓鞘堿性蛋白 MBP 抗體的稀釋濃度分別為：1：100 及 1：200。次日，用 PBS 清洗玻片 3 次，再以 1：200 比例稀釋聯有熒光的二抗，用與一抗相同的方法加 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育玻片，室溫避光 1 h，用 PBS 洗 3 遍后用防淬滅封片劑 Dako Cytomation 封片，Olympus 倒置熒光顯微鏡觀察。圖形的定量處理用 Image-pro plus 5.1 軟件完成。每一張腦切片在胼胝體部位隨機選取 3 個視野采 400 倍照片，并計算每個視野的 O4 陽性染色數量與 DAPI 陽性染色數量的百分比值。熒光綠色提示為 O4 陽性表達，藍色提示為 DAPI 陽性表達。
1.4 統計學分析
對免疫熒光染色的實驗結果進行統計學分析，各組數據之間利用 GraphPad Prism 6 軟件通過 one way ANOVA 及 Bonferroni post hoc test 進行差異性檢驗。計量資料以均數±標準差（ ）表示。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 腦切片灌流 OGD 后髓鞘堿性蛋白 MBP 熒光表達及形態
MBP 表達的變化可作為腦白質損傷程度的指標。為探討本實驗腦切片模型能否有效復制體外循環 DHCA 所引起的腦白質損傷，測試了在灌流程序后髓鞘 MBP 的表達程度。MBP 免疫熒光染色表明，MBP 陽性細胞的形態學和熒光表達改變在對照組及 15℃ OGD 組之間差異無統計學意義。然而，MBP 陽性細胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 組均出現不同程度的形態改變以及熒光表達減少，并與 OGD 溫度呈顯著正相關（圖 3）。
圖3
離體腦切片 OGD 灌流模型 MBP 免疫熒光鑒定 ×400，MBP 陽性免疫熒光染色呈白色； a. 對照組； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD；e. 36℃ OGD
2.2 腦切片灌流 OGD 后 O4 熒光表達
少突膠質細胞前體細胞（preOL，O4+）是在人類孕中后期及嬰幼兒期腦白質損傷的主要目標細胞。腦切片以 O4 抗體標記來評價 OGD 對 preOL 細胞的損傷程度。O4 陽性細胞在 25℃，32℃ 及 36℃ OGD 組均出現不同程度的熒光表達減少，并與 OGD 溫度呈顯著正相關。O4 陽性細胞的形態學和熒光表達改變在對照組及 15℃ OGD 組之間差異無統計學意義（圖 4）。
圖4
離體腦切片 OGD 灌流模型 O4 免疫熒光鑒定 ×400，O4 陽性免疫熒光染色呈綠色，DAPI 陽性免疫熒光染色呈藍色； a. 對照組； b. 15℃ OGD； c. 25℃ OGD； d. 32℃ OGD； e. 36℃ OGD； f. 統計圖，各組 O4 陽性細胞與 DAPI 陽性細胞百分比，與對照組比較，*P<0.01
3 討論
3.1 離體腦切片灌流模型的建立與意義
在小兒心臟外科體外循環腦損傷研究中，一般采用大動物如幼年豬、狗和羊或者小動物如幼年大鼠和豚鼠等在體外利用氧合器和滾軸泵建立類似手術中體外循環，來模擬體外循環和深低溫停循環過程，進而研究和評價腦損傷及其程度以及各種防治方法有效性[4-6]。這一模型完全模擬病人手術中體外循環狀態，較準確反映了體外循環下全身器官灌注和損傷，但是這種模型雖然反映了腦整體器官的病理生理狀態，但是在評價腦組織細微結構以及組織和分子生物學方面，不能做到腦區域精確定位、不能及時有效地獲得腦組織、而且在取材時腦組織容易受損從而影響腦損傷的評價，同時在動物模型干擾因素眾多、費用較貴。
近年來，腦切片灌流方法廣泛應用各種腦病理生理以及各種藥物評價研究中[12-14]，其優點在于：（1）能夠較為精確定位病變區域，在組織、細胞以及分子水平上觀察腦損傷狀況；（2）灌流系統能夠很好控制實驗條件，如腦組織灌流溫度、PH 值、灌流液體化學成份、氧合情況以及灌流時間等，實驗重復性好；（3）取材方便、簡單易行且費用低廉。最近美國國立兒童醫院也采用腦切片灌流模型用于研究腦白質損傷[7-9]，通過控制灌流溫度和采用 OGD，較好地模擬類似手術中體外循環和 DHCA 腦損傷的特點。受到這些研究的啟發，我們在中國科學院上海藥物研究所的幫助下，建立了新生小鼠腦切片灌流系統，并采用 OGD 方法模擬 DHCA，研究結果發現，調整不同的灌注和 OGD 溫度時，腦白質中形成軸突髓鞘的成熟少突膠質細胞（MBP 陽性）受損，而且隨著溫度上升，細胞形態變化和熒光表達明顯減低，這種細胞損傷程度變化與體外循環和停循環病理生理完全灌注模型較好地復制了手術中體外循環及 DHCA 病理生理過程和效應。
相比一些體外細胞實驗模型，腦切片灌流模型仍有相對較完整的組織細胞結構，更全面地反應腦細胞在損傷過程中的共同作用，狀態更接近體內實驗，可以達到體內動物模型同樣的研究效應能力，在研究白質損傷中具有得天獨厚的優勢。但是這一模型在研究整體機體狀態，如血流動力學、腦組織變化以及長期神經系統發育等方面較為欠缺[15-16]。
3.2 CPB/DHCA 對白質的損傷
本研究部分應用離體腦切片灌流模型，研究 CPB/DHCA 對腦白質 preOL 損傷。我們首先利用 MBP 免疫熒光初步檢測腦白質在 OGD 灌流后的損傷程度，結果顯示 MBP 陽性細胞在不同溫度 OGD 設置呈現不同程度的損傷，在 25℃、32℃ 及 36℃ 出現顯著的細胞損失及形態改變，包括突觸消失及細胞膜變薄碎化等。結果提示腦白質細胞會受 OGD 影響出現急性損傷，更為重要的是我們發現利用 O4 免疫熒光染色觀察腦切片模型在實施不同溫度的 OGD 灌流后（O4+）損傷狀態，可見在 36℃ OGD 下 preOL 有顯著損失，在 15℃ OGD 損失程度則顯著減少，可見 preOL 損傷與各溫度 OGD 組中呈現正性相關。從以上數據表明 CPB/DHCA 能引起 preOL 損傷。
preOL 是少突膠質細胞（OL）細胞系發育的重要階段，在人胚胎后 3 個月是腦白質中 OL 細胞中的主要細胞，約占 90%，到出生時達到 50%[17]。在 OL 細胞系中，PreOL 對缺血缺氧損傷最敏感，也是感染和炎癥損傷的靶細胞[6,18]。preOL 損傷可有以下 3 種結局[19]：（1）preOL 急性死亡；（2）preOL 存活但正常細胞進程喪失，隨后的細胞分化和髓鞘化失敗；（3）preOL 異常。無論何種損傷，由于 preOL 數量急劇減少，其隨后的細胞分化為成熟 OL 也明顯減少，結果是髓磷脂合成減少和軸突髓鞘化障礙，最終導致腦白質低髓鞘化和白質損傷[18-20]。因此 PreOL 損傷是最終導致白質損傷的細胞學基礎。在本研究中我們發現體外循環和停循環模型中的確存在 preOL 損傷和數量減少以及成熟 OL 明顯減少，從而進一步導致整個白質低髓鞘化和損傷。
本研究建立了新生小鼠腦切片體外灌流和 OGD 模型，證實這種模型可有效模擬和復制臨床心臟手術中 CPB 和 DHCA 腦細胞損傷相似特征，簡單易行、且實驗結果具有良好重復性。同時我們發現，這種灌流模型確實可以導致腦白質 preOL 損傷和數量減少，從而觸發一系列 OL 細胞系細胞的改變，出現成熟 OL 細胞數量減少和軸突髓鞘化障礙，最終可導致白質損傷，為體外循環及停循環白質損傷提供了直接的細胞學損傷證據。
