引用本文： 何毅, 梅舉, 湯敏, 劉浩, 姜兆磊. 冠狀動脈旁路移植術后 Th17 和 Treg 細胞及其相關因子在新發心房顫動患者外周血中的變化. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(8): 598-601. doi: 10.7507/1007-4848.201609009 復制
心臟外科術后新發心房顫動（postoperative atrial fibrillation，POAF）是一種常見的術后并發癥[1]。在冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass graft，CABG）患者中，POAF 發生率可達 24%～40%；在 CABG 聯合瓣膜手術患者中，POAF 的發生率更是高達 62%[2]。POAF 常伴血栓事件、血流動力學不穩定、室性心律失常等，嚴重者可導致患者死亡。POAF 發生的原因眾多，近年來炎癥反應在 POAF 發病機制中的作用越來越受到重視[3]。越來越多的研究證實活化的 CD4+ T 細胞介導的自身免疫應答在機體炎癥反應中發揮著重要的作用，其中輔助性 T 細胞 17（Th17）和調節性 T 細胞（Treg）的平衡在保持免疫耐受、抑制自身免疫應答中起著至關重要的作用[4-5]。本研究對 CABG 術后 POAF 患者外周血中 Th17 細胞和 Treg 細胞進行檢測，了解 POAF 患者外周血中這兩種免疫細胞的比例及其相關因子表達水平的變化，研究這兩種細胞在 POAF 發病機制中的作用，為進一步探討 POAF 的發病機制和治療提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
連續選擇 2013 年 5 月至 2016 年 7 月上海交通大學醫學院附屬新華醫院心胸外科非體外循環下行 CABG 的患者 132 例，其中男 82 例、女 50 例，年齡 39～76 歲，體質量 58～95 kg。全組患者經術前冠狀動脈造影確診冠狀動脈二支及以上病變，或合并左主干病變，狹窄程度 75% 以上，每例患者平均移植橋血管 2.75 根。
POAF 定義[6]：（1）圍術期任何需要治療的心房顫動（atrial fibrillation，AF）；（2）AF 持續 20 min 或以上；（3）24 h 累計 AF 發生時間超過 60 min。根據上述定義將患者分為術后新發房顫組（POAF 組）和術后未發房顫組（No POAF 組），記錄兩組患者的一般臨床信息，包括性別，年齡，體質量指數（BMI），相關病史（高血壓，糖尿病，高血脂，心肌梗死，腦卒中，慢性阻塞性肺病，腎功能不全等）。
1.2 試驗方法
1.2.1 試劑 相關流式抗體，胞內蛋白破膜固定試劑盒，核內蛋白破核固定試劑盒，蛋白轉運抑制劑合劑，相關因子酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒均購自 eBioscience 公司。人淋巴細胞分離液購自達科為生物試劑公司。RPMI1640 培養基購自 Hyclone 公司。
1.2.2 標本的采集 CABG 術后患者進入監護室 2 h內無菌采集乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血 2 ml，加入人淋巴細胞分離液，梯度離心獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用于外周血 Th17 細胞和 Treg 細胞含量檢測；促凝管采外周靜脈血 2 ml，離心后收集上層血清，保存于 –80℃ 冰箱中，用于后續 ELISA 檢測相關細胞因子。
1.2.3 流式細胞檢測 外周血中 Treg 細胞含量的檢測：每個樣本加 2×106 個 PBMC 于流式管中，分別加入 CD4-FITC，CD25-PE 抗體各 5 μl，混勻，室溫避光孵育 30 min 后，清洗，離心，去上清；加入破核固定液，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心，去上清后加入 FoxP3-APC 抗體 5 μl，混勻，室溫孵育 30 min 后清洗，離心，去上清；用 200 μl 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸浮細胞，上流式細胞儀檢測 CD4+CD25+FoxP3+ Treg 細胞比例。
外周血中 Th17 細胞的檢測：用細胞凍存培養基（RPMI）將 PBMC 密度調整至 2×106/ml，將 2 ml 細胞懸液加至 6 孔板中，加入 4 μl 蛋白轉運抑制劑合劑，置于 37℃，5% CO2 培養箱孵育 6 h。收集細胞，清洗，離心，去上清。每個流式管內加入 100 μl 密度為 2×106/ml 的 PBMC，加入 5 μl CD4-FITC 抗體，混勻，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心，去上清；加入破膜固定液，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心，去上清后加入 IL-17 PE 抗體，混勻，室溫孵育 30 min 后清洗，離心，去上清；用 200 μl PBS 重懸浮細胞，上流式細胞儀檢測 CD4+IL17+ Th17 細胞比例。
1.2.4 ELISA 檢測 采用雙抗體夾心 ELISA 方法檢測兩組患者外周血清中 IL-6，IL-8，IL-10，IL-17 和 TGF-β 含量，具體操作步驟均嚴格按照試劑制造商說明書進行操作。
1.3 統計學分析
采用 SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。連續性變量以均數±標準差（ ）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；分類變量以例數和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料比較
在 132 例患者中，35 例患者出現 POAF。患者具體臨床資料比較見表 1。在本研究中，POAF 組和 No POAF 組患者年齡、性別、BMI 及相關病史方面差異無統計學意義（P>0.05）。
表1
患者一般情況 [
/例（%）]
2.2 Th17、Treg 細胞比例和 Th17/Treg 比值變化
與 No POAF 組相比，POAF 組患者外周血中 Th17 細胞比例和 Th17/Treg 比值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 1，表 2；而 Treg 細胞比例差異無統計學意義（P=0.887），見圖 2，表 2。
圖1
CD4+IL17+ Th17 細胞流式細胞檢測典型圖
圖2
CD4+CD25+FoxP3+ Treg 細胞流式細胞檢測典型圖
表2
患者外周血中 Th17 細胞及 Treg 細胞含量和比值（
）
2.3 相關細胞因子變化
POAF 組患者血清中 Th17 細胞相關細胞因子（IL-6，IL-8 和 IL-17）含量均較 No POAF 組顯著升高。而 Treg 細胞相關細胞因子（IL-10 和 TGF-β）含量在兩組患者血清中含量無明顯差異（表 3）。
表3
患者血清中各種細胞因子表達（pg/ml，
）
3 討論
越來越多的研究表明 POAF 和圍術期心肌梗死，腎功能衰竭，充血性心力衰竭和感染性并發癥等密切相關，因此加強對 POAF 的預防和治療很有必要[7]。POAF 的發病機制復雜，炎癥反應、缺血、氧化應激反應、心肌重塑和心臟功能減退都參與其中[8]。之前已有研究報道，POAF 患者外周血中的白細胞計數、C反應蛋白表達水平和相關促炎因子表達均增加，提示了炎癥反應在 POAF 中的重要作用[9-11]。
Th17 細胞和 Treg 細胞為 CD4+ T 淋巴細胞不同功能亞群，目前認為 Th17 細胞有促炎作用而 Treg 細胞具有抑制炎癥的作用。Th17 細胞分泌多種促炎因子，如 IL-6，IL-8 和 IL-17 等在炎癥中起重要作用，而 Th17 在心血管疾病中的作用也在風濕性心臟病、心肌炎和動脈粥樣硬化中得到證實[12]。Treg 細胞作為具有抗炎作用的 T 細胞亞群，其抑制炎癥作用主要通過分泌 IL-10 和 TGF-β 等抗炎因子或直接與細胞接觸實現。已有越來越多研究表明，在包括動脈粥樣硬化，缺血性心肌梗死和川崎病等多種心血管疾病中均存在 Treg 細胞減少和功能減退[13]。本研究結果顯示，在 POAF 患者中，Th17 細胞比例及其相關細胞因子（IL-6，IL-8，IL-17）明顯減少而 Treg 細胞比例及其相關細胞因子（IL-10，TGF-β）無顯著變化，提示在 CABG 術后促炎反應較抗炎反應更為明顯。
Treg 和 Th17 細胞雖然在作用上互相拮抗，但它們的分化途徑卻具有互逆性。未分化的 Th 細胞在不同細胞因子的作用下向著不同的亞群分化。TGF-β 為 Treg 細胞分化所必需，但是也參與 Th17 細胞分化[14]。TGF-β 可以促進 Th 細胞向 Treg 細胞分化，但當 TGF-β 與 IL-6 共存時則會促進 Th17 細胞的生成[15]。本研究中發現 POAF 患者血清中 IL-6 含量顯著升高，提示 Th17 細胞分化增強。也進一步說明了 POAF 患者體內 Th17/Treg 平衡向 Th17 細胞分化趨勢增強。有研究表明，眾多炎癥性疾病和自身免疫性疾病中均出現 Th17/Treg 細胞的平衡紊亂[12]。我們也發現，與 No POAF 組患者相比，POAF 患者體內存在 Th17/Treg 細胞的平衡紊亂。此外，使用 IL-17A 抗體對 IL-17 進行阻斷可以明顯降低 POAF 的發生率也表明通過糾正 Th17/Treg 平衡紊亂可以調節 POAF 患者體內的炎癥平衡狀態[16]。
本研究結果顯示 POAF 患者體內 Th17 細胞及其相關因子表達增加，而 Treg 細胞及其相關因子表達無明顯變化，同時 POAF 患者體內存在 Th17/Treg 平衡紊亂。這些結果表明因 Th17/Treg 細胞平衡紊亂所導致的炎癥反應參與了 POAF 發病機制，調節 Th17/Treg 細胞平衡紊亂或能降低 POAF 發病率。我們的結果為研究 POAF 的發病機制和治療方案提供了新的理論依據。
心臟外科術后新發心房顫動（postoperative atrial fibrillation，POAF）是一種常見的術后并發癥[1]。在冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass graft，CABG）患者中，POAF 發生率可達 24%～40%；在 CABG 聯合瓣膜手術患者中，POAF 的發生率更是高達 62%[2]。POAF 常伴血栓事件、血流動力學不穩定、室性心律失常等，嚴重者可導致患者死亡。POAF 發生的原因眾多，近年來炎癥反應在 POAF 發病機制中的作用越來越受到重視[3]。越來越多的研究證實活化的 CD4+ T 細胞介導的自身免疫應答在機體炎癥反應中發揮著重要的作用，其中輔助性 T 細胞 17（Th17）和調節性 T 細胞（Treg）的平衡在保持免疫耐受、抑制自身免疫應答中起著至關重要的作用[4-5]。本研究對 CABG 術后 POAF 患者外周血中 Th17 細胞和 Treg 細胞進行檢測，了解 POAF 患者外周血中這兩種免疫細胞的比例及其相關因子表達水平的變化，研究這兩種細胞在 POAF 發病機制中的作用，為進一步探討 POAF 的發病機制和治療提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
連續選擇 2013 年 5 月至 2016 年 7 月上海交通大學醫學院附屬新華醫院心胸外科非體外循環下行 CABG 的患者 132 例，其中男 82 例、女 50 例，年齡 39～76 歲，體質量 58～95 kg。全組患者經術前冠狀動脈造影確診冠狀動脈二支及以上病變，或合并左主干病變，狹窄程度 75% 以上，每例患者平均移植橋血管 2.75 根。
POAF 定義[6]：（1）圍術期任何需要治療的心房顫動（atrial fibrillation，AF）；（2）AF 持續 20 min 或以上；（3）24 h 累計 AF 發生時間超過 60 min。根據上述定義將患者分為術后新發房顫組（POAF 組）和術后未發房顫組（No POAF 組），記錄兩組患者的一般臨床信息，包括性別，年齡，體質量指數（BMI），相關病史（高血壓，糖尿病，高血脂，心肌梗死，腦卒中，慢性阻塞性肺病，腎功能不全等）。
1.2 試驗方法
1.2.1 試劑 相關流式抗體，胞內蛋白破膜固定試劑盒，核內蛋白破核固定試劑盒，蛋白轉運抑制劑合劑，相關因子酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒均購自 eBioscience 公司。人淋巴細胞分離液購自達科為生物試劑公司。RPMI1640 培養基購自 Hyclone 公司。
1.2.2 標本的采集 CABG 術后患者進入監護室 2 h內無菌采集乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝血 2 ml，加入人淋巴細胞分離液，梯度離心獲取外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），用于外周血 Th17 細胞和 Treg 細胞含量檢測；促凝管采外周靜脈血 2 ml，離心后收集上層血清，保存于 –80℃ 冰箱中，用于后續 ELISA 檢測相關細胞因子。
1.2.3 流式細胞檢測 外周血中 Treg 細胞含量的檢測：每個樣本加 2×106 個 PBMC 于流式管中，分別加入 CD4-FITC，CD25-PE 抗體各 5 μl，混勻，室溫避光孵育 30 min 后，清洗，離心，去上清；加入破核固定液，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心，去上清后加入 FoxP3-APC 抗體 5 μl，混勻，室溫孵育 30 min 后清洗，離心，去上清；用 200 μl 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸浮細胞，上流式細胞儀檢測 CD4+CD25+FoxP3+ Treg 細胞比例。
外周血中 Th17 細胞的檢測：用細胞凍存培養基（RPMI）將 PBMC 密度調整至 2×106/ml，將 2 ml 細胞懸液加至 6 孔板中，加入 4 μl 蛋白轉運抑制劑合劑，置于 37℃，5% CO2 培養箱孵育 6 h。收集細胞，清洗，離心，去上清。每個流式管內加入 100 μl 密度為 2×106/ml 的 PBMC，加入 5 μl CD4-FITC 抗體，混勻，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心，去上清；加入破膜固定液，室溫避光孵育 30 min，清洗，離心，去上清后加入 IL-17 PE 抗體，混勻，室溫孵育 30 min 后清洗，離心，去上清；用 200 μl PBS 重懸浮細胞，上流式細胞儀檢測 CD4+IL17+ Th17 細胞比例。
1.2.4 ELISA 檢測 采用雙抗體夾心 ELISA 方法檢測兩組患者外周血清中 IL-6，IL-8，IL-10，IL-17 和 TGF-β 含量，具體操作步驟均嚴格按照試劑制造商說明書進行操作。
1.3 統計學分析
采用 SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。連續性變量以均數±標準差（ ）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；分類變量以例數和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料比較
在 132 例患者中，35 例患者出現 POAF。患者具體臨床資料比較見表 1。在本研究中，POAF 組和 No POAF 組患者年齡、性別、BMI 及相關病史方面差異無統計學意義（P>0.05）。
表1
患者一般情況 [
/例（%）]
2.2 Th17、Treg 細胞比例和 Th17/Treg 比值變化
與 No POAF 組相比，POAF 組患者外周血中 Th17 細胞比例和 Th17/Treg 比值明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 1，表 2；而 Treg 細胞比例差異無統計學意義（P=0.887），見圖 2，表 2。
圖1
CD4+IL17+ Th17 細胞流式細胞檢測典型圖
圖2
CD4+CD25+FoxP3+ Treg 細胞流式細胞檢測典型圖
表2
患者外周血中 Th17 細胞及 Treg 細胞含量和比值（
）
2.3 相關細胞因子變化
POAF 組患者血清中 Th17 細胞相關細胞因子（IL-6，IL-8 和 IL-17）含量均較 No POAF 組顯著升高。而 Treg 細胞相關細胞因子（IL-10 和 TGF-β）含量在兩組患者血清中含量無明顯差異（表 3）。
表3
患者血清中各種細胞因子表達（pg/ml，
）
3 討論
越來越多的研究表明 POAF 和圍術期心肌梗死，腎功能衰竭，充血性心力衰竭和感染性并發癥等密切相關，因此加強對 POAF 的預防和治療很有必要[7]。POAF 的發病機制復雜，炎癥反應、缺血、氧化應激反應、心肌重塑和心臟功能減退都參與其中[8]。之前已有研究報道，POAF 患者外周血中的白細胞計數、C反應蛋白表達水平和相關促炎因子表達均增加，提示了炎癥反應在 POAF 中的重要作用[9-11]。
Th17 細胞和 Treg 細胞為 CD4+ T 淋巴細胞不同功能亞群，目前認為 Th17 細胞有促炎作用而 Treg 細胞具有抑制炎癥的作用。Th17 細胞分泌多種促炎因子，如 IL-6，IL-8 和 IL-17 等在炎癥中起重要作用，而 Th17 在心血管疾病中的作用也在風濕性心臟病、心肌炎和動脈粥樣硬化中得到證實[12]。Treg 細胞作為具有抗炎作用的 T 細胞亞群，其抑制炎癥作用主要通過分泌 IL-10 和 TGF-β 等抗炎因子或直接與細胞接觸實現。已有越來越多研究表明，在包括動脈粥樣硬化，缺血性心肌梗死和川崎病等多種心血管疾病中均存在 Treg 細胞減少和功能減退[13]。本研究結果顯示，在 POAF 患者中，Th17 細胞比例及其相關細胞因子（IL-6，IL-8，IL-17）明顯減少而 Treg 細胞比例及其相關細胞因子（IL-10，TGF-β）無顯著變化，提示在 CABG 術后促炎反應較抗炎反應更為明顯。
Treg 和 Th17 細胞雖然在作用上互相拮抗，但它們的分化途徑卻具有互逆性。未分化的 Th 細胞在不同細胞因子的作用下向著不同的亞群分化。TGF-β 為 Treg 細胞分化所必需，但是也參與 Th17 細胞分化[14]。TGF-β 可以促進 Th 細胞向 Treg 細胞分化，但當 TGF-β 與 IL-6 共存時則會促進 Th17 細胞的生成[15]。本研究中發現 POAF 患者血清中 IL-6 含量顯著升高，提示 Th17 細胞分化增強。也進一步說明了 POAF 患者體內 Th17/Treg 平衡向 Th17 細胞分化趨勢增強。有研究表明，眾多炎癥性疾病和自身免疫性疾病中均出現 Th17/Treg 細胞的平衡紊亂[12]。我們也發現，與 No POAF 組患者相比，POAF 患者體內存在 Th17/Treg 細胞的平衡紊亂。此外，使用 IL-17A 抗體對 IL-17 進行阻斷可以明顯降低 POAF 的發生率也表明通過糾正 Th17/Treg 平衡紊亂可以調節 POAF 患者體內的炎癥平衡狀態[16]。
本研究結果顯示 POAF 患者體內 Th17 細胞及其相關因子表達增加，而 Treg 細胞及其相關因子表達無明顯變化，同時 POAF 患者體內存在 Th17/Treg 平衡紊亂。這些結果表明因 Th17/Treg 細胞平衡紊亂所導致的炎癥反應參與了 POAF 發病機制，調節 Th17/Treg 細胞平衡紊亂或能降低 POAF 發病率。我們的結果為研究 POAF 的發病機制和治療方案提供了新的理論依據。
