肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一種常見的遺傳性心臟病，以心肌肥厚、發育不良和纖維化為特征[1]。其中心肌纖維化是引起惡性心律失常和不良心臟重構的重要病理基礎[2]。過度纖維化可引起微血管功能障礙，心房、心室變薄，并逐漸擴張，引起收縮、舒張功能障礙，最終導致心力衰竭甚至死亡[3-8]。微小RNAs（miRNAs）通過與目標mRNA互補序列結合從而負性調控基因表達[9]，在心臟纖維化的發生、發展過程中發揮著重要的調控作用。本研究通過對HCM患者心肌組織中差異表達的miRNAs進行分析，并在細胞水平對其調控機制進行深入研究，探討其調控HCM心肌纖維化的機制。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選擇2014年1月—2018年6月42例在四川大學華西醫院診斷并行外科手術治療的HCM患者，其中男29例、女13例，中位年齡46（15～69）歲。納入標準：（1）年齡14～70歲，性別不限；（2）明確診斷HCM，符合以下診斷標準：① 通過心臟彩色超聲、磁共振成像或心臟CT測量的左室壁厚度>15 mm；② 排除瓣膜狹窄、高血壓等病因所引起的心肌肥厚；（3）具有外科手術指征，同意進行外科手術，且術前評估無嚴重器官功能衰竭、感染等，可耐受外科手術治療；（4）同意參加研究且術后能隨訪。排除標準：同期行冠狀動脈旁路移植術等手術。根據術中切除的心肌組織分別進行組織染色。通過組織切片中纖維化染色計算膠原容積指數（collagen volume fraction，CVF）。根據纖維化程度（CVF%）計算平均值，并將患者分為兩組：低于平均值者為輕度纖維化組，高于平均值者為重度纖維組。然后在兩組分別檢測纖維化相關的4個miRNAs（miR-19b、miR-484、miR-221和miR-222）的表達差異，尋找差異表達的目標RNA。
1.2 實驗動物及材料
選取健康Sprague Dawley（SD）大鼠乳鼠（0～2 d齡）20只，重量50～60 g，雌雄不限（成都達碩實驗動物有限公司提供）。
實驗材料：DMEM基礎培養基（上海中喬新舟生物科技有限公司）；胰酶細胞消化液（0.05%胰酶）（C0202，上海碧云天生物技術有限公司）；Collagenase TypeⅡ （9001-12-1，北京亞米生物科技有限公司）；D-PBS （C0221D，上海碧云天生物技術有限公司）；PeproTech重組人轉化生長因子（tansforming growth factor-β1，TGF-β1，100-21c，派普泰克）；α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab7817，Abcam）；miR-484 antagomir（R10034.8，廣州銳博）；HIPK-1（YN0007，Immunoway）；細胞蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S，上海碧云天生物技術有限公司）；PVDF膜（FFP24，上海碧云天生物技術有限公司）；雙熒光素酶試劑盒（上海吉瑪生物制藥有限公司）；mRNA/lncRNA qRT-PCR Kit（R11088.2，廣州銳博）；Masson三色染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒 （Qiagen 218161）；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒 （廣州銳博）；QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，德國）；4%多聚甲醛、甲醇、乙醇（成都市科龍化工試劑廠）；Trizol RNA分離試劑（Life）；Uni-Reverse primer（廣州銳博）；miRs Forward primer（廣州銳博）；RNA 逆轉錄儀（美國 Bio-Rad 公司）；全視野細胞掃描分析儀（美國Nexcelom）； BIO-RAD CFX96 q-PCR system（美國Bio-Rad公司）。
1.3 心肌組織Masson染色與miRNAs表達檢測
（1）纖維化程度檢測：取手術切除的心肌組織（<15 min），將其剪切成厚度<5 mm、長度<1 cm長方體狀，甲醛固定，石蠟包埋，按說明書進行三色染色。經染色后膠原纖維染成藍色，肌纖維染成紅色，使用Image-pro-plus 6.0分析測量膠原纖維面積得出CVF值（%）。每個切片測量2次，誤差<3%。
（2）心肌組織中miRNAs表達量檢測：用TRIzoL法提取心肌組織中總RNA。取100 g組織磨成粉末狀，加入1 mL Trizol液，搖勻；使用酚氯仿法抽取總RNAs。測量濃度后，取0.5 μg總RNAs使用加尾法加尾，按說明書進行逆轉錄體系配制，進行逆轉錄程序；所有cDNAs放入–20℃保存。進行qtPCR反應體系制備：引物序列如下： U6：CAAGGATGACACGCAAATTCG；hsa-miR-19b：TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA；hsa-miR-221：AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC；hsa-miR-222：AGCTACATCT GGCT ACTGGGT；hsa-miR-484：ATCATGATGGGCTCCTCGGTGT。按說明書，反應體系總量為10 μL（2×QuantiFast? SYBR? Green PCR Master 5 μL+Universal primer0.2 μL+miR-specific primer 0.2 μL+cDNA 1 μL+Nuclease-free H2O 3.6 μL）。反應條件為：95℃ 5 min預變性，95℃ 10 s 變性，60℃ 30 s 退火和延伸，共計40個循環后，將溫度從60℃緩慢升至97℃，溫度每變化1℃連續進行5次采集繪制溶解曲線。Cq值定義即 PCR 擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數。表達量采用 2–??Cq 法計算。?Cq=Cq 目的基因–Cq 內參基因，??Cq=?Cq 實驗組–?Cq對照組，相對表達量=2–??Cq。
1.5 細胞實驗
1.5.1 心臟成纖維細胞的分離、培養、鑒定、活化與質粒轉染
取乳鼠左心室心肌組織，剪碎后使用酶消化法消化心肌組織，再使用差速貼壁法分離心臟成纖維細胞。用10%FBS DMEM高糖培養基，于37℃ 5%CO2孵箱中培養心臟成纖維細胞，并使其傳代，傳至3～4代。使用免疫熒光法對心臟成纖維細胞進行鑒定后，使用TGF-β1使心臟成纖維細胞活化、增殖，根據其是否使用TGF-β1活化分為TGF-β1組和對照組（Control）。通過檢測α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）表達量確定心臟成纖維化細胞的活化。將活化后的心臟成纖維細胞按說明書分別轉染NC-antagomir（TGF-β1+NC-antagomir組）和miR-484 antagomir（TGF-β1+miR-484-antagomir組）。
1.5.2 各組心臟成纖維細胞中RNAs表達量的檢測
將培養的心臟成纖維細胞加入氯仿（1 mL Trizol/0.2 mL 氯仿）充分乳化后，取上清液加入等體積異丙醇，離心后棄上清液，加入75%乙醇（1 mL Trizol/1 mL 乙醇）漂洗，干燥，加入RNase-Free water 20 μL溶解，以提取細胞中總RNAs。miRNAs第4步進行加尾、逆轉錄和PCR反應，分別計算miRNAs的表達量。
mRNAs采用莖環法進行檢測，取1 μg總RNAs配制成10 μL體系進行逆轉錄，所得cDNAs放入–20℃冰箱保存。引物設計：小鼠HIPK1上游引物5'-GACC AGCA TCAGCCAATCAT-3'，下游引物5'-GACATTAGACCTCGCCTTCAG-3'；小鼠GAPDH上游引物5'-GAGAAGGCTGGGGCTCAC-3'，下游引物5'-GTTGTC ATGGATGACCTTGGC-3'。根據試劑盒說明書配制成20 μL體系，反應條件為：95℃ 10 min預變性，95℃ 5 s 變性，60℃ 30 s 退火和72℃ 30 s 延伸，共計40個循環后，繪制溶解曲線。按上述方法4計算相對表達量。
1.5.3 細胞蛋白表達量測定
根據蛋白提取盒說明書所示，在細胞培養皿中加入RIPA裂解液，提取總蛋白；根據BCA試劑盒進行蛋白定量；加十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液煮沸10 min，取20 μg蛋白樣品上樣，10% SDS-PAGE電泳（80 V，30 min，然后100 V，60 min）；放入4℃層析柜中轉膜（電流150 mA，12%膠轉50 min，8%膠轉90 min）；5%脫脂牛奶50 mL室溫封閉1 h；加一抗HIPK1 （1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）內參、GDPDH （1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，配顯影液（說明書按A∶B∶C=1∶1∶1比例混合），與蛋白膜反應15 s后，在凝膠成像系統中曝光并采集圖像；采用Image lab軟件進行蛋白條帶分析，用HIPK1條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比較計算HIPK1的相對表達量。
1.4 生物信息學預測miR-484的靶基因
在TargetScan官網和miRBase數據庫中輸入miR-484，預測其靶基因，根據預測結果選擇可能的靶標蛋白，再根據該蛋白在器官的表達情況和既往文獻報道，最終選擇了HIPK1作為miR-484的靶基因進行進一步驗證。
1.6 雙熒光素酶報告基因檢測
將HIPK1 3'UTR區域（預測出來的與miR-484結合的位點）構建到pmiR-GLO載體的海腎熒光素酶基因的的后面，稱之為正常（WT）型；將結合位點突變后構建獲得的稱之為突變（MUT）型；以螢火蟲熒光素酶為內參。將WT型與MUT型載體質粒與miR-484 mimics 和miR-484 NC mimics質粒共轉染293T細胞。由此分為4組，即：WT+miR-484 mimics、WT+NC-mimics、MUT+miR-484 mimics、WUT+NC-mimics。培養48 h后，按雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書裂解細胞并于雙熒光素酶報告基因系統分別檢測其熒光值，并進一步計算熒光素酶活性。
1.7 統計學分析
Kolmogorov-Smirnov檢驗用于檢驗計量資料是否服從正態分布，正態分布的計量資料采用均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合則采用中位數描述，組間比較采用非參數檢驗；多組間計量資料比較采用One-way ANOVA。計數資料采用率描述，組間比較采用χ2 檢驗。P≤0.05表示差異有統計學意義。使用 SPSS 22.0 進行統計分析與處理。
1.8 倫理審查
本研究已通過四川大學華西醫院倫理委員會批準（2018250）。研究遵循世界衛生組織赫爾辛基宣言擬定的道德標準，所有的入選患者在研究前均被給予研究知情同意書，本研究也對所有研究中的臨床資料堅持嚴格的保密原則。動物實驗方案經四川大學華西醫院動物實驗倫理委員會審查和批準（2018107A）。對動物的所有操作均符合美國國立衛生研究院發布的關于用于生物醫學研究的實驗動物的使用和護理指南（第85-23號，1996年修訂）。
2 結果
2.1 心肌組織中miRNAs表達量測定
根據心肌組織切片進行Masson染色，分別計算各樣本CVF值。輕度纖維化組CVF值明顯低于重度纖維化組，差異具有統計學意義（12.128%±2.104% vs. 42.936%±9.528%，t=–7.060，P<0.05）。 在輕度與重度纖維化組中分別檢檢測miR-221、miR-222、miR-19b和miR-484的表達差異，結果分別為：miR-221：0.754±0.453 vs. 8.435±13.021（P<0.05）；miR-222：1.380±2.094 vs. 5.361±5.046（P<0.05）； miR-19b：8.810±9.060 vs. 2.861±2.262（P<0.05）；miR-484：1.407±1.894 vs. 4.156±4.378（P<0.05）。可見，miR-221、miR-222和miR-484在重度纖維化組的表達量明顯高于輕度纖維化組，而miR-19b則明顯低于輕度纖維化組，差異均具有統計學意義；見圖1。
圖1
輕、重度纖維化組的心肌組織中miRNAs表達情況
*：
2.2 心臟成纖維細胞活化前、后miRNAs表達量
心臟成纖維細胞受TGF-β1刺激增殖分化為肌成纖維細胞，與活化前比較，miR-484、miR-221和miR-222表達量分別為：miR-484：5.375±1.032 vs. 1.060±0.068（P<0.05），miR-221：2.638±0.531 vs. 1.096±0.124（P<0.05）， miR-222：2.036±0.349 vs. 0.987±0.047（P<0.05），可見心臟成纖維細胞活化后其表達量均明顯增加，而miR-19b表達量在活化前、后無明顯變化（0.988±0.034 vs. 1.061±0.197，P>0.05）；見圖2。因miR-484在活化后表達量大于活化前的4倍以上，故選擇miR-484進行后續研究。
圖2
miRNAs在心臟成纖維細胞活化前、后的表達差異
Control：對照組；TGF-β1：轉化生長因子-β1；CF：心臟成纖維細胞；*：
2.3 調控miRNA-484表達對心臟成纖維細胞表型變化的影響
心臟成纖維細胞受TGF-β1刺激活化后，分別轉染miR-484 antagomir或NC antagomir。通過檢測miR-484的表達發現，轉染NC antagomir與轉染miR-484 antagomir的心臟成纖維細胞中miR-484的表達量分別為 5.466±0.317和0.301±0.013（P<0.05），可見miR-484表達水平較明顯下降，證明轉染成功。
我們進一步檢測了心臟成纖維細胞中的促纖維化相關蛋白在各組中的表達情況，結果發現：轉染NC antagomir組與miR-484 antagomir組中，α-SMA蛋白表達水平分別為2.964±0.022和1.654±0.021（P<0.05）；CollagenⅠ在兩組中的蛋白表達量分別為2.725±0.077和1.277±0.721（P<0.05）；見圖3。
圖3
調控miRNA-484表達后，纖維化相關蛋白在心臟成纖維細胞中的表達情況
a：免疫組化條帶圖；b：促纖維化蛋白表達量；α-SMA：α-肌動蛋白；CollagenⅠ：Ⅰ型膠原蛋白；*：
2.4 調控miRNA-484表達后靶基因的表達變化
心臟成纖維細胞經TGF-β1刺激轉化為肌成纖維細胞。再分別轉染miR-484 antagomir和 NC antagomir，并分別在mRNA和蛋白水平測定了HIPK1 的表達情況（使用GAPDH為內參基因）。結果如下：心臟成纖維細胞在TGF-β1刺激活化后，miR-484表達增加，HIPK1的mRNA表達量在活化前與活化后的表達量分別為1.001±0.019 和0.501±0.232（P<0.05）；而轉染NC antagomir和miR-484 antagomir后，HIPK1的mRNA表達量在兩組間的表達水平分別為0.626±0.077和0.595±0.095（ P>0.05）；在蛋白水平，HIPK1在TGF-β1+miR-484 antagomir 組與TGF-β1+NC antagomir組的表達量分別為0.326±0.015和0.972±0.013（P<0.05）；見圖4。
圖4
調控miR-484表達后靶基因HIPK1的蛋白表達變化
a：免疫組化條帶圖；b：HIPK1 表達量；TGF-β1：轉化生長因子-β1；C：對照組；T：轉化生長因子-β1組；T+N：TGF-β1+NC antagomir組；T+M：TGF-β1+miR-484 antagomir組；HIPK-1：同源結構域相互蛋白激酶-1；**：
2.5 雙熒光素酶報告基因檢測結果
預測結合位點，并定義MUT組和WT組。結合位點突變者為MUT組，結合位點未突變者為WT組。分別與NC mimics、miR-484 mimics共轉染后，再分別比較它們的熒光素酶活性，結果如下：MUT組：轉染NC mimics與轉染miR-484 mimics的熒光素酶活性分別為1.012±0.021和0.990±0.002（P>0.05）；而在WT組，它們的熒光素酶活性分別為0.995±0.050和0.662±0.008（P<0.05）。可見將帶有結合位點的質粒與miR-484 mimics質粒共轉染后熒光素酶活性明顯下降，這表明HIPK1與miR-484之間存在靶向結合關系。
3 討論
心肌纖維化是心臟針對各種刺激（生理或病理）所作出的病理反應，是引起心功能衰竭的重要病理生理機制。HCM尤其是合并流出道梗阻者，長時間的壓力超負荷會導致嚴重的間質和血管周圍纖維化[10-12]，嚴重破壞心臟結構，使心肌興奮-收縮耦合機制嚴重受損，收縮和舒張功能進行性下降，出現惡性心律失常，心力衰竭甚至死亡的嚴重后果[13-14]。
心臟成纖維細胞是纖維化主要的效應細胞，它在各種病因刺激下轉分化為具有分泌和收縮功能的肌成纖維細胞，是驅動纖維化的關鍵因素[15]。常駐心臟成纖維細胞是肌成纖維細胞的主要來源[16]。在各種病理因素作用下，心臟成纖維細胞被激活并轉分化為具有廣泛內質網的肌成纖維細胞，可合成和分泌收縮蛋白如α-SMA，是細胞活化成熟的表型特征[17]，故α-SMA有助于識別組織中的肌成纖維細胞。miRNAs是研究最為普遍的非編碼RNA，它可以調節多種細胞類型。現已證實，多種miRNAs參與了心臟成纖維細胞的活化過程。既往文獻[18]報道，miR-484已被證實參與了腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移等過程，同時，miR-484已被報道參與了肝臟纖維化過程，而其在心肌纖維化中的作用尚未闡明。我們在肥厚型心肌患者心肌組織樣本中發現：在重度纖維化組中，miR-484的表達量明顯高于輕度纖維化組，證明miR-484可能參與HCM患者心肌纖維化的過程。進一步的細胞實驗顯示，心臟成纖維細胞受到TGF-β1刺激后，α-SMA蛋白表達量明顯增加，證明成纖維細胞得到活化。并在其活化前、后分別測量了miR-484的表達，發現miR-484的表達量也明顯上調，CollagenⅠ的表達也隨之增加。而使用miR-484 antagomir下調miR-484的表達后，心臟成纖維細胞中α-SMA和CollagenⅠ的表達量也隨之下降，證明心臟成纖維細胞的活化受到了抑制。由此可得出，細胞內miR-484的變化可能參與心臟成纖維細胞活化過程，調控miR-484 的表達可抑制心臟成纖維細胞介導的心肌纖維化過程，從而緩解纖維化程度。可見細胞內miR-484可成為心肌纖維化的調控靶點，為心肌纖維化治療提供策略。
另外，在我們的研究中，首次發現HIPK1為miR-484的直接靶標。體外實驗發現：在心臟成纖維細胞增殖、分化過程中，miR-484表達明顯增加，HIPK1 mRNA水平下降，在轉染miR-484 antagomir下調miR-484的表達后，雖然HIPK1在mRNA水平無明顯改變，但在蛋白表達水平，HIPK1的表達水平較轉染NC antagomir組明顯升高，證明細胞內miR-484可調控HIPK1的表達。雙熒光素酶報告基因檢測也發現：miR-484與HIPK1之間存在靶向結合位點，故確認HIPK1為miR-484的靶基因之一。既往研究[19-20]發現：HIPK1是蛋白激酶的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）家族成員，其高度保守，可通過多種途徑參與細胞增殖、凋亡和mRNA的轉錄等過程，在器官纖維化方面，可通過激活TGF-β信號通路的上游因子參與腎臟纖維化的發生、發展。Hong 等[21]的研究發現，miR-22是一種抗纖維化的miRNA，其過度表達可抑制其靶基因HIPK1的表達，進而抑制血管緊張素Ⅱ誘導的纖維化過程，是治療心臟纖維化的潛在靶點。可見HIPK1可作為miRNAs的靶基因參與纖維化的過程。在我們的研究中也得出miR-484通過HIPK1參與了心肌纖維化的調控。
綜上所述，細胞內miR-484參與心肌纖維化的過程是通過其調控目標基因HIPK1的表達來實現，下調miR-484可拮抗心臟成纖維細胞的纖維化反應，抑制心臟成纖維細胞介導的心肌纖維化的過程，細胞內miR-484的變化可能與心臟纖維化過程有關。下一步，我們將進行深入研究，以明確miR-484是否可成為調控的位點，制定延緩甚至逆轉心肌纖維化的新方案。
利益沖突：無。
作者貢獻：賃可負責研究構思與設計，論文修改；黃德榮負責實驗操作，數據收集、分析，論文撰寫；陳忠秀負責課題設計，資料分析，論文修改；陳紅英、陳雪梅負責實驗設計，指導實驗操作，數據收集、分析、統計。
肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一種常見的遺傳性心臟病，以心肌肥厚、發育不良和纖維化為特征[1]。其中心肌纖維化是引起惡性心律失常和不良心臟重構的重要病理基礎[2]。過度纖維化可引起微血管功能障礙，心房、心室變薄，并逐漸擴張，引起收縮、舒張功能障礙，最終導致心力衰竭甚至死亡[3-8]。微小RNAs（miRNAs）通過與目標mRNA互補序列結合從而負性調控基因表達[9]，在心臟纖維化的發生、發展過程中發揮著重要的調控作用。本研究通過對HCM患者心肌組織中差異表達的miRNAs進行分析，并在細胞水平對其調控機制進行深入研究，探討其調控HCM心肌纖維化的機制。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選擇2014年1月—2018年6月42例在四川大學華西醫院診斷并行外科手術治療的HCM患者，其中男29例、女13例，中位年齡46（15～69）歲。納入標準：（1）年齡14～70歲，性別不限；（2）明確診斷HCM，符合以下診斷標準：① 通過心臟彩色超聲、磁共振成像或心臟CT測量的左室壁厚度>15 mm；② 排除瓣膜狹窄、高血壓等病因所引起的心肌肥厚；（3）具有外科手術指征，同意進行外科手術，且術前評估無嚴重器官功能衰竭、感染等，可耐受外科手術治療；（4）同意參加研究且術后能隨訪。排除標準：同期行冠狀動脈旁路移植術等手術。根據術中切除的心肌組織分別進行組織染色。通過組織切片中纖維化染色計算膠原容積指數（collagen volume fraction，CVF）。根據纖維化程度（CVF%）計算平均值，并將患者分為兩組：低于平均值者為輕度纖維化組，高于平均值者為重度纖維組。然后在兩組分別檢測纖維化相關的4個miRNAs（miR-19b、miR-484、miR-221和miR-222）的表達差異，尋找差異表達的目標RNA。
1.2 實驗動物及材料
選取健康Sprague Dawley（SD）大鼠乳鼠（0～2 d齡）20只，重量50～60 g，雌雄不限（成都達碩實驗動物有限公司提供）。
實驗材料：DMEM基礎培養基（上海中喬新舟生物科技有限公司）；胰酶細胞消化液（0.05%胰酶）（C0202，上海碧云天生物技術有限公司）；Collagenase TypeⅡ （9001-12-1，北京亞米生物科技有限公司）；D-PBS （C0221D，上海碧云天生物技術有限公司）；PeproTech重組人轉化生長因子（tansforming growth factor-β1，TGF-β1，100-21c，派普泰克）；α-肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab7817，Abcam）；miR-484 antagomir（R10034.8，廣州銳博）；HIPK-1（YN0007，Immunoway）；細胞蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S，上海碧云天生物技術有限公司）；PVDF膜（FFP24，上海碧云天生物技術有限公司）；雙熒光素酶試劑盒（上海吉瑪生物制藥有限公司）；mRNA/lncRNA qRT-PCR Kit（R11088.2，廣州銳博）；Masson三色染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）；逆轉錄試劑盒 （Qiagen 218161）；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒 （廣州銳博）；QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit試劑盒（Qiagen，德國）；4%多聚甲醛、甲醇、乙醇（成都市科龍化工試劑廠）；Trizol RNA分離試劑（Life）；Uni-Reverse primer（廣州銳博）；miRs Forward primer（廣州銳博）；RNA 逆轉錄儀（美國 Bio-Rad 公司）；全視野細胞掃描分析儀（美國Nexcelom）； BIO-RAD CFX96 q-PCR system（美國Bio-Rad公司）。
1.3 心肌組織Masson染色與miRNAs表達檢測
（1）纖維化程度檢測：取手術切除的心肌組織（<15 min），將其剪切成厚度<5 mm、長度<1 cm長方體狀，甲醛固定，石蠟包埋，按說明書進行三色染色。經染色后膠原纖維染成藍色，肌纖維染成紅色，使用Image-pro-plus 6.0分析測量膠原纖維面積得出CVF值（%）。每個切片測量2次，誤差<3%。
（2）心肌組織中miRNAs表達量檢測：用TRIzoL法提取心肌組織中總RNA。取100 g組織磨成粉末狀，加入1 mL Trizol液，搖勻；使用酚氯仿法抽取總RNAs。測量濃度后，取0.5 μg總RNAs使用加尾法加尾，按說明書進行逆轉錄體系配制，進行逆轉錄程序；所有cDNAs放入–20℃保存。進行qtPCR反應體系制備：引物序列如下： U6：CAAGGATGACACGCAAATTCG；hsa-miR-19b：TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA；hsa-miR-221：AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC；hsa-miR-222：AGCTACATCT GGCT ACTGGGT；hsa-miR-484：ATCATGATGGGCTCCTCGGTGT。按說明書，反應體系總量為10 μL（2×QuantiFast? SYBR? Green PCR Master 5 μL+Universal primer0.2 μL+miR-specific primer 0.2 μL+cDNA 1 μL+Nuclease-free H2O 3.6 μL）。反應條件為：95℃ 5 min預變性，95℃ 10 s 變性，60℃ 30 s 退火和延伸，共計40個循環后，將溫度從60℃緩慢升至97℃，溫度每變化1℃連續進行5次采集繪制溶解曲線。Cq值定義即 PCR 擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數。表達量采用 2–??Cq 法計算。?Cq=Cq 目的基因–Cq 內參基因，??Cq=?Cq 實驗組–?Cq對照組，相對表達量=2–??Cq。
1.5 細胞實驗
1.5.1 心臟成纖維細胞的分離、培養、鑒定、活化與質粒轉染
取乳鼠左心室心肌組織，剪碎后使用酶消化法消化心肌組織，再使用差速貼壁法分離心臟成纖維細胞。用10%FBS DMEM高糖培養基，于37℃ 5%CO2孵箱中培養心臟成纖維細胞，并使其傳代，傳至3～4代。使用免疫熒光法對心臟成纖維細胞進行鑒定后，使用TGF-β1使心臟成纖維細胞活化、增殖，根據其是否使用TGF-β1活化分為TGF-β1組和對照組（Control）。通過檢測α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）表達量確定心臟成纖維化細胞的活化。將活化后的心臟成纖維細胞按說明書分別轉染NC-antagomir（TGF-β1+NC-antagomir組）和miR-484 antagomir（TGF-β1+miR-484-antagomir組）。
1.5.2 各組心臟成纖維細胞中RNAs表達量的檢測
將培養的心臟成纖維細胞加入氯仿（1 mL Trizol/0.2 mL 氯仿）充分乳化后，取上清液加入等體積異丙醇，離心后棄上清液，加入75%乙醇（1 mL Trizol/1 mL 乙醇）漂洗，干燥，加入RNase-Free water 20 μL溶解，以提取細胞中總RNAs。miRNAs第4步進行加尾、逆轉錄和PCR反應，分別計算miRNAs的表達量。
mRNAs采用莖環法進行檢測，取1 μg總RNAs配制成10 μL體系進行逆轉錄，所得cDNAs放入–20℃冰箱保存。引物設計：小鼠HIPK1上游引物5'-GACC AGCA TCAGCCAATCAT-3'，下游引物5'-GACATTAGACCTCGCCTTCAG-3'；小鼠GAPDH上游引物5'-GAGAAGGCTGGGGCTCAC-3'，下游引物5'-GTTGTC ATGGATGACCTTGGC-3'。根據試劑盒說明書配制成20 μL體系，反應條件為：95℃ 10 min預變性，95℃ 5 s 變性，60℃ 30 s 退火和72℃ 30 s 延伸，共計40個循環后，繪制溶解曲線。按上述方法4計算相對表達量。
1.5.3 細胞蛋白表達量測定
根據蛋白提取盒說明書所示，在細胞培養皿中加入RIPA裂解液，提取總蛋白；根據BCA試劑盒進行蛋白定量；加十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液煮沸10 min，取20 μg蛋白樣品上樣，10% SDS-PAGE電泳（80 V，30 min，然后100 V，60 min）；放入4℃層析柜中轉膜（電流150 mA，12%膠轉50 min，8%膠轉90 min）；5%脫脂牛奶50 mL室溫封閉1 h；加一抗HIPK1 （1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）內參、GDPDH （1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，配顯影液（說明書按A∶B∶C=1∶1∶1比例混合），與蛋白膜反應15 s后，在凝膠成像系統中曝光并采集圖像；采用Image lab軟件進行蛋白條帶分析，用HIPK1條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比較計算HIPK1的相對表達量。
1.4 生物信息學預測miR-484的靶基因
在TargetScan官網和miRBase數據庫中輸入miR-484，預測其靶基因，根據預測結果選擇可能的靶標蛋白，再根據該蛋白在器官的表達情況和既往文獻報道，最終選擇了HIPK1作為miR-484的靶基因進行進一步驗證。
1.6 雙熒光素酶報告基因檢測
將HIPK1 3'UTR區域（預測出來的與miR-484結合的位點）構建到pmiR-GLO載體的海腎熒光素酶基因的的后面，稱之為正常（WT）型；將結合位點突變后構建獲得的稱之為突變（MUT）型；以螢火蟲熒光素酶為內參。將WT型與MUT型載體質粒與miR-484 mimics 和miR-484 NC mimics質粒共轉染293T細胞。由此分為4組，即：WT+miR-484 mimics、WT+NC-mimics、MUT+miR-484 mimics、WUT+NC-mimics。培養48 h后，按雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書裂解細胞并于雙熒光素酶報告基因系統分別檢測其熒光值，并進一步計算熒光素酶活性。
1.7 統計學分析
Kolmogorov-Smirnov檢驗用于檢驗計量資料是否服從正態分布，正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）描述，組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合則采用中位數描述，組間比較采用非參數檢驗；多組間計量資料比較采用One-way ANOVA。計數資料采用率描述，組間比較采用χ2 檢驗。P≤0.05表示差異有統計學意義。使用 SPSS 22.0 進行統計分析與處理。
1.8 倫理審查
本研究已通過四川大學華西醫院倫理委員會批準（2018250）。研究遵循世界衛生組織赫爾辛基宣言擬定的道德標準，所有的入選患者在研究前均被給予研究知情同意書，本研究也對所有研究中的臨床資料堅持嚴格的保密原則。動物實驗方案經四川大學華西醫院動物實驗倫理委員會審查和批準（2018107A）。對動物的所有操作均符合美國國立衛生研究院發布的關于用于生物醫學研究的實驗動物的使用和護理指南（第85-23號，1996年修訂）。
2 結果
2.1 心肌組織中miRNAs表達量測定
根據心肌組織切片進行Masson染色，分別計算各樣本CVF值。輕度纖維化組CVF值明顯低于重度纖維化組，差異具有統計學意義（12.128%±2.104% vs. 42.936%±9.528%，t=–7.060，P<0.05）。 在輕度與重度纖維化組中分別檢檢測miR-221、miR-222、miR-19b和miR-484的表達差異，結果分別為：miR-221：0.754±0.453 vs. 8.435±13.021（P<0.05）；miR-222：1.380±2.094 vs. 5.361±5.046（P<0.05）； miR-19b：8.810±9.060 vs. 2.861±2.262（P<0.05）；miR-484：1.407±1.894 vs. 4.156±4.378（P<0.05）。可見，miR-221、miR-222和miR-484在重度纖維化組的表達量明顯高于輕度纖維化組，而miR-19b則明顯低于輕度纖維化組，差異均具有統計學意義；見圖1。
圖1
輕、重度纖維化組的心肌組織中miRNAs表達情況
*：
2.2 心臟成纖維細胞活化前、后miRNAs表達量
心臟成纖維細胞受TGF-β1刺激增殖分化為肌成纖維細胞，與活化前比較，miR-484、miR-221和miR-222表達量分別為：miR-484：5.375±1.032 vs. 1.060±0.068（P<0.05），miR-221：2.638±0.531 vs. 1.096±0.124（P<0.05）， miR-222：2.036±0.349 vs. 0.987±0.047（P<0.05），可見心臟成纖維細胞活化后其表達量均明顯增加，而miR-19b表達量在活化前、后無明顯變化（0.988±0.034 vs. 1.061±0.197，P>0.05）；見圖2。因miR-484在活化后表達量大于活化前的4倍以上，故選擇miR-484進行后續研究。
圖2
miRNAs在心臟成纖維細胞活化前、后的表達差異
Control：對照組；TGF-β1：轉化生長因子-β1；CF：心臟成纖維細胞；*：
2.3 調控miRNA-484表達對心臟成纖維細胞表型變化的影響
心臟成纖維細胞受TGF-β1刺激活化后，分別轉染miR-484 antagomir或NC antagomir。通過檢測miR-484的表達發現，轉染NC antagomir與轉染miR-484 antagomir的心臟成纖維細胞中miR-484的表達量分別為 5.466±0.317和0.301±0.013（P<0.05），可見miR-484表達水平較明顯下降，證明轉染成功。
我們進一步檢測了心臟成纖維細胞中的促纖維化相關蛋白在各組中的表達情況，結果發現：轉染NC antagomir組與miR-484 antagomir組中，α-SMA蛋白表達水平分別為2.964±0.022和1.654±0.021（P<0.05）；CollagenⅠ在兩組中的蛋白表達量分別為2.725±0.077和1.277±0.721（P<0.05）；見圖3。
圖3
調控miRNA-484表達后，纖維化相關蛋白在心臟成纖維細胞中的表達情況
a：免疫組化條帶圖；b：促纖維化蛋白表達量；α-SMA：α-肌動蛋白；CollagenⅠ：Ⅰ型膠原蛋白；*：
2.4 調控miRNA-484表達后靶基因的表達變化
心臟成纖維細胞經TGF-β1刺激轉化為肌成纖維細胞。再分別轉染miR-484 antagomir和 NC antagomir，并分別在mRNA和蛋白水平測定了HIPK1 的表達情況（使用GAPDH為內參基因）。結果如下：心臟成纖維細胞在TGF-β1刺激活化后，miR-484表達增加，HIPK1的mRNA表達量在活化前與活化后的表達量分別為1.001±0.019 和0.501±0.232（P<0.05）；而轉染NC antagomir和miR-484 antagomir后，HIPK1的mRNA表達量在兩組間的表達水平分別為0.626±0.077和0.595±0.095（ P>0.05）；在蛋白水平，HIPK1在TGF-β1+miR-484 antagomir 組與TGF-β1+NC antagomir組的表達量分別為0.326±0.015和0.972±0.013（P<0.05）；見圖4。
圖4
調控miR-484表達后靶基因HIPK1的蛋白表達變化
a：免疫組化條帶圖；b：HIPK1 表達量；TGF-β1：轉化生長因子-β1；C：對照組；T：轉化生長因子-β1組；T+N：TGF-β1+NC antagomir組；T+M：TGF-β1+miR-484 antagomir組；HIPK-1：同源結構域相互蛋白激酶-1；**：
2.5 雙熒光素酶報告基因檢測結果
預測結合位點，并定義MUT組和WT組。結合位點突變者為MUT組，結合位點未突變者為WT組。分別與NC mimics、miR-484 mimics共轉染后，再分別比較它們的熒光素酶活性，結果如下：MUT組：轉染NC mimics與轉染miR-484 mimics的熒光素酶活性分別為1.012±0.021和0.990±0.002（P>0.05）；而在WT組，它們的熒光素酶活性分別為0.995±0.050和0.662±0.008（P<0.05）。可見將帶有結合位點的質粒與miR-484 mimics質粒共轉染后熒光素酶活性明顯下降，這表明HIPK1與miR-484之間存在靶向結合關系。
3 討論
心肌纖維化是心臟針對各種刺激（生理或病理）所作出的病理反應，是引起心功能衰竭的重要病理生理機制。HCM尤其是合并流出道梗阻者，長時間的壓力超負荷會導致嚴重的間質和血管周圍纖維化[10-12]，嚴重破壞心臟結構，使心肌興奮-收縮耦合機制嚴重受損，收縮和舒張功能進行性下降，出現惡性心律失常，心力衰竭甚至死亡的嚴重后果[13-14]。
心臟成纖維細胞是纖維化主要的效應細胞，它在各種病因刺激下轉分化為具有分泌和收縮功能的肌成纖維細胞，是驅動纖維化的關鍵因素[15]。常駐心臟成纖維細胞是肌成纖維細胞的主要來源[16]。在各種病理因素作用下，心臟成纖維細胞被激活并轉分化為具有廣泛內質網的肌成纖維細胞，可合成和分泌收縮蛋白如α-SMA，是細胞活化成熟的表型特征[17]，故α-SMA有助于識別組織中的肌成纖維細胞。miRNAs是研究最為普遍的非編碼RNA，它可以調節多種細胞類型。現已證實，多種miRNAs參與了心臟成纖維細胞的活化過程。既往文獻[18]報道，miR-484已被證實參與了腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移等過程，同時，miR-484已被報道參與了肝臟纖維化過程，而其在心肌纖維化中的作用尚未闡明。我們在肥厚型心肌患者心肌組織樣本中發現：在重度纖維化組中，miR-484的表達量明顯高于輕度纖維化組，證明miR-484可能參與HCM患者心肌纖維化的過程。進一步的細胞實驗顯示，心臟成纖維細胞受到TGF-β1刺激后，α-SMA蛋白表達量明顯增加，證明成纖維細胞得到活化。并在其活化前、后分別測量了miR-484的表達，發現miR-484的表達量也明顯上調，CollagenⅠ的表達也隨之增加。而使用miR-484 antagomir下調miR-484的表達后，心臟成纖維細胞中α-SMA和CollagenⅠ的表達量也隨之下降，證明心臟成纖維細胞的活化受到了抑制。由此可得出，細胞內miR-484的變化可能參與心臟成纖維細胞活化過程，調控miR-484 的表達可抑制心臟成纖維細胞介導的心肌纖維化過程，從而緩解纖維化程度。可見細胞內miR-484可成為心肌纖維化的調控靶點，為心肌纖維化治療提供策略。
另外，在我們的研究中，首次發現HIPK1為miR-484的直接靶標。體外實驗發現：在心臟成纖維細胞增殖、分化過程中，miR-484表達明顯增加，HIPK1 mRNA水平下降，在轉染miR-484 antagomir下調miR-484的表達后，雖然HIPK1在mRNA水平無明顯改變，但在蛋白表達水平，HIPK1的表達水平較轉染NC antagomir組明顯升高，證明細胞內miR-484可調控HIPK1的表達。雙熒光素酶報告基因檢測也發現：miR-484與HIPK1之間存在靶向結合位點，故確認HIPK1為miR-484的靶基因之一。既往研究[19-20]發現：HIPK1是蛋白激酶的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）家族成員，其高度保守，可通過多種途徑參與細胞增殖、凋亡和mRNA的轉錄等過程，在器官纖維化方面，可通過激活TGF-β信號通路的上游因子參與腎臟纖維化的發生、發展。Hong 等[21]的研究發現，miR-22是一種抗纖維化的miRNA，其過度表達可抑制其靶基因HIPK1的表達，進而抑制血管緊張素Ⅱ誘導的纖維化過程，是治療心臟纖維化的潛在靶點。可見HIPK1可作為miRNAs的靶基因參與纖維化的過程。在我們的研究中也得出miR-484通過HIPK1參與了心肌纖維化的調控。
綜上所述，細胞內miR-484參與心肌纖維化的過程是通過其調控目標基因HIPK1的表達來實現，下調miR-484可拮抗心臟成纖維細胞的纖維化反應，抑制心臟成纖維細胞介導的心肌纖維化的過程，細胞內miR-484的變化可能與心臟纖維化過程有關。下一步，我們將進行深入研究，以明確miR-484是否可成為調控的位點，制定延緩甚至逆轉心肌纖維化的新方案。
利益沖突：無。
作者貢獻：賃可負責研究構思與設計，論文修改；黃德榮負責實驗操作，數據收集、分析，論文撰寫；陳忠秀負責課題設計，資料分析，論文修改；陳紅英、陳雪梅負責實驗設計，指導實驗操作，數據收集、分析、統計。
