引用本文： 張毅, 古君, 劉林波, 廖智杰, 張洪偉, 楊鵬, 范康鈞, 梁懷民, 肖正華, 胡佳. 表沒食子兒茶素-3-沒食子酸（EGCG）對大鼠自體移植靜脈橋狹窄的抑制作用及其機制研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(10): 791-796. doi: 10.7507/1007-4848.201704044 復制
自體靜脈取材方便、操作簡單，常用作冠狀動脈旁路移植術或治療外周動脈狹窄的首選材料；但自體靜脈移植存在遠期效果不佳的弊端，其 5 年通暢率僅約 30%[1]，嚴重者導致遠端血供重新受到影響，甚至需要再次手術。既往研究發現，自體靜脈移植發生再狹窄的主要原因是中膜平滑肌增殖導致管壁增厚[2]，但平滑肌增殖的具體機制目前尚未明確。
Notch 是一個非常保守的信號通路，其共有 4 個受體和 5 個配體，轉錄因子發狀分裂相關增強子 1（HES1）是 Notch 通路受體活化的主要形式，HES1 的表達增加可反映 Notch 通路的激活[3]。最近的研究表明，Notch 通路參與了自體靜脈移植再狹窄的進程，抑制 Notch 通路的激活可顯著減輕靜脈橋狹窄的程度[4]。這為我們治療靜脈橋狹窄提供了新的靶點。表沒食子兒茶素-3-沒食子酸（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶的主要成分，既往研究發現其可在體外抑制 Notch 通路的表達[5]，目前尚無研究發現 EGCG 是否對靜脈橋再狹窄過程中的 Notch 通路存在影響；局部應用于移植自體靜脈也可減緩靜脈橋狹窄的進程[6]，但局部浸泡靜脈橋的作用時間較短，全身應用 EGCG 作用的時間更長，目前也尚無文獻報道全身應用 EGCG 是否對自體移植靜脈再狹窄具有保護作用。故本文將探討全身應用 EGCG 是否通過影響 Notch 通路的表達，發揮保護靜脈橋再狹窄的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物分組及模型建立
90 只無特定病原體（SPF 級）雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量（237±21）g，購買自四川大學實驗動物中心，所有動物實驗過程遵循四川大學華西臨床醫學院實驗動物的使用及管理規則。大鼠在恒溫（23℃～28℃）恒濕（50%～60%）條件下飼養，飲用水和飼料均經滅菌后自由取用。
90 只大鼠隨機分為 9 組，每組 10 只：1 周對照組，不建立自體靜脈橋移植模型，每天腹腔注射 0.5 ml 生理鹽水，1 周后單純采取大鼠頸靜脈；1 周實驗組，建立自體靜脈橋模型，每天腹腔注射 0.5 ml 生理鹽水，1 周后取大鼠移植頸靜脈；1 周 EGCG 干預組，自體靜脈橋模型建立后，每天腹腔注射 EGCG 生理鹽水溶液（10 mg/kg，0.5 ml）[7]，1 周后取大鼠移植頸靜脈。2 周及 4 周模型建立方法同 1 周各組，分別于 2 周及 4 周采集大鼠頸靜脈或移植靜脈。
靜脈橋動物模型手術步驟：取右側胸鎖乳突肌前切口，暴露并游離頸外靜脈，取其主干長約 1 cm，兩端予以結扎；同側游離出頸總動脈，動脈兩端予以無損傷血管夾阻斷血流，在動脈遠端 1/3 處截斷；24G 靜脈穿刺導管引導下，將頸總動脈近端與移植靜脈對合；8-0 聚丙烯縫線間斷吻合動靜脈斷端，吻合完成后，松開頸總動脈兩斷端的血管夾，兩處吻合口處棉球加壓止血，檢查血管通暢無滲血后，逐層關閉切口。4 周獲取大鼠靜脈橋，并采集未手術的大鼠單側頸外靜脈作為對照。生理鹽水快速沖洗干凈后等分為 3 部分，1/3 段置入 4% 多聚甲醛溶液固定，余下 2/3 置入無菌凍存管，保存于液氮罐中，用于蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測。
1.2 靜脈橋中膜、內膜厚度及 Ki-67 表達的檢測
將 16 g/L 甲醛溶液固定的大鼠靜脈橋標本經乙醇梯度脫水、石蠟包埋后，同段靜脈取間隔相等的 3 處制備成 5 μm 厚度的血管斷面切片。切片分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學技術檢測。石蠟切片經烘烤脫蠟、降梯度乙醇水化、蘇木素染色 10 min、流水沖洗、伊紅染色 5 min、升梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，完成 HE 染色。靜脈橋石蠟切片脫蠟至水，3% 過氧化氫淬滅內源性過氧化物酶 20 min，0.01% 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 5 min×3 次，進口羊血清工作液（北京中杉金橋公司）封閉 30 min，1∶100 Ki-67 抗體（英國 Abcam）4℃ 孵育過夜，PBS 洗滌 5 min×4 次，羊抗兔二抗試劑盒在 37℃ 下孵育 30 min，PBS 洗滌 5 min×3 次，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液 37℃ 孵育 30 min，PBS 洗滌 5 min×3 次，二氨基聯苯胺在顯微鏡下控制染色，水洗，蘇木素復染細胞核，流水沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片，完成免疫組化染色。
在每張病理切片中隨機使用 OLYMPUS BX51 光學顯微鏡采集圖像，采圖后應用 Image pro plus 軟件測量每組靜脈的內膜厚度和中膜厚度，同段血管 3 處間斷橫切面測量均值為該段靜脈形態學參數。選擇 4 個不重疊的高倍顯微視野（40×10 倍），通過計算 Ki-67 陽性表達的細胞占總細胞數的百分率來間接反映各組大鼠靜脈橋管壁中 Ki-67 表達的差異。
1.3 Western blot 分析 HES1 在靜脈橋中表達量
用 RIPA 裂解液提取靜脈組織總蛋白，7 000 g 離心 10 min 后取上清，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取 50 μg 樣品上層，8% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃、100 mA 穩流轉膜過夜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h 后加入 HES1 抗體（1∶1 000 稀釋），4℃ 孵育過夜。洗膜后加入山羊抗兔 HRP-IgG（1∶4 000），于 37℃ 孵育 1 h，洗膜后加入顯影劑，在暗室中顯影，底片經掃描儀透掃后凝膠分析軟件分析，結果以 HES1 與 β-actin 密度的比值表示其相對表達量。
1.4 統計學分析
計量資料以均數±標準差（ ）表示，各組數據比較前行方差齊檢驗，如方差齊則進一步行方差分析，如方差不齊則行變量變換再行方差分析；形態學參數為非正態分布，采用 Mann-Whitney U檢驗。多組間比較采用 one-way ANOVA 檢驗，并通過 Scheffe post hoc 進行兩兩比較。檢驗水準均為 α=0.05。采用 EpiData 3.0 軟件錄入數據，SPSS 19.0 軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）分析數據。
2 結果
2.1 EGCG 對大鼠靜脈橋管壁形態學的作用
大鼠接受自體靜脈橋移植后 1 周，實驗組橋血管管壁較對照組（圖 1a，1b）稍增厚，EGCG 干預對靜脈橋管壁厚度影響不大（圖 1c）。大鼠接受自體靜脈橋移植后 2 周，橋血管管壁較對照組（圖 1d）增厚，內皮細胞層不連續，出現皺褶、斷裂，管壁內的 SMCs 明顯較對照組增多，中膜彈力纖維斷裂、排列紊亂（圖 1e）；給予 EGCG 干預后，橋血管管壁厚度明顯減小，內皮細胞層、平滑肌細胞（SMCs）和中膜彈力纖維層病變均較實驗組出現明顯減輕（圖 1f）。大鼠接受自體靜脈橋移植后 4 周，實驗組橋血管管壁進一步增厚（圖 1g， 1h），EGCG 減小橋血管厚度（圖 1i）。
實驗數據如表 1、2所示，2 周及 4 周后實驗組橋血管內膜厚度較對照組明顯增加 [（46.76±4.89）μmvs.（8.93±0.82）μm，（66.38±6.23）μmvs.（8.29±0.79）μm，P均<0.05]，EGCG 可顯著抑制自體靜脈橋內膜的增厚；2 周及 4 周實驗組橋血管中膜厚度較對照組明顯增加 [（47.28±4.37）μmvs.（16.33±1.52）μm，（63.27±6.18）μmvs.（15.29±1.49）μm，P均<0.05]，EGCG 可顯著抑制自體靜脈橋中膜的增厚。
圖1
EGCG 對大鼠靜脈橋管壁形態學的作用（HE×100） a. 1 周對照組； b. 1 周實驗組； c. 1 周 EGCG 干預組； d. 2 周對照組； e. 2 周實驗組； f. 2 周 EGCG 干預組； g. 4 周對照組； h. 4 周實驗組； i. 4 周 EGCG 干預組
表1
EGCG 對大鼠靜脈橋管壁內膜厚度的作用
表2
EGCG 對大鼠靜脈橋管壁中膜厚度的作用
2.2 EGCG 對大鼠靜脈橋管壁中 Ki-67 表達的作用
Ki-67 表達于 SMCs 的細胞核，第 2 周及第 4 周實驗組橋血管中 Ki-67 表達顯著高于對照組（21.59%±2.29%vs. 1.12%±0.22%，33.19%±3.03%vs. 1.09%±0.19%，P均<0.05），EGCG 可抑制大鼠橋血管壁中 Ki-67 的表達；見圖 2，表 3。
圖2
EGCG 對大鼠靜脈橋中 Ki-67 表達的作用（免疫組化，×400） a. 1 周對照組； b. 1 周實驗組； c. 1 周 EGCG 干預組； d. 2 周對照組； e. 2 周實驗組； f. 2 周 EGCG 干預組； g. 4 周對照組； h. 4 周實驗組； i. 4 周 EGCG 干預組
表3
EGCG 對大鼠靜脈橋 Ki-67 表達的作用
2.3 EGCG 對大鼠靜脈橋管壁中 HES1 表達的作用
由于第 1 周 EGCG 未對移植靜脈橋厚度及 Ki-67 產生有效干預作用，故僅對第 2 周和第 4 周大鼠靜脈橋管壁中 HES1 表達情況進行分析。第 2 周及第 4 周實驗組橋血管中 HES1 表達顯著高于對照組，EGCG 可抑制大鼠橋血管中 HES1 的表達（P<0.05）；見圖 3。
圖3
EGCG 對大鼠靜脈橋中 HES1 表達的作用（Western blot） a. 第 2 周靜脈橋 HES1 表達情況； b. 第 4 周靜脈橋 HES1 表達情況； # 與對照組比較，P<0.05； *與實驗組比較，P<0.05
3 討論
自體靜脈移植是冠狀動脈旁路移植術及外周動脈狹窄搭橋術的重要治療方案，但自體靜脈移植后帶來的遠期狹窄一直困擾著臨床醫師[8]。自體靜脈移植后再狹窄是通過復雜的分子機制導致血管的肥厚和再構的過程，靜脈移植到動脈后血管壓力的改變引起的機械損傷起到了關鍵作用[9-10]。原位靜脈血管內壓力較低，當移植到壓力較高的動脈系統后，靜脈管壁承受的壓力明顯升高，血管過度擴張引起內皮細胞層結構和功能的改變，釋放信號分子，促使中膜平滑肌細胞增殖并向內膜遷移，同時產生過量的細胞外基質，引起內膜增生和管腔狹窄，最終引起移植靜脈堵塞[11-13]。雖然目前對上述靜脈橋再狹窄的病理生理過程闡釋已日臻完善，但調節上述過程的信號通路仍不明確，也少有針對性的藥物來抑制靜脈橋狹窄。
EGCG 是綠茶中的主要成分，既往研究發現其具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[14]。研究發現，在家兔自體靜脈移植前，將靜脈橋浸泡于 EGCG 溶液中，可通過減少中膜平滑肌增殖和重構，有效減輕移植靜脈橋遠期管壁厚度，發現局部應用 EGCG 對靜脈橋遠期具有保護作用[6]。但上述研究局部應用 EGCG 作用時間較短，若全身長期應用 EGCG 可能產生更好的保護作用。本研究結果顯示，長期全身應用 EGCG 同樣可使 28 d 后靜脈橋的中膜和內膜厚度明顯減小，而且反映平滑肌細胞增殖的 Ki-67 表達陽性細胞也明顯減少，說明全身應用 EGCG 也通過抑制中膜平滑肌細胞增殖和重構，從而發揮保護靜脈橋再狹窄的作用。但本研究采用大鼠靜脈橋移植模型，與前述家兔靜脈橋移植模型不同，無法比較局部和全身應用 EGCG 對靜脈橋管壁厚度的差別，后期的研究可能在同一動物模型中比較局部和全身應用 EGCG、甚至聯合應用對靜脈橋遠期狹窄的作用差異。
Notch 是一個高度保守的信號通路，Notch 通路的異常活化與細胞分化、胚胎發育、組織自我更新、腫瘤發生等密切相關[15]。Notch 通路由受體、配體和 DNA 結合蛋白組成，哺乳動物中存在 4 種 Notch 受體（Notch1-4）和 5 種 Notch 配體（Jagged 1、2，Delta-like 1、3、4），γ-促分泌酶復合體酶切 Notch 受體釋放其活化形式 HES1，所以 HES1 的表達增加代表 Notch 通路的活化[3]。最近的文獻發現，通過建立大鼠頸外靜脈移植至頸總動脈模型，測定 1 個月后移植靜脈內 Notch 信號通路的表達，發現移植靜脈內反映 Notch 信號通路激活的 HES1 蛋白表達明顯增加，抑制 Notch 信號通路可以減輕靜脈橋狹窄的程度，說明 Notch 通路可能參與到靜脈橋再狹窄過程中[16]。本研究也得到了與前述文獻類似的結果，發現靜脈橋移植后 HES1 蛋白表達增加；本研究還首次發現給予 EGCG 全身干預后，靜脈橋中 HES1 蛋白的表達出現明顯下降，說明 EGCG 可能通過減少 Notch 信號通路激活，發揮保護靜脈橋狹窄的作用。
本研究首次發現全身應用 EGCG 可通過抑制 Notch 信號通路發揮保護靜脈橋遠期狹窄的作用，為今后基礎研究提供了思路，也為臨床研究提供了理論基礎和應用依據。
自體靜脈取材方便、操作簡單，常用作冠狀動脈旁路移植術或治療外周動脈狹窄的首選材料；但自體靜脈移植存在遠期效果不佳的弊端，其 5 年通暢率僅約 30%[1]，嚴重者導致遠端血供重新受到影響，甚至需要再次手術。既往研究發現，自體靜脈移植發生再狹窄的主要原因是中膜平滑肌增殖導致管壁增厚[2]，但平滑肌增殖的具體機制目前尚未明確。
Notch 是一個非常保守的信號通路，其共有 4 個受體和 5 個配體，轉錄因子發狀分裂相關增強子 1（HES1）是 Notch 通路受體活化的主要形式，HES1 的表達增加可反映 Notch 通路的激活[3]。最近的研究表明，Notch 通路參與了自體靜脈移植再狹窄的進程，抑制 Notch 通路的激活可顯著減輕靜脈橋狹窄的程度[4]。這為我們治療靜脈橋狹窄提供了新的靶點。表沒食子兒茶素-3-沒食子酸（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶的主要成分，既往研究發現其可在體外抑制 Notch 通路的表達[5]，目前尚無研究發現 EGCG 是否對靜脈橋再狹窄過程中的 Notch 通路存在影響；局部應用于移植自體靜脈也可減緩靜脈橋狹窄的進程[6]，但局部浸泡靜脈橋的作用時間較短，全身應用 EGCG 作用的時間更長，目前也尚無文獻報道全身應用 EGCG 是否對自體移植靜脈再狹窄具有保護作用。故本文將探討全身應用 EGCG 是否通過影響 Notch 通路的表達，發揮保護靜脈橋再狹窄的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物分組及模型建立
90 只無特定病原體（SPF 級）雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量（237±21）g，購買自四川大學實驗動物中心，所有動物實驗過程遵循四川大學華西臨床醫學院實驗動物的使用及管理規則。大鼠在恒溫（23℃～28℃）恒濕（50%～60%）條件下飼養，飲用水和飼料均經滅菌后自由取用。
90 只大鼠隨機分為 9 組，每組 10 只：1 周對照組，不建立自體靜脈橋移植模型，每天腹腔注射 0.5 ml 生理鹽水，1 周后單純采取大鼠頸靜脈；1 周實驗組，建立自體靜脈橋模型，每天腹腔注射 0.5 ml 生理鹽水，1 周后取大鼠移植頸靜脈；1 周 EGCG 干預組，自體靜脈橋模型建立后，每天腹腔注射 EGCG 生理鹽水溶液（10 mg/kg，0.5 ml）[7]，1 周后取大鼠移植頸靜脈。2 周及 4 周模型建立方法同 1 周各組，分別于 2 周及 4 周采集大鼠頸靜脈或移植靜脈。
靜脈橋動物模型手術步驟：取右側胸鎖乳突肌前切口，暴露并游離頸外靜脈，取其主干長約 1 cm，兩端予以結扎；同側游離出頸總動脈，動脈兩端予以無損傷血管夾阻斷血流，在動脈遠端 1/3 處截斷；24G 靜脈穿刺導管引導下，將頸總動脈近端與移植靜脈對合；8-0 聚丙烯縫線間斷吻合動靜脈斷端，吻合完成后，松開頸總動脈兩斷端的血管夾，兩處吻合口處棉球加壓止血，檢查血管通暢無滲血后，逐層關閉切口。4 周獲取大鼠靜脈橋，并采集未手術的大鼠單側頸外靜脈作為對照。生理鹽水快速沖洗干凈后等分為 3 部分，1/3 段置入 4% 多聚甲醛溶液固定，余下 2/3 置入無菌凍存管，保存于液氮罐中，用于蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測。
1.2 靜脈橋中膜、內膜厚度及 Ki-67 表達的檢測
將 16 g/L 甲醛溶液固定的大鼠靜脈橋標本經乙醇梯度脫水、石蠟包埋后，同段靜脈取間隔相等的 3 處制備成 5 μm 厚度的血管斷面切片。切片分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學技術檢測。石蠟切片經烘烤脫蠟、降梯度乙醇水化、蘇木素染色 10 min、流水沖洗、伊紅染色 5 min、升梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，完成 HE 染色。靜脈橋石蠟切片脫蠟至水，3% 過氧化氫淬滅內源性過氧化物酶 20 min，0.01% 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 5 min×3 次，進口羊血清工作液（北京中杉金橋公司）封閉 30 min，1∶100 Ki-67 抗體（英國 Abcam）4℃ 孵育過夜，PBS 洗滌 5 min×4 次，羊抗兔二抗試劑盒在 37℃ 下孵育 30 min，PBS 洗滌 5 min×3 次，辣根酶標記鏈霉卵白素工作液 37℃ 孵育 30 min，PBS 洗滌 5 min×3 次，二氨基聯苯胺在顯微鏡下控制染色，水洗，蘇木素復染細胞核，流水沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片，完成免疫組化染色。
在每張病理切片中隨機使用 OLYMPUS BX51 光學顯微鏡采集圖像，采圖后應用 Image pro plus 軟件測量每組靜脈的內膜厚度和中膜厚度，同段血管 3 處間斷橫切面測量均值為該段靜脈形態學參數。選擇 4 個不重疊的高倍顯微視野（40×10 倍），通過計算 Ki-67 陽性表達的細胞占總細胞數的百分率來間接反映各組大鼠靜脈橋管壁中 Ki-67 表達的差異。
1.3 Western blot 分析 HES1 在靜脈橋中表達量
用 RIPA 裂解液提取靜脈組織總蛋白，7 000 g 離心 10 min 后取上清，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。取 50 μg 樣品上層，8% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃、100 mA 穩流轉膜過夜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h 后加入 HES1 抗體（1∶1 000 稀釋），4℃ 孵育過夜。洗膜后加入山羊抗兔 HRP-IgG（1∶4 000），于 37℃ 孵育 1 h，洗膜后加入顯影劑，在暗室中顯影，底片經掃描儀透掃后凝膠分析軟件分析，結果以 HES1 與 β-actin 密度的比值表示其相對表達量。
1.4 統計學分析
計量資料以均數±標準差（ ）表示，各組數據比較前行方差齊檢驗，如方差齊則進一步行方差分析，如方差不齊則行變量變換再行方差分析；形態學參數為非正態分布，采用 Mann-Whitney U檢驗。多組間比較采用 one-way ANOVA 檢驗，并通過 Scheffe post hoc 進行兩兩比較。檢驗水準均為 α=0.05。采用 EpiData 3.0 軟件錄入數據，SPSS 19.0 軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）分析數據。
2 結果
2.1 EGCG 對大鼠靜脈橋管壁形態學的作用
大鼠接受自體靜脈橋移植后 1 周，實驗組橋血管管壁較對照組（圖 1a，1b）稍增厚，EGCG 干預對靜脈橋管壁厚度影響不大（圖 1c）。大鼠接受自體靜脈橋移植后 2 周，橋血管管壁較對照組（圖 1d）增厚，內皮細胞層不連續，出現皺褶、斷裂，管壁內的 SMCs 明顯較對照組增多，中膜彈力纖維斷裂、排列紊亂（圖 1e）；給予 EGCG 干預后，橋血管管壁厚度明顯減小，內皮細胞層、平滑肌細胞（SMCs）和中膜彈力纖維層病變均較實驗組出現明顯減輕（圖 1f）。大鼠接受自體靜脈橋移植后 4 周，實驗組橋血管管壁進一步增厚（圖 1g， 1h），EGCG 減小橋血管厚度（圖 1i）。
實驗數據如表 1、2所示，2 周及 4 周后實驗組橋血管內膜厚度較對照組明顯增加 [（46.76±4.89）μmvs.（8.93±0.82）μm，（66.38±6.23）μmvs.（8.29±0.79）μm，P均<0.05]，EGCG 可顯著抑制自體靜脈橋內膜的增厚；2 周及 4 周實驗組橋血管中膜厚度較對照組明顯增加 [（47.28±4.37）μmvs.（16.33±1.52）μm，（63.27±6.18）μmvs.（15.29±1.49）μm，P均<0.05]，EGCG 可顯著抑制自體靜脈橋中膜的增厚。
圖1
EGCG 對大鼠靜脈橋管壁形態學的作用（HE×100） a. 1 周對照組； b. 1 周實驗組； c. 1 周 EGCG 干預組； d. 2 周對照組； e. 2 周實驗組； f. 2 周 EGCG 干預組； g. 4 周對照組； h. 4 周實驗組； i. 4 周 EGCG 干預組
表1
EGCG 對大鼠靜脈橋管壁內膜厚度的作用
表2
EGCG 對大鼠靜脈橋管壁中膜厚度的作用
2.2 EGCG 對大鼠靜脈橋管壁中 Ki-67 表達的作用
Ki-67 表達于 SMCs 的細胞核，第 2 周及第 4 周實驗組橋血管中 Ki-67 表達顯著高于對照組（21.59%±2.29%vs. 1.12%±0.22%，33.19%±3.03%vs. 1.09%±0.19%，P均<0.05），EGCG 可抑制大鼠橋血管壁中 Ki-67 的表達；見圖 2，表 3。
圖2
EGCG 對大鼠靜脈橋中 Ki-67 表達的作用（免疫組化，×400） a. 1 周對照組； b. 1 周實驗組； c. 1 周 EGCG 干預組； d. 2 周對照組； e. 2 周實驗組； f. 2 周 EGCG 干預組； g. 4 周對照組； h. 4 周實驗組； i. 4 周 EGCG 干預組
表3
EGCG 對大鼠靜脈橋 Ki-67 表達的作用
2.3 EGCG 對大鼠靜脈橋管壁中 HES1 表達的作用
由于第 1 周 EGCG 未對移植靜脈橋厚度及 Ki-67 產生有效干預作用，故僅對第 2 周和第 4 周大鼠靜脈橋管壁中 HES1 表達情況進行分析。第 2 周及第 4 周實驗組橋血管中 HES1 表達顯著高于對照組，EGCG 可抑制大鼠橋血管中 HES1 的表達（P<0.05）；見圖 3。
圖3
EGCG 對大鼠靜脈橋中 HES1 表達的作用（Western blot） a. 第 2 周靜脈橋 HES1 表達情況； b. 第 4 周靜脈橋 HES1 表達情況； # 與對照組比較，P<0.05； *與實驗組比較，P<0.05
3 討論
自體靜脈移植是冠狀動脈旁路移植術及外周動脈狹窄搭橋術的重要治療方案，但自體靜脈移植后帶來的遠期狹窄一直困擾著臨床醫師[8]。自體靜脈移植后再狹窄是通過復雜的分子機制導致血管的肥厚和再構的過程，靜脈移植到動脈后血管壓力的改變引起的機械損傷起到了關鍵作用[9-10]。原位靜脈血管內壓力較低，當移植到壓力較高的動脈系統后，靜脈管壁承受的壓力明顯升高，血管過度擴張引起內皮細胞層結構和功能的改變，釋放信號分子，促使中膜平滑肌細胞增殖并向內膜遷移，同時產生過量的細胞外基質，引起內膜增生和管腔狹窄，最終引起移植靜脈堵塞[11-13]。雖然目前對上述靜脈橋再狹窄的病理生理過程闡釋已日臻完善，但調節上述過程的信號通路仍不明確，也少有針對性的藥物來抑制靜脈橋狹窄。
EGCG 是綠茶中的主要成分，既往研究發現其具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤等多種作用[14]。研究發現，在家兔自體靜脈移植前，將靜脈橋浸泡于 EGCG 溶液中，可通過減少中膜平滑肌增殖和重構，有效減輕移植靜脈橋遠期管壁厚度，發現局部應用 EGCG 對靜脈橋遠期具有保護作用[6]。但上述研究局部應用 EGCG 作用時間較短，若全身長期應用 EGCG 可能產生更好的保護作用。本研究結果顯示，長期全身應用 EGCG 同樣可使 28 d 后靜脈橋的中膜和內膜厚度明顯減小，而且反映平滑肌細胞增殖的 Ki-67 表達陽性細胞也明顯減少，說明全身應用 EGCG 也通過抑制中膜平滑肌細胞增殖和重構，從而發揮保護靜脈橋再狹窄的作用。但本研究采用大鼠靜脈橋移植模型，與前述家兔靜脈橋移植模型不同，無法比較局部和全身應用 EGCG 對靜脈橋管壁厚度的差別，后期的研究可能在同一動物模型中比較局部和全身應用 EGCG、甚至聯合應用對靜脈橋遠期狹窄的作用差異。
Notch 是一個高度保守的信號通路，Notch 通路的異常活化與細胞分化、胚胎發育、組織自我更新、腫瘤發生等密切相關[15]。Notch 通路由受體、配體和 DNA 結合蛋白組成，哺乳動物中存在 4 種 Notch 受體（Notch1-4）和 5 種 Notch 配體（Jagged 1、2，Delta-like 1、3、4），γ-促分泌酶復合體酶切 Notch 受體釋放其活化形式 HES1，所以 HES1 的表達增加代表 Notch 通路的活化[3]。最近的文獻發現，通過建立大鼠頸外靜脈移植至頸總動脈模型，測定 1 個月后移植靜脈內 Notch 信號通路的表達，發現移植靜脈內反映 Notch 信號通路激活的 HES1 蛋白表達明顯增加，抑制 Notch 信號通路可以減輕靜脈橋狹窄的程度，說明 Notch 通路可能參與到靜脈橋再狹窄過程中[16]。本研究也得到了與前述文獻類似的結果，發現靜脈橋移植后 HES1 蛋白表達增加；本研究還首次發現給予 EGCG 全身干預后，靜脈橋中 HES1 蛋白的表達出現明顯下降，說明 EGCG 可能通過減少 Notch 信號通路激活，發揮保護靜脈橋狹窄的作用。
本研究首次發現全身應用 EGCG 可通過抑制 Notch 信號通路發揮保護靜脈橋遠期狹窄的作用，為今后基礎研究提供了思路，也為臨床研究提供了理論基礎和應用依據。
