引用本文： 鄭見寶, 賀賽, 孫學軍, 任燕飛, 陳南征, 張仕運, 劉棟, 張立, 王暉. 雙靶向調控CDX2基因慢病毒表達載體的構建及鑒定. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(4): 414-419. doi: 10.7507/1007-9424.20140102 復制
結直腸癌是世界范圍內的高發腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中排第3位[1-2]。在我國，結直腸癌為發病率第3高的惡性腫瘤，死亡率居第4位[3]。一直以來，以手術為主的綜合治療是結直腸癌治療的首要措施，近年來，隨著基因治療的發展，為結直腸癌的治療增添了新的方法[4-6]，改善了預后，但與結直腸癌的高發病率和死亡率不相符的是其基因治療發展的相對緩慢。本研究利用5個拷貝的缺氧微環境條件下產生的血管內皮生長因子基因5′-端的缺氧反應元件（hypoxia responsive element，HRE）和人端粒酶啟動子（hTERT promoter，hTERTp）基因重組，共同構成缺氧可誘導的針對結直腸癌特異性的基因轉錄調控元件，用該元件調控結直腸癌特異性抑癌基因-尾型同源盒基因2（caudal-type homeo-box gene 2，CDX2）的表達，構建成能將CDX2雙靶向性表達于結直腸癌細胞的慢病毒表達載體，為進一步的體內外實驗提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
人結腸癌LoVo細胞及pLEGFP-5HRE-CEAp和GV230-CDX2-EGFP表達載體由西安交通大學醫學院第一附屬醫院轉化中心實驗室凍存及構建；人結腸癌標本3份取自西安交通大學醫學院第一附屬醫院臨床標本（經病理學檢查確診）；慢轉錄病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG（生博生物科技有限公司），Taq DNA聚合酶（Takara公司），HindⅢ、PstⅠ、MluⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ內切酶（NEB公司），質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕，胎牛血清（Hyclone公司），DMEM（Dulbecco’s Modified EagleMedium）為Gibco公司產品；LipofectamineTM 2000脂質體轉染試劑盒（Invit-rogen公司），倒置相差熒光顯微鏡（德國Leica公司），DH5α菌株為本實驗室儲藏。引物合成和測序由上海吉凱基因化學有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 hTERTp的獲取
對臨床收集的結腸癌標本，用基因組DNA提取試劑盒提取組織基因組DNA，根據GenBank上公布的hTERTp序列（NT 006576.16）設計引物并由上海生博醫學生物工程科技有限公司合成，引物序列如下：hTERTp 5′為GTTTATCGATAAGCTTCACAGACGCCCAGGAC-CGCGCTTC（酶切位點：HindⅢ）；hTERTp 3′為GA-AGCTTGAGCTGCAGCCACGTGCGCCCACGTGC-GCCCAC（酶切位點：PstⅠ），循環條件為98℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海生博醫學生物工程科技有限公司測序。
1.2.2 pLEGFP-5HRE-hTERTp的構建及鑒定
以質粒pLEGFP-5HRE-CEAp為模板（兩端含HindⅢ和PstⅠ酶切位點)，應用HindⅢ和PstⅠ限制性內切酶酶切CEAp使其線性化，將反應混合物置于37℃、1 h，同時使用HindⅢ和PstⅠ限制性內切酶酶切hTERTp片段連接入線性化pLEGFP-5HRE質粒載體（16℃，過夜），轉化DH5α感受態細菌，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，篩選轉化的菌落，挑取陽性克隆行PCR擴增反應，同時設立陰性對照和陽性對照，模板分別為等體積的高壓滅菌雙蒸水、空載體自連對照轉化子和陽性對照轉化子（GAPDH）。設計轉化子鑒定引物hTERTp P1和hTERTp P2如下：hTERTp P1為GTAGACATAATAGCAACAGACATAC；hTERTp P2為CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。循環條件為94℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。
1.2.3 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的構建及鑒定
根據已構建的pLEGFP-5HRE-hTERTp載體序列設計引物，用PCR方法擴增5HRE+hTERTp片段，引物序列：5HT 5′（酶切位點：MluⅠ）為TCCAGTTTATCGATACGCGTAGATCTATTATGCTAG-TCCAC，5HT 3′（酶切位點：XhoⅠ）為GAAGCTT-GAGCTCGAGCCACGTGCGCCCACGTGCGCCCAC；循環條件為98℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。以慢病毒質粒pLVX-EGFP-3FLAG為模板，應用MluⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切CMV啟動子使其線性化，將反應混合物置37℃、1 h，同時用MluⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切5HRE+hTERTp片段連接入線性化pLVX-EGFP-3FLAG載體（16℃，過夜），轉化DH5α感受態細菌，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，篩選轉化的菌落。挑取陽性克隆行PCR擴增；同時設陰性對照和陽性對照，模板分別為等體積的高壓滅菌雙蒸水、空載體自連對照轉化子和陽性對照轉化子（GAPDH）。設計轉化子鑒定引物5HRE P1及5HREP2（位于hTERTp下游）如下：5HRE P1為GTAGACATAATAGCAA-CAGACATAC；5HRE P2為CGTCGCCGTCCAGC-TCGACCAG。循環條件94℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。
1.2.4 pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG的構建及鑒定
根據筆者所在課題組前期已完成構建的GV230-CDX2-EGFP載體序列設計引物，用PCR方法擴增CDX2片段，引物序列如下：CDX2 5′（酶切位點：EcoRⅠ）為CGAGCTCAAGCTTCGAATTC-GCCACCATGTACGTGAGCTACCTCCTGG；CDX2 3′（酶切位點：BamHⅠ）TCATCCTTGTAGTCGGA-TCCCTGGGTGACGGTGGGGTTTA；循環條件為94℃10 s、60℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。以慢病毒質粒pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG為模板，應用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切EGFP使其線性化，將反應混合物置于37℃、1 h；同時使用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切CDX2片段連接入線性化pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體（16℃，過夜），轉化DH5α感受態細菌，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，篩選轉化的菌落。挑取陽性克隆行PCR擴增反應；同時設立陰性對照和陽性對照，模板分別為等體積的高壓滅菌雙蒸水、空載體自連對照轉化子和陽性對照轉化子（GAPDH）。設計轉化子鑒定引物CDX2 P1及CDX2 P2（位于CDX2基因序列中）如下：CDX2 P1為CGGAACCTGTGCGAGTGGAT；CDX2 P2為AG-CGTAAAAGGAGCAACATAG；循環條件為94℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。
1.2.5 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的啟動活性鑒定
取對數生長期的LoVo細胞接種于24孔板，加入不含抗生素的DMEM+10%血清培養基，過夜培養，至基本達到90%融合；提取pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG陽性克隆菌的質粒，轉染LoVo細胞，轉染24 h后分別在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞。
2 結果
2.1 hTERTp片段PCR產物電泳結果
結果見圖 1。
圖1
示hTERTp PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果。M：DL2000 DNA分子質量標記；1：PCR產物
Figure1.
Electrophoretogram of identification for hTERTp PCR product. M:DL2000 DNA marker; 1:PCR product
由圖 1可見，以人結腸癌標本DNA為模板，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物大小為327 bp，測序結果表明與Genbank中人hTERTp序列（NT 006576.16）DNA一致。
2.2 pLEGFP-5HRE-hTERTp的構建及鑒定結果
應用HindⅢ和PstⅠ限制性內切酶酶切pLEGFP-5HRE-CEAp質粒及hTERTp片段，使hTERTp片段連接入線性化pLEGFP-5HRE質粒載體，用引物對隨機挑選的8個轉化子進行PCR鑒定。經電泳檢測顯示，陽性轉化子均可擴增出大小約505 bp的條帶（圖 2），表明均插入了hTERTp片段。
圖2
示pLEGFP-5HRE-hTERTp陽性轉化子菌落hTERTp PCR鑒定結果。1：DL2000 DNA分子質量標記；2～9：轉化子菌落PCR產物；目標序列大小：505 bp ??圖 3示載體pLVX-EGFP-3FLAG雙酶切電泳結果。M：DNA分子質量標記；1：PCR產物??圖 4示pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG陽性轉化子菌落5HRE PCR鑒定結果。1：ddH2O陰性對照；2：載體自連陰性對照；3：GAPDH轉化子陽性對照；4：DL100 DNA分子質量標記；5～12：轉化子菌落PCR產物??圖 5示CDX2片段PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果。M：DNA分子質量標記；1：PCR產物??圖 6示載體pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG雙酶切產物電泳結果。M：DNA分子質量標記；1：PCR產物??圖 7示pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG陽性轉化子菌落CDX2 PCR鑒定結果。1：ddH2O陰性對照；2：載體自連陰性對照；3：GAPDH轉化子陽性對照；4：DL100 Plus DNA marker；5～12：轉化子菌落PCR產物；目標序列大小：620 bp
Figure2.
Electrophoretogram of identification for hTERTp PCR product from pLEGFP-5HRE-hTERTp. 1: DL2000 DNA marker; 2-9: PCR products; Target sequence size: 505 bp ??Figure 3 Electrophoretogram of identification for pLVX-EGFP-3FLAG double digest product. M: DNA marker; 1: PCR product ??Figure 4 Electrophoretogram of identification for pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG PCR product. 1: ddH2O negative control; 2: Self-connected vector negative control; 3: GAPDH positive control; 4: DL100 DNA marker; 5-12: PCR products ??Figure 5 Electrophoretogram of identification for CDX2 PCR product. M: DNA marker; 1: PCR product ??Figure 6 Electrophoretogram of identification for pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG double digest product. M: DNA marker; 1: PCR product ??Figure 7 Electrophoretogram of identification for CDX2 PCR product from pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG. 1: ddH2O negative control; 2: Self-connected vector negative control; 3: GAPDH positive control; 4: DL100 Plus DNA marker; 5-12: PCR products; Target sequence size: 620 bp
2.3 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的構建及鑒定結果
根據已構建的pLEGFP-5HRE-hTERTp載體序列，用PCR方法擴增5HRE+hTERTp片段，再以慢病毒質粒pLVX-EGFP-3FLAG為模板，應用MluⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切CMV啟動子（630 bp）使其線性化（圖 3），同時將5HRE+hTERTp片段連接入線性化pLVX-EGFP-3FLAG載體，用引物對隨機挑選的8個轉化子進行PCR鑒定。經過電泳檢測顯示，陽性轉化子均可擴增出大小約737 bp條帶（圖 4），表明8個轉化子均插入了5HRE-hTERTp片段。
2.4 pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG的構建及鑒定結果
根據筆者所在課題組前期已完成構建的GV230-CDX2-EGFP載體序列設計引物，用PCR方法擴增CDX2片段（圖 5），序列大小為985 bp，其測序結果與人CDX2cDNA（NM_001265）序列一致。以慢病毒質粒pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG為模板，應用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切EGFP使其線性化（圖 6），CDX2片段連接入線性化pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體，用引物對隨機挑選的8個轉化子進行PCR鑒定。經電泳檢測顯示，陽性轉化子均可擴增出大小約620 bp條帶（圖 7），表明均插入了CDX2片段。
2.5 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的啟動活性鑒定結果
將pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體瞬時轉染體外培養的人結腸癌LoVo細胞，見有綠色熒光表達，說明hTERT啟動子存在啟動活性（圖 8）。
圖8
示pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG轉染LoVo細胞中綠色熒光蛋白表達情況（×200）。8A及8B所示為轉染pLVX-5HRE-hTERTpEGFP-3FLAG的LoVo細胞；8C及8D所示為空白LoVo細胞對照；8A及8C為熒光顯微鏡下結果；8B及8D為普通光鏡下結果
Figure8.
Microscopic findings in each group of LoVo cells transfected by pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG (×200). 8A and 8B: LoVo cells transfected by pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG; 8C and 8D: LoVo cells; 8A and 8C: Observed under fluorescence microscope; 8B and 8D: Observed under common microscope
3 討論
結直腸癌的發病率和死亡率在全世界范圍內均排在前列，但其主要的治療方式仍以傳統的外科治療和放、化療為主。在腫瘤基因治療高速發展的今天，結直腸癌基因治療的發展卻相對緩慢[7]。究其原因，除了對結直腸癌發生、發展的分子機理認識不夠之外，載體的靶向性及表達效率問題是較大的制約因素。
HRE作為細胞缺氧狀態下，缺氧誘導因子1（HIF-1）在目的基因啟動子中的重要結合位點，不受在啟動子序列中具體位置的限制，也無基因特異性，即各目的基因中的HRE具有高度同源性，是腫瘤基因治療中一個十分理想的增強子[8-10]。其對HIF-1結合的特異性，可促進目的基因在缺氧的腫瘤細胞中特異性表達，作為腫瘤基因治療的靶向選擇之一；而它的高度同源性，使它可用作各種基因的增強子。HRE在腫瘤基因治療中已有很多應用。Marignol等[11]構建了由5個或8個拷貝的HRE驅動的胞嘧啶脫氫酶載體，成功將其導入前列腺癌細胞，克服了后者對5-FU的耐藥性。Ruan等[12]分別構建了包含3、6及9個HRE的3種LacZ表達載體，并導入腦腫瘤細胞中，發現在缺氧狀態下LacZ活性增加的倍數與HRE的數量有一定關系。在實體瘤的基因治療中，可以利用腫瘤的缺氧微環境，使用HRE作為靶點，即腫瘤細胞中，由于存在缺氧微環境，HIF-1的表達升高，并與HRE結合從而激活其下游基因的轉錄；而在正常細胞中，足氧狀態使HIF-1處在無或低的水平，無法結合HRE發揮轉錄激活功能。
hTERTp是腫瘤細胞中特異性活化的啟動子，包括一段富含CG的CpG島，其在腫瘤細胞中被特異性激活的機理已有較多研究，在腫瘤的基因治療中，可作為有效的靶向選擇工具，為腫瘤的靶向分子治療提供了新途徑[13]。我們可以利用分子生物學技術在hTERT啟動子后插入能抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡和分化的基因片段，再通過某種技術將重組質粒導入患者的細胞內，即可達到對腫瘤的靶向治療，而不會對正常細胞產生作用[14-16]。國內外已有學者[17-20]通過轉染hTERT啟動子調控的病毒載體來抑制腫瘤細胞的生長、轉移，并進行靶向治療，取得了一定進展。
尾型同源盒基因2（CDX2）位于人染色體13q12-13，全長22～23 kb，是腸特異性轉錄因子的一種，其在胚胎發育過程的早期就出現，決定了器官發生和腸上皮分化。在成人，CDX2僅在腸道上皮中特異性表達，在腸上皮細胞分化中起著重要的作用。CDX2的表達缺失幾乎在所有結直腸腺癌中都可發現[21]。筆者所在課題組的前期研究，通過瞬時過表達CDX2觀察CDX2對結腸癌細胞生物學性狀的影響，發現過表達CDX2對結腸癌LoVo細胞株增殖、凋亡及周期無明顯影響，但能夠明顯減弱LoVo細胞的侵襲力，從而對結直腸癌浸潤轉移起抑制作用[22-23]；同時構建模擬結腸癌細胞株缺氧微環境，觀察其對結腸癌細胞CDX2基因表達的影響，結果發現缺氧環境能夠下調CDX2的表達，從而促進結腸癌的惡性進展[24-25]。
鑒于以上，筆者擬采用誘導腫瘤細胞分化的方法，構建向結直腸癌細胞中導入CDX2基因的載體。在靶向性及安全性方面，利用腫瘤細胞缺氧微環境和端粒酶高活性的特性，應用人VEGF基因5’-端HRE和hTERT基因重組，共同構成缺氧可誘導的腫瘤特異性的基因轉錄調控元件，用該元件調控CDX2的表達，構建成能將CDX2靶向性表達于結直腸惡性腫瘤的雙靶向調控重組慢病毒載體，該基因治療載體具有特異性高和靶向性強的雙重特點。從理論上分析，上游的調控元件不僅可以使目的基因CDX2在缺氧微環境中的表達效果明顯增強，而且能夠使其僅在腫瘤組織中表達，避免了對正常細胞的作用，我們將在下一步對該載體的特異性和靶向性進行鑒定，雙靶向調控元件調控下游基因的表達，可能為腫瘤的基因治療提供一條有效途徑。同時，由于本身缺氧環境能夠下調CDX2的表達，所以該載體的靶向性表達不僅僅是單純過表達，同時是逆向表達，更能突出誘導分化的生物學作用。
本實驗成功構建了pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG慢病毒治療載體，并通過使用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG瞬時轉染體外培養的人結腸癌LoVo細胞，驗證了hTERTp能夠調控的下游綠色熒光蛋白EGFP的表達，說明構建的hTERTp本身具有啟動效率，而且能夠啟動下游基因的表達，為我們進一步實驗提供了重要保障。
結直腸癌是世界范圍內的高發腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中排第3位[1-2]。在我國，結直腸癌為發病率第3高的惡性腫瘤，死亡率居第4位[3]。一直以來，以手術為主的綜合治療是結直腸癌治療的首要措施，近年來，隨著基因治療的發展，為結直腸癌的治療增添了新的方法[4-6]，改善了預后，但與結直腸癌的高發病率和死亡率不相符的是其基因治療發展的相對緩慢。本研究利用5個拷貝的缺氧微環境條件下產生的血管內皮生長因子基因5′-端的缺氧反應元件（hypoxia responsive element，HRE）和人端粒酶啟動子（hTERT promoter，hTERTp）基因重組，共同構成缺氧可誘導的針對結直腸癌特異性的基因轉錄調控元件，用該元件調控結直腸癌特異性抑癌基因-尾型同源盒基因2（caudal-type homeo-box gene 2，CDX2）的表達，構建成能將CDX2雙靶向性表達于結直腸癌細胞的慢病毒表達載體，為進一步的體內外實驗提供實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
人結腸癌LoVo細胞及pLEGFP-5HRE-CEAp和GV230-CDX2-EGFP表達載體由西安交通大學醫學院第一附屬醫院轉化中心實驗室凍存及構建；人結腸癌標本3份取自西安交通大學醫學院第一附屬醫院臨床標本（經病理學檢查確診）；慢轉錄病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG（生博生物科技有限公司），Taq DNA聚合酶（Takara公司），HindⅢ、PstⅠ、MluⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠ內切酶（NEB公司），質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕，胎牛血清（Hyclone公司），DMEM（Dulbecco’s Modified EagleMedium）為Gibco公司產品；LipofectamineTM 2000脂質體轉染試劑盒（Invit-rogen公司），倒置相差熒光顯微鏡（德國Leica公司），DH5α菌株為本實驗室儲藏。引物合成和測序由上海吉凱基因化學有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 hTERTp的獲取
對臨床收集的結腸癌標本，用基因組DNA提取試劑盒提取組織基因組DNA，根據GenBank上公布的hTERTp序列（NT 006576.16）設計引物并由上海生博醫學生物工程科技有限公司合成，引物序列如下：hTERTp 5′為GTTTATCGATAAGCTTCACAGACGCCCAGGAC-CGCGCTTC（酶切位點：HindⅢ）；hTERTp 3′為GA-AGCTTGAGCTGCAGCCACGTGCGCCCACGTGC-GCCCAC（酶切位點：PstⅠ），循環條件為98℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海生博醫學生物工程科技有限公司測序。
1.2.2 pLEGFP-5HRE-hTERTp的構建及鑒定
以質粒pLEGFP-5HRE-CEAp為模板（兩端含HindⅢ和PstⅠ酶切位點)，應用HindⅢ和PstⅠ限制性內切酶酶切CEAp使其線性化，將反應混合物置于37℃、1 h，同時使用HindⅢ和PstⅠ限制性內切酶酶切hTERTp片段連接入線性化pLEGFP-5HRE質粒載體（16℃，過夜），轉化DH5α感受態細菌，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，篩選轉化的菌落，挑取陽性克隆行PCR擴增反應，同時設立陰性對照和陽性對照，模板分別為等體積的高壓滅菌雙蒸水、空載體自連對照轉化子和陽性對照轉化子（GAPDH）。設計轉化子鑒定引物hTERTp P1和hTERTp P2如下：hTERTp P1為GTAGACATAATAGCAACAGACATAC；hTERTp P2為CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。循環條件為94℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。
1.2.3 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的構建及鑒定
根據已構建的pLEGFP-5HRE-hTERTp載體序列設計引物，用PCR方法擴增5HRE+hTERTp片段，引物序列：5HT 5′（酶切位點：MluⅠ）為TCCAGTTTATCGATACGCGTAGATCTATTATGCTAG-TCCAC，5HT 3′（酶切位點：XhoⅠ）為GAAGCTT-GAGCTCGAGCCACGTGCGCCCACGTGCGCCCAC；循環條件為98℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。以慢病毒質粒pLVX-EGFP-3FLAG為模板，應用MluⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切CMV啟動子使其線性化，將反應混合物置37℃、1 h，同時用MluⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切5HRE+hTERTp片段連接入線性化pLVX-EGFP-3FLAG載體（16℃，過夜），轉化DH5α感受態細菌，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，篩選轉化的菌落。挑取陽性克隆行PCR擴增；同時設陰性對照和陽性對照，模板分別為等體積的高壓滅菌雙蒸水、空載體自連對照轉化子和陽性對照轉化子（GAPDH）。設計轉化子鑒定引物5HRE P1及5HREP2（位于hTERTp下游）如下：5HRE P1為GTAGACATAATAGCAA-CAGACATAC；5HRE P2為CGTCGCCGTCCAGC-TCGACCAG。循環條件94℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。
1.2.4 pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG的構建及鑒定
根據筆者所在課題組前期已完成構建的GV230-CDX2-EGFP載體序列設計引物，用PCR方法擴增CDX2片段，引物序列如下：CDX2 5′（酶切位點：EcoRⅠ）為CGAGCTCAAGCTTCGAATTC-GCCACCATGTACGTGAGCTACCTCCTGG；CDX2 3′（酶切位點：BamHⅠ）TCATCCTTGTAGTCGGA-TCCCTGGGTGACGGTGGGGTTTA；循環條件為94℃10 s、60℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。以慢病毒質粒pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG為模板，應用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切EGFP使其線性化，將反應混合物置于37℃、1 h；同時使用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切CDX2片段連接入線性化pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體（16℃，過夜），轉化DH5α感受態細菌，在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上培養過夜，篩選轉化的菌落。挑取陽性克隆行PCR擴增反應；同時設立陰性對照和陽性對照，模板分別為等體積的高壓滅菌雙蒸水、空載體自連對照轉化子和陽性對照轉化子（GAPDH）。設計轉化子鑒定引物CDX2 P1及CDX2 P2（位于CDX2基因序列中）如下：CDX2 P1為CGGAACCTGTGCGAGTGGAT；CDX2 P2為AG-CGTAAAAGGAGCAACATAG；循環條件為94℃10 s、55℃15 s、72℃30 s，共30個循環。加樣至1%的瓊脂糖凝膠電泳。取陽性克隆送上海吉凱基因化學有限公司測序。
1.2.5 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的啟動活性鑒定
取對數生長期的LoVo細胞接種于24孔板，加入不含抗生素的DMEM+10%血清培養基，過夜培養，至基本達到90%融合；提取pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG陽性克隆菌的質粒，轉染LoVo細胞，轉染24 h后分別在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞。
2 結果
2.1 hTERTp片段PCR產物電泳結果
結果見圖 1。
圖1
示hTERTp PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果。M：DL2000 DNA分子質量標記；1：PCR產物
Figure1.
Electrophoretogram of identification for hTERTp PCR product. M:DL2000 DNA marker; 1:PCR product
由圖 1可見，以人結腸癌標本DNA為模板，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物大小為327 bp，測序結果表明與Genbank中人hTERTp序列（NT 006576.16）DNA一致。
2.2 pLEGFP-5HRE-hTERTp的構建及鑒定結果
應用HindⅢ和PstⅠ限制性內切酶酶切pLEGFP-5HRE-CEAp質粒及hTERTp片段，使hTERTp片段連接入線性化pLEGFP-5HRE質粒載體，用引物對隨機挑選的8個轉化子進行PCR鑒定。經電泳檢測顯示，陽性轉化子均可擴增出大小約505 bp的條帶（圖 2），表明均插入了hTERTp片段。
圖2
示pLEGFP-5HRE-hTERTp陽性轉化子菌落hTERTp PCR鑒定結果。1：DL2000 DNA分子質量標記；2～9：轉化子菌落PCR產物；目標序列大小：505 bp ??圖 3示載體pLVX-EGFP-3FLAG雙酶切電泳結果。M：DNA分子質量標記；1：PCR產物??圖 4示pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG陽性轉化子菌落5HRE PCR鑒定結果。1：ddH2O陰性對照；2：載體自連陰性對照；3：GAPDH轉化子陽性對照；4：DL100 DNA分子質量標記；5～12：轉化子菌落PCR產物??圖 5示CDX2片段PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果。M：DNA分子質量標記；1：PCR產物??圖 6示載體pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG雙酶切產物電泳結果。M：DNA分子質量標記；1：PCR產物??圖 7示pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG陽性轉化子菌落CDX2 PCR鑒定結果。1：ddH2O陰性對照；2：載體自連陰性對照；3：GAPDH轉化子陽性對照；4：DL100 Plus DNA marker；5～12：轉化子菌落PCR產物；目標序列大小：620 bp
Figure2.
Electrophoretogram of identification for hTERTp PCR product from pLEGFP-5HRE-hTERTp. 1: DL2000 DNA marker; 2-9: PCR products; Target sequence size: 505 bp ??Figure 3 Electrophoretogram of identification for pLVX-EGFP-3FLAG double digest product. M: DNA marker; 1: PCR product ??Figure 4 Electrophoretogram of identification for pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG PCR product. 1: ddH2O negative control; 2: Self-connected vector negative control; 3: GAPDH positive control; 4: DL100 DNA marker; 5-12: PCR products ??Figure 5 Electrophoretogram of identification for CDX2 PCR product. M: DNA marker; 1: PCR product ??Figure 6 Electrophoretogram of identification for pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG double digest product. M: DNA marker; 1: PCR product ??Figure 7 Electrophoretogram of identification for CDX2 PCR product from pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG. 1: ddH2O negative control; 2: Self-connected vector negative control; 3: GAPDH positive control; 4: DL100 Plus DNA marker; 5-12: PCR products; Target sequence size: 620 bp
2.3 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的構建及鑒定結果
根據已構建的pLEGFP-5HRE-hTERTp載體序列，用PCR方法擴增5HRE+hTERTp片段，再以慢病毒質粒pLVX-EGFP-3FLAG為模板，應用MluⅠ和XhoⅠ限制性內切酶酶切CMV啟動子（630 bp）使其線性化（圖 3），同時將5HRE+hTERTp片段連接入線性化pLVX-EGFP-3FLAG載體，用引物對隨機挑選的8個轉化子進行PCR鑒定。經過電泳檢測顯示，陽性轉化子均可擴增出大小約737 bp條帶（圖 4），表明8個轉化子均插入了5HRE-hTERTp片段。
2.4 pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG的構建及鑒定結果
根據筆者所在課題組前期已完成構建的GV230-CDX2-EGFP載體序列設計引物，用PCR方法擴增CDX2片段（圖 5），序列大小為985 bp，其測序結果與人CDX2cDNA（NM_001265）序列一致。以慢病毒質粒pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG為模板，應用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內切酶酶切EGFP使其線性化（圖 6），CDX2片段連接入線性化pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體，用引物對隨機挑選的8個轉化子進行PCR鑒定。經電泳檢測顯示，陽性轉化子均可擴增出大小約620 bp條帶（圖 7），表明均插入了CDX2片段。
2.5 pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG的啟動活性鑒定結果
將pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG載體瞬時轉染體外培養的人結腸癌LoVo細胞，見有綠色熒光表達，說明hTERT啟動子存在啟動活性（圖 8）。
圖8
示pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG轉染LoVo細胞中綠色熒光蛋白表達情況（×200）。8A及8B所示為轉染pLVX-5HRE-hTERTpEGFP-3FLAG的LoVo細胞；8C及8D所示為空白LoVo細胞對照；8A及8C為熒光顯微鏡下結果；8B及8D為普通光鏡下結果
Figure8.
Microscopic findings in each group of LoVo cells transfected by pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG (×200). 8A and 8B: LoVo cells transfected by pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG; 8C and 8D: LoVo cells; 8A and 8C: Observed under fluorescence microscope; 8B and 8D: Observed under common microscope
3 討論
結直腸癌的發病率和死亡率在全世界范圍內均排在前列，但其主要的治療方式仍以傳統的外科治療和放、化療為主。在腫瘤基因治療高速發展的今天，結直腸癌基因治療的發展卻相對緩慢[7]。究其原因，除了對結直腸癌發生、發展的分子機理認識不夠之外，載體的靶向性及表達效率問題是較大的制約因素。
HRE作為細胞缺氧狀態下，缺氧誘導因子1（HIF-1）在目的基因啟動子中的重要結合位點，不受在啟動子序列中具體位置的限制，也無基因特異性，即各目的基因中的HRE具有高度同源性，是腫瘤基因治療中一個十分理想的增強子[8-10]。其對HIF-1結合的特異性，可促進目的基因在缺氧的腫瘤細胞中特異性表達，作為腫瘤基因治療的靶向選擇之一；而它的高度同源性，使它可用作各種基因的增強子。HRE在腫瘤基因治療中已有很多應用。Marignol等[11]構建了由5個或8個拷貝的HRE驅動的胞嘧啶脫氫酶載體，成功將其導入前列腺癌細胞，克服了后者對5-FU的耐藥性。Ruan等[12]分別構建了包含3、6及9個HRE的3種LacZ表達載體，并導入腦腫瘤細胞中，發現在缺氧狀態下LacZ活性增加的倍數與HRE的數量有一定關系。在實體瘤的基因治療中，可以利用腫瘤的缺氧微環境，使用HRE作為靶點，即腫瘤細胞中，由于存在缺氧微環境，HIF-1的表達升高，并與HRE結合從而激活其下游基因的轉錄；而在正常細胞中，足氧狀態使HIF-1處在無或低的水平，無法結合HRE發揮轉錄激活功能。
hTERTp是腫瘤細胞中特異性活化的啟動子，包括一段富含CG的CpG島，其在腫瘤細胞中被特異性激活的機理已有較多研究，在腫瘤的基因治療中，可作為有效的靶向選擇工具，為腫瘤的靶向分子治療提供了新途徑[13]。我們可以利用分子生物學技術在hTERT啟動子后插入能抑制腫瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡和分化的基因片段，再通過某種技術將重組質粒導入患者的細胞內，即可達到對腫瘤的靶向治療，而不會對正常細胞產生作用[14-16]。國內外已有學者[17-20]通過轉染hTERT啟動子調控的病毒載體來抑制腫瘤細胞的生長、轉移，并進行靶向治療，取得了一定進展。
尾型同源盒基因2（CDX2）位于人染色體13q12-13，全長22～23 kb，是腸特異性轉錄因子的一種，其在胚胎發育過程的早期就出現，決定了器官發生和腸上皮分化。在成人，CDX2僅在腸道上皮中特異性表達，在腸上皮細胞分化中起著重要的作用。CDX2的表達缺失幾乎在所有結直腸腺癌中都可發現[21]。筆者所在課題組的前期研究，通過瞬時過表達CDX2觀察CDX2對結腸癌細胞生物學性狀的影響，發現過表達CDX2對結腸癌LoVo細胞株增殖、凋亡及周期無明顯影響，但能夠明顯減弱LoVo細胞的侵襲力，從而對結直腸癌浸潤轉移起抑制作用[22-23]；同時構建模擬結腸癌細胞株缺氧微環境，觀察其對結腸癌細胞CDX2基因表達的影響，結果發現缺氧環境能夠下調CDX2的表達，從而促進結腸癌的惡性進展[24-25]。
鑒于以上，筆者擬采用誘導腫瘤細胞分化的方法，構建向結直腸癌細胞中導入CDX2基因的載體。在靶向性及安全性方面，利用腫瘤細胞缺氧微環境和端粒酶高活性的特性，應用人VEGF基因5’-端HRE和hTERT基因重組，共同構成缺氧可誘導的腫瘤特異性的基因轉錄調控元件，用該元件調控CDX2的表達，構建成能將CDX2靶向性表達于結直腸惡性腫瘤的雙靶向調控重組慢病毒載體，該基因治療載體具有特異性高和靶向性強的雙重特點。從理論上分析，上游的調控元件不僅可以使目的基因CDX2在缺氧微環境中的表達效果明顯增強，而且能夠使其僅在腫瘤組織中表達，避免了對正常細胞的作用，我們將在下一步對該載體的特異性和靶向性進行鑒定，雙靶向調控元件調控下游基因的表達，可能為腫瘤的基因治療提供一條有效途徑。同時，由于本身缺氧環境能夠下調CDX2的表達，所以該載體的靶向性表達不僅僅是單純過表達，同時是逆向表達，更能突出誘導分化的生物學作用。
本實驗成功構建了pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG慢病毒治療載體，并通過使用pLVX-5HRE-hTERTp-EGFP-3FLAG瞬時轉染體外培養的人結腸癌LoVo細胞，驗證了hTERTp能夠調控的下游綠色熒光蛋白EGFP的表達，說明構建的hTERTp本身具有啟動效率，而且能夠啟動下游基因的表達，為我們進一步實驗提供了重要保障。
