瓣膜性心臟病是最常見的心血管疾病之一，可能會導致多種嚴重的并發癥[1]。隨著世界老齡人口數量的增加，預計每年需要心臟瓣膜置換的患者人數將從2003年的約29萬增加到2050年的超過85萬[2]。用于置換手術的人工瓣膜假體分為機械瓣膜和生物瓣膜，生物瓣膜由于無需終生抗凝治療，近年來使用率明顯上升，尤其是在50～70歲的患者中[3]。目前市場上商品化的生物瓣膜大多是采用戊二醛交聯的牛心包或豬主動脈瓣，經戊二醛處理后的生物瓣膜材料表現出顯著增強的韌性、機械強度和抗降解能力[4-6]。然而，戊二醛又是引起瓣膜鈣化的主要因素之一，會誘導細胞死亡，促使細胞碎片的形成，繼而成為鈣化的結合位點；另一方面，戊二醛與組織蛋白的不完全反應也會產生具有細胞毒性的醛基殘留，同樣會誘導鈣化[7-9]。
為了解決戊二醛的鈣化問題，我們開發了一種非戊二醛處理體系以制備生物瓣膜材料，采用經過優化的碳二亞胺（EDC）復合交聯處理以替代戊二醛交聯，采用超臨界流體病毒滅活技術和環氧乙烷滅菌以替代戊二醛的病毒滅活和滅菌作用，同時采用了除原體細胞、抗氧化、表面修飾及超低溫真空干燥等一系列技術以進一步降低材料免疫原性，提高抗鈣化性能及使用的便捷性。
作為與血液長期接觸的植入器械，要求生物瓣膜具有良好的血液相容性。本研究以戊二醛交聯牛心包作為參考材料，通過溶血、體外纖維蛋白原吸附、血小板黏附、凝血酶-抗凝血酶復合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）檢測、補體激活及半體內血液循環實驗，系統表征了采用非戊二醛處理體系制備的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，以評估其在瓣膜置換應用中的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑
0.9%氯化鈉注射液、人血纖維蛋白原、Na125I、TAT ELISA試劑盒、C3a ELISA試劑盒。
1.2 實驗儀器
自動伽瑪計數器、酶標儀、掃描電鏡。
1.3 實驗樣品
新鮮牛心包剝離脂肪組織后，清洗數次，固定于定制模具中。非戊二醛處理樣品（Non-GA）經EDC/NHS復合交聯、除原體細胞、超臨界流體病毒滅活、抗氧化、減薄及超低溫真空干燥、環氧乙烷滅菌處理后備用。戊二醛處理樣品（GA）經0.625%的戊二醛交聯，保存在戊二醛保存液中。樣品測試前，Non-GA組在生理鹽水中復水5 min，GA組用生理鹽水清洗3次，每次15 min。
1.4 實驗方法
1.4.1 溶血實驗
由健康新西蘭兔心臟采血10 mL，加質量濃度20 g/L草酸鉀溶液0.5 mL，制備成新鮮抗凝兔血。取新鮮抗凝兔血8 mL，加質量濃度9 g/L的氯化鈉注射液10 mL稀釋。試驗樣品組每管加入表面積60 cm2的樣品，按6 cm2/mL的比例加入氯化鈉注射液10 mL；陰性對照組每管加入氯化鈉注射液10 mL；陽性對照組每管加入蒸餾水10 mL。每組平行操作3管。全部試管放入37℃水浴中保溫30 min后，每支試管加入0.2 mL稀釋兔血，輕輕混勻，37℃繼續保溫60 min。倒出管內液體以800 g離心5 min。吸取上清液，用酶標儀在545 nm波長處測定吸光度，并計算樣品溶血率：
 |
公式中：A：試驗樣品吸光度；B：陰性對照吸光度；C：陽性對照吸光度。
1.4.2 纖維蛋白原吸附
125I 標記于蛋白質酪氨酸殘基上（未標記上的游離 125I 需低于 1%）。將標記的蛋白質與未標記的蛋白質按照一定比例混合，配制成 1 mg/mL 溶液作為吸附液。將樣品尺寸裁剪成5 mm×5 mm，置于蛋白質吸附液中，37℃下靜置浸泡 3 h 后用 pH 7.4 的緩沖液浸泡清洗。最后將樣品轉移至干凈的測試管中，采用 Wizard 3001480 自動伽瑪計數器檢測γ-射線的放射量，并換算為樣品表面吸附的蛋白質質量。
1.4.3 血小板黏附
由健康志愿者靜脈采血約25 mL，迅速與109 mmol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑按1∶9的比例混合，置于離心管中，200 g離心15 min，收集上層富血小板血漿（PRP）。將PRP加入到放置有樣品（5 mm×5 mm，n=3）的48孔板中，每孔200 μL，37℃孵育1 h后，棄去PRP，PBS清洗3次。每孔加入2.5%的戊二醛4℃固定過夜后，PBS清洗3次，乙醇梯度脫水，冷凍干燥并噴金后使用掃描電鏡觀察血小板黏附情況。
1.4.4 凝血酶-抗凝血酶復合物檢測
參考Denzinger的方法并略作修改[6]。健康志愿者靜脈采血后采用肝素抗凝，使肝素濃度為5 U/mL。樣品置于試管中（2 cm×3 cm，n=3），每管加入肝素抗凝血2 mL；同時設置不加樣品的空白對照組，同樣加入2 mL肝素抗凝血。所有試管于37℃、60 rmp轉速下振蕩1 h后，收集試管內血液，迅速與109 mmol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑按1∶9的比例混合，3 000 g離心10 min分離血漿，然后通過ELISA方法按照TAT試劑盒中說明檢測血漿中TAT濃度。
1.4.5 補體激活
由健康志愿者靜脈采血，1 500 g離心10 min分離血清。分別將試驗樣品、陰性對照（高密度聚乙烯）、陽性對照（醋酸纖維素）置于試管中（n=3），按表面積比例6 cm2/mL加入血清，每管加入肝素抗凝血2 mL，空白對照為未接觸材料的血清。所有試管在37 ℃、60 rmp轉速下振蕩1 h。孵育完成后，轉移各試管中血清，通過ELISA方法根據試劑盒說明書進行補體激活產物的C3a檢測。
1.4.6 半體內血液循環
樣品卷曲至閉合，置于PVC循環導管的回路中。選取健康的新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射麻醉，并采用300 U/kg的肝素抗凝。分離出兔頸部的動靜脈，分別插入留置針并固定，將含有樣品的PVC循環導管通過留置針連接構成一個完整的通路（從動脈出發至靜脈）。循環1 h后，剪下裝有樣品的導管段，生理鹽水清洗后取出樣品，拍照記錄樣品表面的血栓形成情況。最后將樣品浸泡在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，PBS清洗后乙醇梯度脫水，冷凍干燥后噴金，掃描電子顯微鏡觀察樣品表面的血栓情況。
1.5 統計學分析
數據統計采用Minitab 21軟件進行，計量資料以均數±標準差（
±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
動物實驗經中檢華通威國際檢驗（蘇州）有效公司實驗動物福利倫理委員會批準，批準號：2021102801，所有實驗操作均符合實驗動物倫理原則。
2 實驗結果
2.1 溶血實驗
GA組樣品溶血率為0%，Non-GA組樣品溶血率為1.0%，均符合標準GB/T 16886.4-2003要求的樣品溶血率＜5%。
2.2 纖維蛋白原吸附
樣品在纖維蛋白原溶液中孵育3 h后，GA組的表面纖維蛋白原吸附量為（32.76±5.36）μg/cm2，Non-GA組的吸附量為（6.80±0.44）μg/cm2，較GA組下降了79.2%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。
2.3 血小板黏附實驗
樣品與富血小板血漿孵育1 h后，表面黏附的血小板掃描電鏡照片見圖1。GA組樣品上黏附有大量血小板，血小板存在一定程度的激活，有偽足伸出，同時有明顯的團聚。相比之下，Non-GA組樣品上血小板雖然也有激活和部分聚集，但黏附數量明顯減少。
圖1
血小板黏附掃描電鏡照片
左圖：×2 000；右圖：×10 000
2.4 凝血酶-抗凝血酶復合物檢測
樣品與全血孵育后，空白對照組TAT濃度為（8.17±0.47）mg/mL，GA組TAT濃度為（7.76±0.39）mg/mL，Non-GA組TAT濃度為（8.44±1.22）mg/mL。GA組和Non-GA組的TAT濃度與空白對照組差異均無統計學意義。
2.5 補體激活
樣品與血清孵育后，血清中的補體激活產物C3a濃度結果見圖2。各組樣品中，僅陽性對照組的C3a濃度與空白對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.01）。GA組和Non-GA組C3a濃度分別為（13.27±2.25）mg/mL和（19.39±4.24）mg/mL。雖然相比于Non-GA組，GA組C3a濃度略有降低，但兩組差異無統計學意義。
圖2
補體激活實驗結果（n=3）
**：
2.6 半體內血液循環實驗
半體內血液循環實驗結果如圖3所示。經過 1 h的體外循環后，GA組樣品上的血栓覆蓋面積和沉積厚度都明顯高于Non-GA組（圖3 a）。掃描電鏡結果表明，GA組樣品的纖維表面被大量血栓成分所覆蓋，包括沉積了大量紅細胞的纖維蛋白網絡以及活化的血小板，而Non-GA組樣品的纖維表面僅有少量的紅細胞和血小板分布，尚未形成密集的纖維蛋白沉積。
圖3
半體內血液循環實驗結果
a：實驗示意圖；b：樣品表面血栓宏觀照片；c：樣品表面血栓掃描電鏡照片；左圖：×2 000；右圖：×5 000
3 討論
多年的臨床實踐已證明，戊二醛交聯的牛心包具有可接受的血液相容性[11]。然而由于戊二醛生物相容性相對較差，同時也是引起瓣膜鈣化的重要因素之一，仍然需要開發新的工藝以進一步優化[12-13]。研究[14]表明采用碳二亞胺交聯體系處理的瓣膜材料表現出與戊二醛處理相當的抗酶解性和機械性能，同時體外生物相容性和抗鈣化性能要優于戊二醛處理。碳二亞胺能夠活化膠原分子內羧基，使之與氨基反應形成酰胺鍵，其交聯屬于零長度交聯，碳二亞胺不會成為實際交聯的一部分。我們前期研究發現，這種零長度交聯會導致牛心包硬度升高，對瓣膜的血流動力學性能和長期耐久性造成不利影響。另一方面，碳二亞胺交聯體系也不能同時具備戊二醛處理體系所包含的消毒、滅菌及液體保存功能。因此，我們在碳二亞胺交聯的基礎上進行了進一步的優化處理以解決相應問題，開發了一整套的非戊二醛處理技術。本研究以戊二醛交聯牛心包作為參考，系統評估了采用非戊二醛處理體系制備的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，為臨床應用提供研究數據。
材料與血液接觸時，有可能對血液中的紅細胞造成破壞，因而溶血率是材料血液相容性評價中的一個必要檢測指標[15]。本次實驗結果表明，GA組樣品不會引起溶血，而Non-GA組樣品1%的溶血率也遠低于國家標準的5%，溶血風險可接受。
凝血過程取決于材料表面與血液之間的相互作用。當材料與血液接觸時，血漿蛋白將快速吸附并沉積在材料的表面，而蛋白吸附層的變性和活化會激活凝血因子、血小板、白細胞及補體系統，導致凝血過程的發生以及最終的血栓形成[16-17]。纖維蛋白原是最早沉積在材料表面的蛋白質之一，是人體內與凝血有關的重要因子，在凝血酶作用下，纖維蛋白原可轉化為纖維蛋白單體，然后相互聚合，在活化因子Ⅷ的作用下交聯形成穩定的纖維蛋白，即血栓的基質骨架[18]。因此，材料表面的纖維蛋白原吸附可以從一定程度上評估材料的促凝血性，評價材料血液相容性的指標之一[19]。本次實驗中，Non-GA組上的纖維蛋白原吸附量明顯低于GA組，這可能是由于我們在基礎的EDC/NHS交聯上進行了優化處理，增加了牛心包膠原纖維上的親水基團羧基和羥基，提高了材料表面的親水性，已有研究[20-21]表明親水性提高會促進材料表面的抗蛋白吸附能力。
血小板黏附是血漿蛋白吸附后的下一步，在隨后的凝血過程中起著重要作用。在瓣膜置換中，血小板沉積是術后早期微栓子的來源，也可能是后期鈣化的一個病灶[22]。在我們的研究中，通過掃描電鏡觀察，發現GA組樣品上的血小板黏附數量明顯高于Non-GA組，這與纖維蛋白原吸附結果趨勢一致。一方面，纖維蛋白原是介導血小板黏附的主要蛋白質[23]，另一方面，材料的表面結構也是影響血小板黏附的重要因素。在非戊二醛處理工藝中包含的表面修飾技術會使得牛心包瓣膜材料表面粗糙度降低，而光滑表面相對于粗糙表面會有著更少的血小板沉積[22]。
TAT是凝血酶生成的敏感標志物，表明凝血激活[24]。在本次實驗中，GA組和Non-GA組的TAT濃度與空白對照相比均無明顯差異，表明在該實驗條件下，兩種處理體系制備的生物瓣膜材料都不會促進凝血酶介導的凝血途徑激活。
補體系統由20多種血漿蛋白組成，如C3和C5，在機體的宿主防御機制中發揮重要作用，是先天免疫系統的一部分[25-26]。材料與血液接觸后可能導致補體激活并釋放補體激活產物，過敏毒素C3a在補體激活的早期階段產生，其含量的升高意味著補體系統的激活增加，是評價材料血液相容性的重要因素[27]。本次實驗中，GA組和Non-GA組的C3a含量與空白對照組相比差異均無統計學意義，表明兩種材料均不會引起補體激活。
半體內血液循環實驗能夠較大程度上模擬材料與循環血液接觸時的環境，能夠直觀反映材料的血栓形成性。實驗結果證明GA組樣品上的血栓生成量明顯大于Non-GA組，包括大量的纖維蛋白凝塊及網羅交織的紅細胞和活化的血小板，這與纖維蛋白原吸附和血小板黏附實驗結果趨勢相一致。作為血栓形成的前提條件，纖維蛋白原吸附和血小板黏附的增加會增大材料的凝血反應，導致最終更明顯的血栓形成。
綜上所述，非戊二醛處理體系制備的牛心包生物瓣膜材料具有可接受的溶血風險，不會促進凝血酶介導的凝血途徑激活和補體系統激活。與戊二醛交聯牛心包相比，非戊二醛處理體系制備的生物瓣膜材料的纖維蛋白原吸附量和血小板黏附有所降低，血栓沉積也更少，表現出改善的血液相容性。
利益沖突：溫曉曉為沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司員工。
作者貢獻：潘文志、溫曉曉負責實驗與論文撰寫；溫曉曉、張坤負責實驗和數據收集；潘孔榮、周達新負責論文修改；葛均波負責論文總體設計。
瓣膜性心臟病是最常見的心血管疾病之一，可能會導致多種嚴重的并發癥[1]。隨著世界老齡人口數量的增加，預計每年需要心臟瓣膜置換的患者人數將從2003年的約29萬增加到2050年的超過85萬[2]。用于置換手術的人工瓣膜假體分為機械瓣膜和生物瓣膜，生物瓣膜由于無需終生抗凝治療，近年來使用率明顯上升，尤其是在50～70歲的患者中[3]。目前市場上商品化的生物瓣膜大多是采用戊二醛交聯的牛心包或豬主動脈瓣，經戊二醛處理后的生物瓣膜材料表現出顯著增強的韌性、機械強度和抗降解能力[4-6]。然而，戊二醛又是引起瓣膜鈣化的主要因素之一，會誘導細胞死亡，促使細胞碎片的形成，繼而成為鈣化的結合位點；另一方面，戊二醛與組織蛋白的不完全反應也會產生具有細胞毒性的醛基殘留，同樣會誘導鈣化[7-9]。
為了解決戊二醛的鈣化問題，我們開發了一種非戊二醛處理體系以制備生物瓣膜材料，采用經過優化的碳二亞胺（EDC）復合交聯處理以替代戊二醛交聯，采用超臨界流體病毒滅活技術和環氧乙烷滅菌以替代戊二醛的病毒滅活和滅菌作用，同時采用了除原體細胞、抗氧化、表面修飾及超低溫真空干燥等一系列技術以進一步降低材料免疫原性，提高抗鈣化性能及使用的便捷性。
作為與血液長期接觸的植入器械，要求生物瓣膜具有良好的血液相容性。本研究以戊二醛交聯牛心包作為參考材料，通過溶血、體外纖維蛋白原吸附、血小板黏附、凝血酶-抗凝血酶復合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）檢測、補體激活及半體內血液循環實驗，系統表征了采用非戊二醛處理體系制備的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，以評估其在瓣膜置換應用中的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑
0.9%氯化鈉注射液、人血纖維蛋白原、Na125I、TAT ELISA試劑盒、C3a ELISA試劑盒。
1.2 實驗儀器
自動伽瑪計數器、酶標儀、掃描電鏡。
1.3 實驗樣品
新鮮牛心包剝離脂肪組織后，清洗數次，固定于定制模具中。非戊二醛處理樣品（Non-GA）經EDC/NHS復合交聯、除原體細胞、超臨界流體病毒滅活、抗氧化、減薄及超低溫真空干燥、環氧乙烷滅菌處理后備用。戊二醛處理樣品（GA）經0.625%的戊二醛交聯，保存在戊二醛保存液中。樣品測試前，Non-GA組在生理鹽水中復水5 min，GA組用生理鹽水清洗3次，每次15 min。
1.4 實驗方法
1.4.1 溶血實驗
由健康新西蘭兔心臟采血10 mL，加質量濃度20 g/L草酸鉀溶液0.5 mL，制備成新鮮抗凝兔血。取新鮮抗凝兔血8 mL，加質量濃度9 g/L的氯化鈉注射液10 mL稀釋。試驗樣品組每管加入表面積60 cm2的樣品，按6 cm2/mL的比例加入氯化鈉注射液10 mL；陰性對照組每管加入氯化鈉注射液10 mL；陽性對照組每管加入蒸餾水10 mL。每組平行操作3管。全部試管放入37℃水浴中保溫30 min后，每支試管加入0.2 mL稀釋兔血，輕輕混勻，37℃繼續保溫60 min。倒出管內液體以800 g離心5 min。吸取上清液，用酶標儀在545 nm波長處測定吸光度，并計算樣品溶血率：
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公式中：A：試驗樣品吸光度；B：陰性對照吸光度；C：陽性對照吸光度。
1.4.2 纖維蛋白原吸附
125I 標記于蛋白質酪氨酸殘基上（未標記上的游離 125I 需低于 1%）。將標記的蛋白質與未標記的蛋白質按照一定比例混合，配制成 1 mg/mL 溶液作為吸附液。將樣品尺寸裁剪成5 mm×5 mm，置于蛋白質吸附液中，37℃下靜置浸泡 3 h 后用 pH 7.4 的緩沖液浸泡清洗。最后將樣品轉移至干凈的測試管中，采用 Wizard 3001480 自動伽瑪計數器檢測γ-射線的放射量，并換算為樣品表面吸附的蛋白質質量。
1.4.3 血小板黏附
由健康志愿者靜脈采血約25 mL，迅速與109 mmol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑按1∶9的比例混合，置于離心管中，200 g離心15 min，收集上層富血小板血漿（PRP）。將PRP加入到放置有樣品（5 mm×5 mm，n=3）的48孔板中，每孔200 μL，37℃孵育1 h后，棄去PRP，PBS清洗3次。每孔加入2.5%的戊二醛4℃固定過夜后，PBS清洗3次，乙醇梯度脫水，冷凍干燥并噴金后使用掃描電鏡觀察血小板黏附情況。
1.4.4 凝血酶-抗凝血酶復合物檢測
參考Denzinger的方法并略作修改[6]。健康志愿者靜脈采血后采用肝素抗凝，使肝素濃度為5 U/mL。樣品置于試管中（2 cm×3 cm，n=3），每管加入肝素抗凝血2 mL；同時設置不加樣品的空白對照組，同樣加入2 mL肝素抗凝血。所有試管于37℃、60 rmp轉速下振蕩1 h后，收集試管內血液，迅速與109 mmol/L的枸櫞酸鈉抗凝劑按1∶9的比例混合，3 000 g離心10 min分離血漿，然后通過ELISA方法按照TAT試劑盒中說明檢測血漿中TAT濃度。
1.4.5 補體激活
由健康志愿者靜脈采血，1 500 g離心10 min分離血清。分別將試驗樣品、陰性對照（高密度聚乙烯）、陽性對照（醋酸纖維素）置于試管中（n=3），按表面積比例6 cm2/mL加入血清，每管加入肝素抗凝血2 mL，空白對照為未接觸材料的血清。所有試管在37 ℃、60 rmp轉速下振蕩1 h。孵育完成后，轉移各試管中血清，通過ELISA方法根據試劑盒說明書進行補體激活產物的C3a檢測。
1.4.6 半體內血液循環
樣品卷曲至閉合，置于PVC循環導管的回路中。選取健康的新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射麻醉，并采用300 U/kg的肝素抗凝。分離出兔頸部的動靜脈，分別插入留置針并固定，將含有樣品的PVC循環導管通過留置針連接構成一個完整的通路（從動脈出發至靜脈）。循環1 h后，剪下裝有樣品的導管段，生理鹽水清洗后取出樣品，拍照記錄樣品表面的血栓形成情況。最后將樣品浸泡在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，PBS清洗后乙醇梯度脫水，冷凍干燥后噴金，掃描電子顯微鏡觀察樣品表面的血栓情況。
1.5 統計學分析
數據統計采用Minitab 21軟件進行，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
動物實驗經中檢華通威國際檢驗（蘇州）有效公司實驗動物福利倫理委員會批準，批準號：2021102801，所有實驗操作均符合實驗動物倫理原則。
2 實驗結果
2.1 溶血實驗
GA組樣品溶血率為0%，Non-GA組樣品溶血率為1.0%，均符合標準GB/T 16886.4-2003要求的樣品溶血率＜5%。
2.2 纖維蛋白原吸附
樣品在纖維蛋白原溶液中孵育3 h后，GA組的表面纖維蛋白原吸附量為（32.76±5.36）μg/cm2，Non-GA組的吸附量為（6.80±0.44）μg/cm2，較GA組下降了79.2%，差異具有統計學意義（P＜0.01）。
2.3 血小板黏附實驗
樣品與富血小板血漿孵育1 h后，表面黏附的血小板掃描電鏡照片見圖1。GA組樣品上黏附有大量血小板，血小板存在一定程度的激活，有偽足伸出，同時有明顯的團聚。相比之下，Non-GA組樣品上血小板雖然也有激活和部分聚集，但黏附數量明顯減少。
圖1
血小板黏附掃描電鏡照片
左圖：×2 000；右圖：×10 000
2.4 凝血酶-抗凝血酶復合物檢測
樣品與全血孵育后，空白對照組TAT濃度為（8.17±0.47）mg/mL，GA組TAT濃度為（7.76±0.39）mg/mL，Non-GA組TAT濃度為（8.44±1.22）mg/mL。GA組和Non-GA組的TAT濃度與空白對照組差異均無統計學意義。
2.5 補體激活
樣品與血清孵育后，血清中的補體激活產物C3a濃度結果見圖2。各組樣品中，僅陽性對照組的C3a濃度與空白對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.01）。GA組和Non-GA組C3a濃度分別為（13.27±2.25）mg/mL和（19.39±4.24）mg/mL。雖然相比于Non-GA組，GA組C3a濃度略有降低，但兩組差異無統計學意義。
圖2
補體激活實驗結果（n=3）
**：
2.6 半體內血液循環實驗
半體內血液循環實驗結果如圖3所示。經過 1 h的體外循環后，GA組樣品上的血栓覆蓋面積和沉積厚度都明顯高于Non-GA組（圖3 a）。掃描電鏡結果表明，GA組樣品的纖維表面被大量血栓成分所覆蓋，包括沉積了大量紅細胞的纖維蛋白網絡以及活化的血小板，而Non-GA組樣品的纖維表面僅有少量的紅細胞和血小板分布，尚未形成密集的纖維蛋白沉積。
圖3
半體內血液循環實驗結果
a：實驗示意圖；b：樣品表面血栓宏觀照片；c：樣品表面血栓掃描電鏡照片；左圖：×2 000；右圖：×5 000
3 討論
多年的臨床實踐已證明，戊二醛交聯的牛心包具有可接受的血液相容性[11]。然而由于戊二醛生物相容性相對較差，同時也是引起瓣膜鈣化的重要因素之一，仍然需要開發新的工藝以進一步優化[12-13]。研究[14]表明采用碳二亞胺交聯體系處理的瓣膜材料表現出與戊二醛處理相當的抗酶解性和機械性能，同時體外生物相容性和抗鈣化性能要優于戊二醛處理。碳二亞胺能夠活化膠原分子內羧基，使之與氨基反應形成酰胺鍵，其交聯屬于零長度交聯，碳二亞胺不會成為實際交聯的一部分。我們前期研究發現，這種零長度交聯會導致牛心包硬度升高，對瓣膜的血流動力學性能和長期耐久性造成不利影響。另一方面，碳二亞胺交聯體系也不能同時具備戊二醛處理體系所包含的消毒、滅菌及液體保存功能。因此，我們在碳二亞胺交聯的基礎上進行了進一步的優化處理以解決相應問題，開發了一整套的非戊二醛處理技術。本研究以戊二醛交聯牛心包作為參考，系統評估了采用非戊二醛處理體系制備的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，為臨床應用提供研究數據。
材料與血液接觸時，有可能對血液中的紅細胞造成破壞，因而溶血率是材料血液相容性評價中的一個必要檢測指標[15]。本次實驗結果表明，GA組樣品不會引起溶血，而Non-GA組樣品1%的溶血率也遠低于國家標準的5%，溶血風險可接受。
凝血過程取決于材料表面與血液之間的相互作用。當材料與血液接觸時，血漿蛋白將快速吸附并沉積在材料的表面，而蛋白吸附層的變性和活化會激活凝血因子、血小板、白細胞及補體系統，導致凝血過程的發生以及最終的血栓形成[16-17]。纖維蛋白原是最早沉積在材料表面的蛋白質之一，是人體內與凝血有關的重要因子，在凝血酶作用下，纖維蛋白原可轉化為纖維蛋白單體，然后相互聚合，在活化因子Ⅷ的作用下交聯形成穩定的纖維蛋白，即血栓的基質骨架[18]。因此，材料表面的纖維蛋白原吸附可以從一定程度上評估材料的促凝血性，評價材料血液相容性的指標之一[19]。本次實驗中，Non-GA組上的纖維蛋白原吸附量明顯低于GA組，這可能是由于我們在基礎的EDC/NHS交聯上進行了優化處理，增加了牛心包膠原纖維上的親水基團羧基和羥基，提高了材料表面的親水性，已有研究[20-21]表明親水性提高會促進材料表面的抗蛋白吸附能力。
血小板黏附是血漿蛋白吸附后的下一步，在隨后的凝血過程中起著重要作用。在瓣膜置換中，血小板沉積是術后早期微栓子的來源，也可能是后期鈣化的一個病灶[22]。在我們的研究中，通過掃描電鏡觀察，發現GA組樣品上的血小板黏附數量明顯高于Non-GA組，這與纖維蛋白原吸附結果趨勢一致。一方面，纖維蛋白原是介導血小板黏附的主要蛋白質[23]，另一方面，材料的表面結構也是影響血小板黏附的重要因素。在非戊二醛處理工藝中包含的表面修飾技術會使得牛心包瓣膜材料表面粗糙度降低，而光滑表面相對于粗糙表面會有著更少的血小板沉積[22]。
TAT是凝血酶生成的敏感標志物，表明凝血激活[24]。在本次實驗中，GA組和Non-GA組的TAT濃度與空白對照相比均無明顯差異，表明在該實驗條件下，兩種處理體系制備的生物瓣膜材料都不會促進凝血酶介導的凝血途徑激活。
補體系統由20多種血漿蛋白組成，如C3和C5，在機體的宿主防御機制中發揮重要作用，是先天免疫系統的一部分[25-26]。材料與血液接觸后可能導致補體激活并釋放補體激活產物，過敏毒素C3a在補體激活的早期階段產生，其含量的升高意味著補體系統的激活增加，是評價材料血液相容性的重要因素[27]。本次實驗中，GA組和Non-GA組的C3a含量與空白對照組相比差異均無統計學意義，表明兩種材料均不會引起補體激活。
半體內血液循環實驗能夠較大程度上模擬材料與循環血液接觸時的環境，能夠直觀反映材料的血栓形成性。實驗結果證明GA組樣品上的血栓生成量明顯大于Non-GA組，包括大量的纖維蛋白凝塊及網羅交織的紅細胞和活化的血小板，這與纖維蛋白原吸附和血小板黏附實驗結果趨勢相一致。作為血栓形成的前提條件，纖維蛋白原吸附和血小板黏附的增加會增大材料的凝血反應，導致最終更明顯的血栓形成。
綜上所述，非戊二醛處理體系制備的牛心包生物瓣膜材料具有可接受的溶血風險，不會促進凝血酶介導的凝血途徑激活和補體系統激活。與戊二醛交聯牛心包相比，非戊二醛處理體系制備的生物瓣膜材料的纖維蛋白原吸附量和血小板黏附有所降低，血栓沉積也更少，表現出改善的血液相容性。
利益沖突：溫曉曉為沛嘉醫療科技（蘇州）有限公司員工。
作者貢獻：潘文志、溫曉曉負責實驗與論文撰寫；溫曉曉、張坤負責實驗和數據收集；潘孔榮、周達新負責論文修改；葛均波負責論文總體設計。
