引用本文： 沈宏, 趙冬雨, 張寧. 修復基因XRCC1 Arg194Trp位點多態性與結直腸癌易感性的相關性分析. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(4): 476-478. doi: 10.7507/1007-9424.20140114 復制
近年來，我國結直腸癌的發病率逐年上升，居常見惡性腫瘤發病率的第5位[1]。對結直腸癌的病因至今尚未完全清楚，大多數學者[2-3]認為，除飲食因素、慢性炎癥刺激外，遺傳因素也起著重要的作用。X射線交叉互補修復基因1（XRCC1）是一種重要的DNA損傷修復基因，包括3個常見的多態性位點，Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp。其多態性改變可能影響XRCC1蛋白的正常功能，從而降低DNA的修復能力，影響腫瘤的易感性和生物學行為[4]。目前針對Arg339Gln位點與結直腸癌的易感性關系已有部分研究[5-6]，而Arg194Trp位點多態性與結直腸癌的易感性關系相關文獻報道較少。本研究擬采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術對XRCC1 Arg194Trp基因多態性進行檢測分析，旨在探討其與結直腸癌易感性的關系。
1 資料與方法
臨床資料
結直腸癌組選擇2008年1月至2012年1月期間筆者所在醫院的住院患者，共120例，其中男82例，女38例，年齡（65.2±7.8）歲，均經手術后病理學檢查證實為結直腸癌。對照組120例，其中男80例，女40例，年齡（64.8±8.2）歲，為自愿的健康體檢人員。2組資料采用流行病學病例對照研究方法進行分析。
1.2 主要實驗材料、試劑及設備
DNA提取試劑盒購自天津賽爾生物技術有限公司，PCR采用羅氏實時熒光定量PCR儀。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因組DNA提取
所有受試對象在知情同意情況下，取外周靜脈血2 mL，采用酚/氯仿法[7]提取2組患者外周血DNA。提取出的DNA在紫外線分光光度計（7230G型，上海天普分析儀器有限公司）下讀取260 nm和280 nm處的吸光度值（A值）以鑒定其純度和濃度。用無菌EP管分裝，-80°保存。
1.3.2 多態性位點引物設計
根據XRCC1 Arg-194Trp位點對應的基因序列，采用Primer 5.0軟件設計PCR擴增引物，上游引物為5′-GCCAGGGCC-CCTCCTFCAA-3′，下游引物為5′-TACCCTCAGA-CCCACGAGT-3′（購自天津賽爾生物技術有限公司）。
1.3.3 PCR反應體系及反應條件程序
PCR反應體系25μL，取2～10 ng基因組DNA，每種引物0.4μmol/mL，10×PCR緩沖液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad熱循環儀（EF4577型，上海電威貿易有限公司）。反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性40 s，63℃復性55 s，72℃延伸40 s，35個循環，最后再72℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反應體系為20μL，其中PCR產物5μL，10×PCR緩沖液3.5μL，限制性內切酶MspI（MBI）5 U，37℃水浴過夜。酶切產物于2％瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，30 min），根據電泳條帶數判斷基因型。
1.4 統計學方法
使用SPSS 16.0軟件處理數據。采用Mann-Whitney檢驗比較2組觀察對象之間年齡分布差異；比值比（odds ratios，OR）及其95%可信區間（confidence intervals，CI）表示相對風險度。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 2組觀察對象的基本特征
結直腸癌組與對照組相比，2組觀察對象在年齡、性別、吸煙、飲酒、飲食特點等常見暴露因素方面比較其差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性（表 1）。
表1
結直腸癌組與對照組的一般資料比較
2.2 2組觀察對象XRCC1基因194位點基因型分布情況
結直腸癌組患者XRCC1基因194位點Arg/Arg、Arg/Trp及Trp/Trp多態基因型出現頻率分別為70.00%、25.83%和4.17%，對照組出現頻率分別為75.83%、20.83%和3.34%；結直腸癌組和對照組的變異基因型Arg/Trp＋Trp/Trp出現頻率分別為30.00%和24.17%。2組間多態基因型和變異基因型出現頻率比較其差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
2組的XRCC1 194位點基因型分布情況〔例（%）〕
3 討論
結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近20年來，結直腸癌的發病率逐年增高，發病年齡趨于老齡化。其好發部位為直腸及直腸與乙狀結腸交界處，約占60% [8]。結直腸癌的病因至今尚未完全清楚，而有研究[9]報道，高脂和低纖維飲食與其發生有著密切的關系；慢性炎癥刺激也是一重要的影響因素。此外，直腸息肉也被認為是一種結直腸癌的癌前病變[10-11]。近年來，更多的學者開始關注遺傳因素與結直腸癌發生的相關性。有研究[12]發現，在結直腸癌患者家族中，約25%有癌腫家族史。因此，基因的多態性必然在癌癥的發生過程中起著一定的作用。
XRCC1是一種參與DNA損傷修復的重要基因，目前研究[4, 13]發現，XRCC1基因主要存在3個常見的多態性位點，它們分別是第10外顯子G28152A（Arg399Gln）、第9外顯子C27466A（Arg280His）及第6外顯子C26304T（Arg194Trp）；且已有研究[5, 14-15]發現XRCC1與多種癌癥的發生存在著相關性，如乳腺癌、食管癌、結直腸癌等。國外研究[16-17]報道，Arg339Gln位點多態性與結直腸癌的易感性有顯著的相關性。但Arg194Trp位點多態性與結直腸癌的易感性關系相關文獻報道較少。本研究結果發現，在結直腸癌組，Arg194Trp變異基因型出現的頻率與對照組相比其差異并無統計學意義。該結果提示，Arg194Trp位點多態性與結直腸癌的易感性無顯著相關性。但因納入的樣本量有限，這一結果并不能說明整個地區、中國及亞洲人群的整體情況。此外，不同人種的基因多態性也存在著一定差異。
總之，XRCC1作為一種DNA損傷修復基因，其多態性與多種腫瘤的發生存在相關性。XRCC1的3種不同位點基因多態性與結直腸癌易感性關系仍存在很大爭議。本研究結果發現，XRCC1 Arg194Trp位點基因多態性與結直腸癌易感性并不存在顯著相關性，然而非隨機抽樣、有限的樣本量及腫瘤誘發因素的多樣性均會影響結果的準確性與代表性，因此尚需大樣本高質量研究來驗證這一結果。
近年來，我國結直腸癌的發病率逐年上升，居常見惡性腫瘤發病率的第5位[1]。對結直腸癌的病因至今尚未完全清楚，大多數學者[2-3]認為，除飲食因素、慢性炎癥刺激外，遺傳因素也起著重要的作用。X射線交叉互補修復基因1（XRCC1）是一種重要的DNA損傷修復基因，包括3個常見的多態性位點，Arg339Gln、Arg280His和Arg194Trp。其多態性改變可能影響XRCC1蛋白的正常功能，從而降低DNA的修復能力，影響腫瘤的易感性和生物學行為[4]。目前針對Arg339Gln位點與結直腸癌的易感性關系已有部分研究[5-6]，而Arg194Trp位點多態性與結直腸癌的易感性關系相關文獻報道較少。本研究擬采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術對XRCC1 Arg194Trp基因多態性進行檢測分析，旨在探討其與結直腸癌易感性的關系。
1 資料與方法
臨床資料
結直腸癌組選擇2008年1月至2012年1月期間筆者所在醫院的住院患者，共120例，其中男82例，女38例，年齡（65.2±7.8）歲，均經手術后病理學檢查證實為結直腸癌。對照組120例，其中男80例，女40例，年齡（64.8±8.2）歲，為自愿的健康體檢人員。2組資料采用流行病學病例對照研究方法進行分析。
1.2 主要實驗材料、試劑及設備
DNA提取試劑盒購自天津賽爾生物技術有限公司，PCR采用羅氏實時熒光定量PCR儀。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因組DNA提取
所有受試對象在知情同意情況下，取外周靜脈血2 mL，采用酚/氯仿法[7]提取2組患者外周血DNA。提取出的DNA在紫外線分光光度計（7230G型，上海天普分析儀器有限公司）下讀取260 nm和280 nm處的吸光度值（A值）以鑒定其純度和濃度。用無菌EP管分裝，-80°保存。
1.3.2 多態性位點引物設計
根據XRCC1 Arg-194Trp位點對應的基因序列，采用Primer 5.0軟件設計PCR擴增引物，上游引物為5′-GCCAGGGCC-CCTCCTFCAA-3′，下游引物為5′-TACCCTCAGA-CCCACGAGT-3′（購自天津賽爾生物技術有限公司）。
1.3.3 PCR反應體系及反應條件程序
PCR反應體系25μL，取2～10 ng基因組DNA，每種引物0.4μmol/mL，10×PCR緩沖液2.7μL，1.5 mmol/mL MgCl2，1.5 U Tag酶，100μmol/mL dNTP，采用Bio-Rad熱循環儀（EF4577型，上海電威貿易有限公司）。反應條件為94℃預變性4 min，94℃變性40 s，63℃復性55 s，72℃延伸40 s，35個循環，最后再72℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反應體系為20μL，其中PCR產物5μL，10×PCR緩沖液3.5μL，限制性內切酶MspI（MBI）5 U，37℃水浴過夜。酶切產物于2％瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，30 min），根據電泳條帶數判斷基因型。
1.4 統計學方法
使用SPSS 16.0軟件處理數據。采用Mann-Whitney檢驗比較2組觀察對象之間年齡分布差異；比值比（odds ratios，OR）及其95%可信區間（confidence intervals，CI）表示相對風險度。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 2組觀察對象的基本特征
結直腸癌組與對照組相比，2組觀察對象在年齡、性別、吸煙、飲酒、飲食特點等常見暴露因素方面比較其差異均無統計學意義（P > 0.05），具有可比性（表 1）。
表1
結直腸癌組與對照組的一般資料比較
2.2 2組觀察對象XRCC1基因194位點基因型分布情況
結直腸癌組患者XRCC1基因194位點Arg/Arg、Arg/Trp及Trp/Trp多態基因型出現頻率分別為70.00%、25.83%和4.17%，對照組出現頻率分別為75.83%、20.83%和3.34%；結直腸癌組和對照組的變異基因型Arg/Trp＋Trp/Trp出現頻率分別為30.00%和24.17%。2組間多態基因型和變異基因型出現頻率比較其差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
2組的XRCC1 194位點基因型分布情況〔例（%）〕
3 討論
結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近20年來，結直腸癌的發病率逐年增高，發病年齡趨于老齡化。其好發部位為直腸及直腸與乙狀結腸交界處，約占60% [8]。結直腸癌的病因至今尚未完全清楚，而有研究[9]報道，高脂和低纖維飲食與其發生有著密切的關系；慢性炎癥刺激也是一重要的影響因素。此外，直腸息肉也被認為是一種結直腸癌的癌前病變[10-11]。近年來，更多的學者開始關注遺傳因素與結直腸癌發生的相關性。有研究[12]發現，在結直腸癌患者家族中，約25%有癌腫家族史。因此，基因的多態性必然在癌癥的發生過程中起著一定的作用。
XRCC1是一種參與DNA損傷修復的重要基因，目前研究[4, 13]發現，XRCC1基因主要存在3個常見的多態性位點，它們分別是第10外顯子G28152A（Arg399Gln）、第9外顯子C27466A（Arg280His）及第6外顯子C26304T（Arg194Trp）；且已有研究[5, 14-15]發現XRCC1與多種癌癥的發生存在著相關性，如乳腺癌、食管癌、結直腸癌等。國外研究[16-17]報道，Arg339Gln位點多態性與結直腸癌的易感性有顯著的相關性。但Arg194Trp位點多態性與結直腸癌的易感性關系相關文獻報道較少。本研究結果發現，在結直腸癌組，Arg194Trp變異基因型出現的頻率與對照組相比其差異并無統計學意義。該結果提示，Arg194Trp位點多態性與結直腸癌的易感性無顯著相關性。但因納入的樣本量有限，這一結果并不能說明整個地區、中國及亞洲人群的整體情況。此外，不同人種的基因多態性也存在著一定差異。
總之，XRCC1作為一種DNA損傷修復基因，其多態性與多種腫瘤的發生存在相關性。XRCC1的3種不同位點基因多態性與結直腸癌易感性關系仍存在很大爭議。本研究結果發現，XRCC1 Arg194Trp位點基因多態性與結直腸癌易感性并不存在顯著相關性，然而非隨機抽樣、有限的樣本量及腫瘤誘發因素的多樣性均會影響結果的準確性與代表性，因此尚需大樣本高質量研究來驗證這一結果。
