引用本文： 葛鵬, 李漢杰, 陳鑫, 景瑞軍, 姚月娟, 李建忠, 張衛東, 楊波. 脾多肽注射液通過腫瘤轉移相關蛋白 1 參與大鼠急性肺損傷的保護作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(3): 264-268. doi: 10.7507/1007-4848.201803045 復制
急性肺損傷（ALI）是呼吸系統危重癥，以局部炎癥過度反應進而引發全身炎癥反應綜合征為主要特征[1]。然而其發病機理異常復雜，尤其是分子調控機制。因此，深入了解 ALI 的發生、發展及其相關分子調節機制，不僅對于理解 ALI 的病理特點非常重要，也將為從不同水平、不同發病階段針對不同靶點采取新的干預措施提供新的重要線索。
從健康小牛提取的脾多肽注射液具有免疫調節作用，可以使機體免疫功能得到糾正，因此，其主要用于免疫功能低下的腫瘤患者[2-3]。由于脾多肽注射液具有非特異性免疫功能，既往研究發現其對 Toll 樣受體 9 介導的炎癥信號通路具有抑制作用[4]。然而，國內外關于脾多肽注射液對 ALI 的作用機制報道少見，因此，本實驗旨在通過脂多糖（LPS）誘導 ALI 模型，探討脾多肽注射液對 ALI 可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
實驗用 SD 大鼠購自西安醫學院動物實驗中心，脾多肽注射液購自吉林豐生制藥有限公司，LPS、兔抗大鼠 β-actin 抗體購自 Sigma 公司，大鼠 TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒購自北京鼎國生物技術公司，TUNEL 試劑盒購自碧云天生物技術公司；電熱恒溫干燥箱為北京科偉永興儀器有限公司產品，Western blotting 蛋白電泳儀為 Bio-Rad 公司產品；電子顯微鏡購自德國蔡司公司。
1.2 方法
1.2.1 模型建立及分組
將 80 只健康成年雄性 SD 大鼠隨機分為 4 組，分別為 LPS 組，對照組，脾多肽組和 LPS+脾多肽組，每組 20 只。實驗前均禁食 12 h，自由飲水。1%戊巴比妥 40 mg/kg 腹腔注射誘導麻醉。LPS 5 mg/kg 腹腔注射制造大鼠 ALI 模型。
LPS 組，向腹腔內注射 LPS 5 mg/kg；對照組，腹腔內注射與 LPS 等量生理鹽水；脾多肽組，腹腔內注射上述等量生理鹽水，30 min 后肌肉注射脾多肽注射液 2 ml；LPS+脾多肽組，腹腔內注射 LPS 5 mg/kg，30 min 后肌肉注射脾多肽注射液 2 ml。各分組在 4 h 后過量戊巴比妥處死大鼠。
1.2.2 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）
左肺用于支氣管肺泡灌洗（BAL）收集上清液，進行 ELISA 檢測。通過 ELISA 試劑盒檢測白介素 1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子 α（TNF-α）炎癥因子的水平。
1.2.3 肺組織濕/干重比值（W/D）
取右肺上葉放置電子天平稱的計數為濕重（W），迅速置 70℃ 電熱恒溫干燥箱中烤 24 h 后電子天平稱的計數為干重（D），計算 W/D。
1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色
右肺中葉用于 HE 染色。肺組織經過甲醛 24 h 固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、染色、中性樹膠封片，光鏡下觀察各組肺組織形態結構。
1.2.5 原位末端凋亡法（TUNEL）
右肺下葉經過脫蠟、脫水、TUNEL 檢測液孵育、封片。隨意選取鏡下 10 個視野（100×），分別計數凋亡細胞和總細胞數，根據公式凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數計算凋亡指數（AI）。
1.2.6 Western blotting
肺組織 200 mg 通過 SDS 細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）于冰上充分勻漿，離心取上清，用 BCA 法蛋白定量，加上樣緩沖液并煮沸 5 min，進行 SDS-PAGE，電泳轉移到 PVDF 膜上。50 ml 脫脂奶封閉 1 h，分別滴加腫瘤轉移相關蛋白 1（MTA1）抗體、β-actin 抗體及辣根過氧化酶標記的羊抗兔 IgG 二抗。ECL 顯色，凝膠成像系統分析灰度值。
1.3 統計學分析
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析處理。計量資料以均數±標準差（
）表示。兩組間比較采用 Tukey's 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 濕干重比值
LPS 組與對照組相比，濕干重比值明顯增高，提示 LPS 誘導的肺水腫形成。給予脾多肽干預后，大鼠肺濕干重比值顯著下降，肺水腫減輕（圖 1）。
圖1
脾多肽注射液對大鼠肺濕干重比值的影響
與對照組比較，*
2.2 IL-1β 和 TNF-α 的影響
LPS 導致大鼠 IL-1β 和 TNF-α 表達水平顯著升高，LPS+脾多肽組能顯著抑制 IL-1β 和 TNF-α 炎癥因子的水平表達量（圖 2）。
圖2
IL-1β和TNF-α的變化
與對照組比較，*
2.3 大鼠肺組織的病理變化
光鏡下，對照組和脾多肽組，肺組織正常結構（圖 3a、3b）；LPS 導致肺組織水腫，肺泡間隔部分增寬，肺泡形態破壞，可見紅細胞、中性粒細胞浸潤（圖 3c）；LPS+脾多肽組比較，肺組織損傷程度明顯減輕（圖 3d、圖 3e）。
圖3
各組肺組織HE染色（200×）
a：對照組；b：脾多肽組；c：LPS 組；d：LPS+脾多肽組；e：病理評分；與對照組比較，*
2.4 凋亡細胞的影響
LPS 導致大量細胞凋亡，給予脾多肽干預后，凋亡細胞指數顯著下降（圖 4）。
圖4
各組肺組織凋亡指數
與對照組比較，*
2.5 肺組織 MTA1 的表達
LPS 導致肺組織 MTA1 的表達水平顯著增多。而給予脾多肽干預后，MTA1 蛋白表達水平顯著降低（圖 5）。
圖5
肺組織MTA1蛋白的表達
a：Western blotting 法檢測肺組織 MTA1 蛋白的代表性圖像；b：MTA1 表達水平的相對灰度值；與對照組比較，*
3 討論
ALI 是 Ashbaugh 等于 1967 年第一次提出，根據急性肺損傷流行病學驗證數據（acute lung injury verification of epidemiology，ALIVE）顯示，ICU 患者中約有 7% 罹患 ALI，其中，約有 54% 的 ALI 患者將最終發展成為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），病死率高達 26%～35%；老年患者病死率可高達 60%；其年死亡人數與艾滋病、乳腺癌、心肌梗死等疾病相當[5]。雖然針對 ALI/ARDS 病理生理、保守性輸液策略和肺保護性通氣研究已經取得一些進展，但我們還未完全理解其發病機制，尤其是肺損傷和肺修復的分子調控機制，以至于 ALI 的發病率及病死率仍然較高[6-8]。
腫瘤轉移相關蛋白（metastasis-associated protein/metastasis tumor antigen，MTA）是近幾年發現的一類非常重要的轉錄調控分子超家族，其主要作用機理是通過募集組蛋白去乙酰化酶復合物于靶基因的啟動子序列進行轉錄水平的調控（主要為轉錄抑制）[9]。作為這個超家族第一個被發現也是迄今為止分布最廣泛、轉錄調控作用研究最為透徹的成員，MTA1 在腫瘤轉移和侵襲、細胞增殖和生精細胞發育分化等方面發揮重要的調控作用，已被視為主調控子[10]。
文獻[11]證實，LPS 誘導的 ALI 可以上調 MTA1 在巨噬細胞的表達水平，這種刺激作用為 NF-κB 信號依賴性；在 MTA1 敲除后，LPS 誘導的 NF-κB 通路活化減弱且 NF-κB 調控的炎癥因子（IL-1β，TNF-α 和 MIP2）的產量也顯著降低。MTA1 既可作為 NF-κB 通路的靶點又可作為 NF-κB 通路中必不可少的一個中心環節參與了巨噬細胞對 LPS 刺激的炎癥反應[12]。因此，MTA1 在 LPS 刺激的 NF-κB 依賴性炎癥因子產生過程中發揮了至關重要的調節作用。
脾多肽注射液是一種具有激活機體非特異性免疫功能作用的免疫調節劑。通過激活致敏淋巴細胞、促進自然殺傷細胞的細胞毒活性、調節巨噬細胞吞噬功能，從而提高生物免疫功能，廣泛應用于免疫功能低下的腫瘤患者，如肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌等[13-14]。近年來對其深入研究，脾多肽開始應用于感染、損傷疾病的治療[4, 15]。
本實驗證明，脾多肽注射液對 LPS 誘導的大鼠 ALI 具有保護作用，使肺組織的炎性細胞如 IL-1β、TNF-α 滲出減少、保護血管內皮細胞、顯著降低肺毛細血管通透性，并可顯著改善凋亡細胞數目。
肺組織通透性水腫是伴隨 ALI 發生、發展的重要病理進程，由于肺泡內液體增多，有效呼吸面積降低導致低氧刺激，進一步誘發炎癥因子的產生，加重 ALI 對肺泡上皮細胞的損害[16-17]。脾多肽 +LPS 組肺組織 W/D 比值顯著減低，提示水腫減輕，目前已知 MTA1 主要表達于Ⅱ型肺泡上皮細胞，脾多肽+LPS 組肺組織 MTA1 蛋白表達水平明顯降低，我們推測脾多肽注射液通過抑制 MTA1 蛋白的表達，發揮肺保護作用。
然而，我們只研究了脾多肽對 MTA1 的影響，調控 ALI 信號通路較多，脾多肽注射液究竟通過哪條通路如 NF-κB 通路作用于 MTA1 有待我們進一步研究。
綜上所述，我們首次發現，脾多肽對 LPS 誘導的 ALI 具有保護作用，其機制可能是通過影響 MTA1 蛋白的表達來實現的，本實驗結果為研究 ALI 提供新的思路。
急性肺損傷（ALI）是呼吸系統危重癥，以局部炎癥過度反應進而引發全身炎癥反應綜合征為主要特征[1]。然而其發病機理異常復雜，尤其是分子調控機制。因此，深入了解 ALI 的發生、發展及其相關分子調節機制，不僅對于理解 ALI 的病理特點非常重要，也將為從不同水平、不同發病階段針對不同靶點采取新的干預措施提供新的重要線索。
從健康小牛提取的脾多肽注射液具有免疫調節作用，可以使機體免疫功能得到糾正，因此，其主要用于免疫功能低下的腫瘤患者[2-3]。由于脾多肽注射液具有非特異性免疫功能，既往研究發現其對 Toll 樣受體 9 介導的炎癥信號通路具有抑制作用[4]。然而，國內外關于脾多肽注射液對 ALI 的作用機制報道少見，因此，本實驗旨在通過脂多糖（LPS）誘導 ALI 模型，探討脾多肽注射液對 ALI 可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
實驗用 SD 大鼠購自西安醫學院動物實驗中心，脾多肽注射液購自吉林豐生制藥有限公司，LPS、兔抗大鼠 β-actin 抗體購自 Sigma 公司，大鼠 TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒購自北京鼎國生物技術公司，TUNEL 試劑盒購自碧云天生物技術公司；電熱恒溫干燥箱為北京科偉永興儀器有限公司產品，Western blotting 蛋白電泳儀為 Bio-Rad 公司產品；電子顯微鏡購自德國蔡司公司。
1.2 方法
1.2.1 模型建立及分組
將 80 只健康成年雄性 SD 大鼠隨機分為 4 組，分別為 LPS 組，對照組，脾多肽組和 LPS+脾多肽組，每組 20 只。實驗前均禁食 12 h，自由飲水。1%戊巴比妥 40 mg/kg 腹腔注射誘導麻醉。LPS 5 mg/kg 腹腔注射制造大鼠 ALI 模型。
LPS 組，向腹腔內注射 LPS 5 mg/kg；對照組，腹腔內注射與 LPS 等量生理鹽水；脾多肽組，腹腔內注射上述等量生理鹽水，30 min 后肌肉注射脾多肽注射液 2 ml；LPS+脾多肽組，腹腔內注射 LPS 5 mg/kg，30 min 后肌肉注射脾多肽注射液 2 ml。各分組在 4 h 后過量戊巴比妥處死大鼠。
1.2.2 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）
左肺用于支氣管肺泡灌洗（BAL）收集上清液，進行 ELISA 檢測。通過 ELISA 試劑盒檢測白介素 1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子 α（TNF-α）炎癥因子的水平。
1.2.3 肺組織濕/干重比值（W/D）
取右肺上葉放置電子天平稱的計數為濕重（W），迅速置 70℃ 電熱恒溫干燥箱中烤 24 h 后電子天平稱的計數為干重（D），計算 W/D。
1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）染色
右肺中葉用于 HE 染色。肺組織經過甲醛 24 h 固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、染色、中性樹膠封片，光鏡下觀察各組肺組織形態結構。
1.2.5 原位末端凋亡法（TUNEL）
右肺下葉經過脫蠟、脫水、TUNEL 檢測液孵育、封片。隨意選取鏡下 10 個視野（100×），分別計數凋亡細胞和總細胞數，根據公式凋亡指數=凋亡細胞數/總細胞數計算凋亡指數（AI）。
1.2.6 Western blotting
肺組織 200 mg 通過 SDS 細胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）于冰上充分勻漿，離心取上清，用 BCA 法蛋白定量，加上樣緩沖液并煮沸 5 min，進行 SDS-PAGE，電泳轉移到 PVDF 膜上。50 ml 脫脂奶封閉 1 h，分別滴加腫瘤轉移相關蛋白 1（MTA1）抗體、β-actin 抗體及辣根過氧化酶標記的羊抗兔 IgG 二抗。ECL 顯色，凝膠成像系統分析灰度值。
1.3 統計學分析
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析處理。計量資料以均數±標準差（）表示。兩組間比較采用 Tukey's 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 濕干重比值
LPS 組與對照組相比，濕干重比值明顯增高，提示 LPS 誘導的肺水腫形成。給予脾多肽干預后，大鼠肺濕干重比值顯著下降，肺水腫減輕（圖 1）。
圖1
脾多肽注射液對大鼠肺濕干重比值的影響
與對照組比較，*
2.2 IL-1β 和 TNF-α 的影響
LPS 導致大鼠 IL-1β 和 TNF-α 表達水平顯著升高，LPS+脾多肽組能顯著抑制 IL-1β 和 TNF-α 炎癥因子的水平表達量（圖 2）。
圖2
IL-1β和TNF-α的變化
與對照組比較，*
2.3 大鼠肺組織的病理變化
光鏡下，對照組和脾多肽組，肺組織正常結構（圖 3a、3b）；LPS 導致肺組織水腫，肺泡間隔部分增寬，肺泡形態破壞，可見紅細胞、中性粒細胞浸潤（圖 3c）；LPS+脾多肽組比較，肺組織損傷程度明顯減輕（圖 3d、圖 3e）。
圖3
各組肺組織HE染色（200×）
a：對照組；b：脾多肽組；c：LPS 組；d：LPS+脾多肽組；e：病理評分；與對照組比較，*
2.4 凋亡細胞的影響
LPS 導致大量細胞凋亡，給予脾多肽干預后，凋亡細胞指數顯著下降（圖 4）。
圖4
各組肺組織凋亡指數
與對照組比較，*
2.5 肺組織 MTA1 的表達
LPS 導致肺組織 MTA1 的表達水平顯著增多。而給予脾多肽干預后，MTA1 蛋白表達水平顯著降低（圖 5）。
圖5
肺組織MTA1蛋白的表達
a：Western blotting 法檢測肺組織 MTA1 蛋白的代表性圖像；b：MTA1 表達水平的相對灰度值；與對照組比較，*
3 討論
ALI 是 Ashbaugh 等于 1967 年第一次提出，根據急性肺損傷流行病學驗證數據（acute lung injury verification of epidemiology，ALIVE）顯示，ICU 患者中約有 7% 罹患 ALI，其中，約有 54% 的 ALI 患者將最終發展成為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），病死率高達 26%～35%；老年患者病死率可高達 60%；其年死亡人數與艾滋病、乳腺癌、心肌梗死等疾病相當[5]。雖然針對 ALI/ARDS 病理生理、保守性輸液策略和肺保護性通氣研究已經取得一些進展，但我們還未完全理解其發病機制，尤其是肺損傷和肺修復的分子調控機制，以至于 ALI 的發病率及病死率仍然較高[6-8]。
腫瘤轉移相關蛋白（metastasis-associated protein/metastasis tumor antigen，MTA）是近幾年發現的一類非常重要的轉錄調控分子超家族，其主要作用機理是通過募集組蛋白去乙酰化酶復合物于靶基因的啟動子序列進行轉錄水平的調控（主要為轉錄抑制）[9]。作為這個超家族第一個被發現也是迄今為止分布最廣泛、轉錄調控作用研究最為透徹的成員，MTA1 在腫瘤轉移和侵襲、細胞增殖和生精細胞發育分化等方面發揮重要的調控作用，已被視為主調控子[10]。
文獻[11]證實，LPS 誘導的 ALI 可以上調 MTA1 在巨噬細胞的表達水平，這種刺激作用為 NF-κB 信號依賴性；在 MTA1 敲除后，LPS 誘導的 NF-κB 通路活化減弱且 NF-κB 調控的炎癥因子（IL-1β，TNF-α 和 MIP2）的產量也顯著降低。MTA1 既可作為 NF-κB 通路的靶點又可作為 NF-κB 通路中必不可少的一個中心環節參與了巨噬細胞對 LPS 刺激的炎癥反應[12]。因此，MTA1 在 LPS 刺激的 NF-κB 依賴性炎癥因子產生過程中發揮了至關重要的調節作用。
脾多肽注射液是一種具有激活機體非特異性免疫功能作用的免疫調節劑。通過激活致敏淋巴細胞、促進自然殺傷細胞的細胞毒活性、調節巨噬細胞吞噬功能，從而提高生物免疫功能，廣泛應用于免疫功能低下的腫瘤患者，如肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌等[13-14]。近年來對其深入研究，脾多肽開始應用于感染、損傷疾病的治療[4, 15]。
本實驗證明，脾多肽注射液對 LPS 誘導的大鼠 ALI 具有保護作用，使肺組織的炎性細胞如 IL-1β、TNF-α 滲出減少、保護血管內皮細胞、顯著降低肺毛細血管通透性，并可顯著改善凋亡細胞數目。
肺組織通透性水腫是伴隨 ALI 發生、發展的重要病理進程，由于肺泡內液體增多，有效呼吸面積降低導致低氧刺激，進一步誘發炎癥因子的產生，加重 ALI 對肺泡上皮細胞的損害[16-17]。脾多肽 +LPS 組肺組織 W/D 比值顯著減低，提示水腫減輕，目前已知 MTA1 主要表達于Ⅱ型肺泡上皮細胞，脾多肽+LPS 組肺組織 MTA1 蛋白表達水平明顯降低，我們推測脾多肽注射液通過抑制 MTA1 蛋白的表達，發揮肺保護作用。
然而，我們只研究了脾多肽對 MTA1 的影響，調控 ALI 信號通路較多，脾多肽注射液究竟通過哪條通路如 NF-κB 通路作用于 MTA1 有待我們進一步研究。
綜上所述，我們首次發現，脾多肽對 LPS 誘導的 ALI 具有保護作用，其機制可能是通過影響 MTA1 蛋白的表達來實現的，本實驗結果為研究 ALI 提供新的思路。
