引用本文： 孫海晨, 劉爽, 崔葉青, 王曉輝, 羅斌. 成人甲狀旁腺細胞的培養方法及其分泌功能研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2014, 21(9): 1120-1123. doi: 10.7507/1007-9424.20140269 復制
甲狀旁腺功能低下患者的臨床表現為肌肉痙攣和手足頻繁抽搐，嚴重者甚至生活難以自理[1]，需要頻繁的靜脈補鈣。炎癥、腫瘤、遺傳缺陷或日益多見的甲狀腺癌手術都可能導致甲狀旁腺功能低下的發生，使甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）分泌不足或生物活性降低，從而導致鈣磷代謝紊亂。PTH替代治療由于其半衰期短和價格昂貴而難以應用于臨床，因此，甲狀旁腺細胞移植成為一種治療永久性甲狀旁腺功能低下的可能手段。目前，國內很少有關于成人甲狀旁腺細胞培養及分泌功能的研究。因此，本研究通過體外培養成人甲狀旁腺細胞，觀測其培養過程中的形態及分泌功能，以便為甲狀旁腺細胞移植治療甲狀旁腺功能低下的可行性提供理論基礎。現將我們的初步結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
本實驗材料來源于2012年7月至2013年3月期間于宣武醫院行手術切除的5例甲狀旁腺腺瘤患者，男2例，女3例；年齡46～55歲，平均50.5歲。5例患者均診斷為原發性甲狀旁腺功能亢進，且均經B超和同位素掃描檢查診斷為單發甲狀旁腺腺瘤。試劑：膠原酶Ⅰ（Sigma公司）、RPMI 1640培養液（Gibco公司）、PTH檢測試劑盒（電化學發光法，羅氏公司）及胎牛血清（Gibco公司）。設備：BSA124S型萬分之一天平（Sartorius公司）、ZC-10型恒溫水浴槽（寧波天恒儀器廠）、LDZ5-2型低速自動平衡離心機（北京醫用離心機廠）、SW-CJ-2FD型垂直潔凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）及311型氣套式CO2培養箱（Thermo公司）。
1.2 方法
手術切除甲狀旁腺腺瘤后，取一半組織送冰凍切片病理學檢查，另一半再切除二分之一置于液氮中凍存，剩余的組織立即放入D-Hanks平衡鹽緩沖溶液（HBSS）中，30 min內送至細胞培養室。在培養皿中去除結締組織和脂肪組織后，再擠壓出組織間隙的紅細胞，將甲狀旁腺腺瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm～2 mm×2 mm×2 mm大的組織塊，加入10 mL濃度為0.2%的膠原酶Ⅰ消化液混勻后，吸入50 mL離心管中，于37℃水浴槽中消化90～120 min，每隔10 min搖動1次。將消化處理后的細胞懸液離心4 min（2 000 r/min，r=16 cm），棄上清，加入HBSS 20 mL，用吸管反復吹打沉淀，促使細胞進一步分散。將細胞懸液經100μm網篩過濾后，重復離心3次（1 000 r/min，r=16 cm，4 min），以去除部分成纖維細胞、脂肪細胞、紅細胞等。行臺盼藍染色并計數[2]，計算細胞存活率。加入含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100μg/mL）的RPMI 1640培養液，調整細胞濃度為1×106個/mL。將培養瓶置于37℃CO2培養箱中培養（相對濕度為95%，CO2濃度為5%）。隔日換液，每天在顯微鏡下觀察細胞形態。留取1、5、10、15及20 d的上清，-80℃凍存備用。培養20 d后進行傳代（細胞濃度為1×106個/mL），培養條件如上。隔日換液，在顯微鏡下觀察細胞形態。留取1、5、10及15 d時的上清，-80℃凍存備用，以統一檢測PTH水平。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料的統計分析方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察
提取的細胞行臺盼藍染色后示存活率均＞90％。倒置顯微鏡下見消化后的細胞散在分布，呈圓形，均質且透明；放入培養瓶中培養1 d后，見細胞附于培養瓶底部，并見少數細胞開始呈放射狀延展；2 d時細胞大部分貼壁并相互連接成片，呈多角形或梭形；3 d時細胞全部充分展開，鋪滿整個瓶底，其胞質透明，結構完整；之后4～15 d期間細胞的形態變化不大；16～20 d時部分細胞的細胞核增大，胞質內空泡增多，細胞呈老化狀態，但大部分細胞仍可保持較完整的形態結構。培養20 d后進行傳代，1 d后于倒置顯微鏡下觀察傳代細胞，見細胞全部展開，細胞主要呈梭形，與原代細胞比較，傳代細胞的體積略微增大，2～15 d期間細胞形態變化不大（圖 1）。
圖1
圖 1示原代和傳代甲狀旁腺細胞的培養結果（倒置顯微鏡×100）。1A：原代培養第6天；1B：原代培養第15天；1C：傳代培養第6天；1D：傳代培養第15天
Figure1.
Results of original generational cells and passage cells (Inverted microscope×100)．1A:6th day of original generational cells; 1B:15th day of original generational cells; 1C:6th day of passage cells; 1D:15th day of passage cells
2.2 PTH檢測結果
原代培養甲狀旁腺細胞培養液中的PTH水平
從1 d開始即呈逐漸下降趨勢，10 d后PTH水平
下降幅度明顯，20 d時降到最低（圖 2A）。其中5 d
與1 d、10 d與5 d比較差異均無統計學意義（P＞0.05），說明10 d內的PTH水平無明顯變化。15 d和10 d比較，15 d時的PTH水平較低（P＜0.01），而20 d與15 d的差異無統計學意義（P＞0.05），提示從10 d起甲狀旁腺細胞的分泌功能開始減弱。傳代細胞1、5、10及15 d的PTH水平均低于同時點的原代細胞（圖 2B）。傳代培養細胞中，5 d與1 d、10 d與5 d、15 d和10 d的PTH水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
示原代和傳代甲狀旁腺細胞各時點的PTH水平檢測結果。2A：原代培養細胞；2B：傳代培養細胞
Figure2.
The results of PTH level in original generation cells and passage cells at each time point．2A:Original generation cells; 2B:Passage cells
3 討論
PTH是甲狀旁腺分泌的主要鈣激素之一，對調節鈣、磷代謝，維持細胞外液鈣的內環境穩定起著重要作用[3]。甲狀腺手術時造成的甲狀旁腺損傷、甲狀旁腺炎癥、腫瘤或遺傳缺陷均可引起甲狀旁腺功能低下，導致PTH分泌不足或活性降低。目前其內科治療方法主要是對癥治療，雖能暫時緩解癥狀，但長期療效較差，副作用也較大[4]。自體甲狀旁腺移植避免了排斥反應，移植成活率較高，但其主要用于甲狀腺全切除或次全切除手術所致的甲狀旁腺被連帶全切除或誤切、尿毒癥及甲狀旁腺腺瘤繼發甲狀旁腺功能亢進，應用范圍有限[5]。同種異體移植手術本身操作簡單、可重復性好、短期療效確切，但如何找到充足的移植來源、降低移植物的免疫原性以及延長移植后移植組織的存活時間，一直是困擾外科醫生的核心問題[6-8]。
細胞移植技術由于其操作簡單、安全有效以及可多次重復進行，近年來越來越受到臨床醫生的關注。體外培養的甲狀旁腺細胞具有以下優點：①可降低移植物的免疫原性及人白細胞DR抗原（HLA-DR抗原）的陽性表達率[9-10]；②下調了主要組織相容性復合體-Ⅰ（MHC-Ⅰ）和MHC-Ⅱ類抗原的表達[11]；③可以控制移植的細胞數量以調控PTH水平；④可選擇生長狀態最好的細胞進行移植或低溫保存，從而為甲狀旁腺細胞的移植奠定了基礎。
目前，對于大鼠和胎兒甲狀旁腺細胞研究得較多，并且已有相關細胞移植的報道[12-14]，但對于成人甲狀旁腺細胞的相關研究還較少。筆者選取了5例甲狀旁腺腺瘤患者的腺瘤組織，采用膠原酶消化法提取細胞，并觀察其形態及PTH分泌功能。消化方法的選取及消化時間的控制是決定細胞提取成功與否的關鍵，目前采取的消化方法以胰酶消化法較為常見。但胰酶對細胞的傷害較大，且消化時間難以控制，極易造成細胞損傷導致細胞破碎、DNA釋出[15-17]。為了更好地保護細胞，本實驗采取的是對細胞傷害較小的膠原酶消化法，時間控制在90～120 min，結果獲得了數量較多且具有功能的甲狀旁腺細胞。原代細胞培養2 d后絕大多數細胞貼壁并連接成片，呈多角形或梭形；3 d時可見細胞胞質透明，結構完整；培養至16～20 d時部分細胞的細胞核增大，胞質內空泡增多，細胞慢慢呈現老化狀態，但大部分細胞仍可保持較完整的形態結構。傳代細胞與原代細胞比較其體積略有增大，以梭形為主，培養1～15 d期間細胞形態變化不大。有文獻[18]報道，胎兒甲狀旁腺細胞的生存期短，幾乎無傳代可能。本實驗結果說明，成人甲狀旁腺細胞比胎兒甲狀旁腺細胞在移植上可能更有優勢。反映甲狀旁腺細胞分泌功能的主要指標是培養液中PTH的濃度。本實驗結果顯示，原代培養的甲狀旁腺細胞在1～10 d期間的PTH濃度最高，10 d后PTH濃度急劇下降；其PTH分泌濃度遠遠大于大鼠及胎兒甲狀旁腺細胞的PTH分泌濃度[18-19]。此外，本實驗將培養的成人甲狀旁腺細胞進行傳代，發現傳代后的細胞可保持較好的形態結構，但其PTH分泌水平明顯降低。根據細胞形態和PTH水平綜合推測，培養10 d內的原代甲狀旁腺細胞的分泌功能最強，狀態最佳，可作為移植的最佳供體；傳代后的細胞雖然仍可分泌PTH，但其分泌功能明顯低于原代。
綜上所述，本實驗結果提示，采用膠原酶消化法可獲得具有良好形態結構及PTH分泌功能的甲狀旁腺細胞。在2001年，就有將微囊化技術與甲狀旁腺細胞結合治療甲狀旁腺功能低下的相關實驗研究[20]，但由于微囊化技術不成熟，該技術未得到廣泛重視。近年來，隨著生物工程技術的發展，微囊的制備工藝不斷得到完善，微囊化技術在醫學領域越來越受到學者們的重視[21-22]。多種細胞和組織已被包裹在微囊中，用于臨床治療[23-24]。因此，甲狀旁腺細胞與微囊化技術的結合為永久性甲狀旁腺功能低下患者的同種異體細胞移植提供了可靠的理論基礎。
甲狀旁腺功能低下患者的臨床表現為肌肉痙攣和手足頻繁抽搐，嚴重者甚至生活難以自理[1]，需要頻繁的靜脈補鈣。炎癥、腫瘤、遺傳缺陷或日益多見的甲狀腺癌手術都可能導致甲狀旁腺功能低下的發生，使甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）分泌不足或生物活性降低，從而導致鈣磷代謝紊亂。PTH替代治療由于其半衰期短和價格昂貴而難以應用于臨床，因此，甲狀旁腺細胞移植成為一種治療永久性甲狀旁腺功能低下的可能手段。目前，國內很少有關于成人甲狀旁腺細胞培養及分泌功能的研究。因此，本研究通過體外培養成人甲狀旁腺細胞，觀測其培養過程中的形態及分泌功能，以便為甲狀旁腺細胞移植治療甲狀旁腺功能低下的可行性提供理論基礎。現將我們的初步結果報道如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
本實驗材料來源于2012年7月至2013年3月期間于宣武醫院行手術切除的5例甲狀旁腺腺瘤患者，男2例，女3例；年齡46～55歲，平均50.5歲。5例患者均診斷為原發性甲狀旁腺功能亢進，且均經B超和同位素掃描檢查診斷為單發甲狀旁腺腺瘤。試劑：膠原酶Ⅰ（Sigma公司）、RPMI 1640培養液（Gibco公司）、PTH檢測試劑盒（電化學發光法，羅氏公司）及胎牛血清（Gibco公司）。設備：BSA124S型萬分之一天平（Sartorius公司）、ZC-10型恒溫水浴槽（寧波天恒儀器廠）、LDZ5-2型低速自動平衡離心機（北京醫用離心機廠）、SW-CJ-2FD型垂直潔凈工作臺（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）及311型氣套式CO2培養箱（Thermo公司）。
1.2 方法
手術切除甲狀旁腺腺瘤后，取一半組織送冰凍切片病理學檢查，另一半再切除二分之一置于液氮中凍存，剩余的組織立即放入D-Hanks平衡鹽緩沖溶液（HBSS）中，30 min內送至細胞培養室。在培養皿中去除結締組織和脂肪組織后，再擠壓出組織間隙的紅細胞，將甲狀旁腺腺瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm～2 mm×2 mm×2 mm大的組織塊，加入10 mL濃度為0.2%的膠原酶Ⅰ消化液混勻后，吸入50 mL離心管中，于37℃水浴槽中消化90～120 min，每隔10 min搖動1次。將消化處理后的細胞懸液離心4 min（2 000 r/min，r=16 cm），棄上清，加入HBSS 20 mL，用吸管反復吹打沉淀，促使細胞進一步分散。將細胞懸液經100μm網篩過濾后，重復離心3次（1 000 r/min，r=16 cm，4 min），以去除部分成纖維細胞、脂肪細胞、紅細胞等。行臺盼藍染色并計數[2]，計算細胞存活率。加入含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100μg/mL）的RPMI 1640培養液，調整細胞濃度為1×106個/mL。將培養瓶置于37℃CO2培養箱中培養（相對濕度為95%，CO2濃度為5%）。隔日換液，每天在顯微鏡下觀察細胞形態。留取1、5、10、15及20 d的上清，-80℃凍存備用。培養20 d后進行傳代（細胞濃度為1×106個/mL），培養條件如上。隔日換液，在顯微鏡下觀察細胞形態。留取1、5、10及15 d時的上清，-80℃凍存備用，以統一檢測PTH水平。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料的統計分析方法采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察
提取的細胞行臺盼藍染色后示存活率均＞90％。倒置顯微鏡下見消化后的細胞散在分布，呈圓形，均質且透明；放入培養瓶中培養1 d后，見細胞附于培養瓶底部，并見少數細胞開始呈放射狀延展；2 d時細胞大部分貼壁并相互連接成片，呈多角形或梭形；3 d時細胞全部充分展開，鋪滿整個瓶底，其胞質透明，結構完整；之后4～15 d期間細胞的形態變化不大；16～20 d時部分細胞的細胞核增大，胞質內空泡增多，細胞呈老化狀態，但大部分細胞仍可保持較完整的形態結構。培養20 d后進行傳代，1 d后于倒置顯微鏡下觀察傳代細胞，見細胞全部展開，細胞主要呈梭形，與原代細胞比較，傳代細胞的體積略微增大，2～15 d期間細胞形態變化不大（圖 1）。
圖1
圖 1示原代和傳代甲狀旁腺細胞的培養結果（倒置顯微鏡×100）。1A：原代培養第6天；1B：原代培養第15天；1C：傳代培養第6天；1D：傳代培養第15天
Figure1.
Results of original generational cells and passage cells (Inverted microscope×100)．1A:6th day of original generational cells; 1B:15th day of original generational cells; 1C:6th day of passage cells; 1D:15th day of passage cells
2.2 PTH檢測結果
原代培養甲狀旁腺細胞培養液中的PTH水平
從1 d開始即呈逐漸下降趨勢，10 d后PTH水平
下降幅度明顯，20 d時降到最低（圖 2A）。其中5 d
與1 d、10 d與5 d比較差異均無統計學意義（P＞0.05），說明10 d內的PTH水平無明顯變化。15 d和10 d比較，15 d時的PTH水平較低（P＜0.01），而20 d與15 d的差異無統計學意義（P＞0.05），提示從10 d起甲狀旁腺細胞的分泌功能開始減弱。傳代細胞1、5、10及15 d的PTH水平均低于同時點的原代細胞（圖 2B）。傳代培養細胞中，5 d與1 d、10 d與5 d、15 d和10 d的PTH水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
示原代和傳代甲狀旁腺細胞各時點的PTH水平檢測結果。2A：原代培養細胞；2B：傳代培養細胞
Figure2.
The results of PTH level in original generation cells and passage cells at each time point．2A:Original generation cells; 2B:Passage cells
3 討論
PTH是甲狀旁腺分泌的主要鈣激素之一，對調節鈣、磷代謝，維持細胞外液鈣的內環境穩定起著重要作用[3]。甲狀腺手術時造成的甲狀旁腺損傷、甲狀旁腺炎癥、腫瘤或遺傳缺陷均可引起甲狀旁腺功能低下，導致PTH分泌不足或活性降低。目前其內科治療方法主要是對癥治療，雖能暫時緩解癥狀，但長期療效較差，副作用也較大[4]。自體甲狀旁腺移植避免了排斥反應，移植成活率較高，但其主要用于甲狀腺全切除或次全切除手術所致的甲狀旁腺被連帶全切除或誤切、尿毒癥及甲狀旁腺腺瘤繼發甲狀旁腺功能亢進，應用范圍有限[5]。同種異體移植手術本身操作簡單、可重復性好、短期療效確切，但如何找到充足的移植來源、降低移植物的免疫原性以及延長移植后移植組織的存活時間，一直是困擾外科醫生的核心問題[6-8]。
細胞移植技術由于其操作簡單、安全有效以及可多次重復進行，近年來越來越受到臨床醫生的關注。體外培養的甲狀旁腺細胞具有以下優點：①可降低移植物的免疫原性及人白細胞DR抗原（HLA-DR抗原）的陽性表達率[9-10]；②下調了主要組織相容性復合體-Ⅰ（MHC-Ⅰ）和MHC-Ⅱ類抗原的表達[11]；③可以控制移植的細胞數量以調控PTH水平；④可選擇生長狀態最好的細胞進行移植或低溫保存，從而為甲狀旁腺細胞的移植奠定了基礎。
目前，對于大鼠和胎兒甲狀旁腺細胞研究得較多，并且已有相關細胞移植的報道[12-14]，但對于成人甲狀旁腺細胞的相關研究還較少。筆者選取了5例甲狀旁腺腺瘤患者的腺瘤組織，采用膠原酶消化法提取細胞，并觀察其形態及PTH分泌功能。消化方法的選取及消化時間的控制是決定細胞提取成功與否的關鍵，目前采取的消化方法以胰酶消化法較為常見。但胰酶對細胞的傷害較大，且消化時間難以控制，極易造成細胞損傷導致細胞破碎、DNA釋出[15-17]。為了更好地保護細胞，本實驗采取的是對細胞傷害較小的膠原酶消化法，時間控制在90～120 min，結果獲得了數量較多且具有功能的甲狀旁腺細胞。原代細胞培養2 d后絕大多數細胞貼壁并連接成片，呈多角形或梭形；3 d時可見細胞胞質透明，結構完整；培養至16～20 d時部分細胞的細胞核增大，胞質內空泡增多，細胞慢慢呈現老化狀態，但大部分細胞仍可保持較完整的形態結構。傳代細胞與原代細胞比較其體積略有增大，以梭形為主，培養1～15 d期間細胞形態變化不大。有文獻[18]報道，胎兒甲狀旁腺細胞的生存期短，幾乎無傳代可能。本實驗結果說明，成人甲狀旁腺細胞比胎兒甲狀旁腺細胞在移植上可能更有優勢。反映甲狀旁腺細胞分泌功能的主要指標是培養液中PTH的濃度。本實驗結果顯示，原代培養的甲狀旁腺細胞在1～10 d期間的PTH濃度最高，10 d后PTH濃度急劇下降；其PTH分泌濃度遠遠大于大鼠及胎兒甲狀旁腺細胞的PTH分泌濃度[18-19]。此外，本實驗將培養的成人甲狀旁腺細胞進行傳代，發現傳代后的細胞可保持較好的形態結構，但其PTH分泌水平明顯降低。根據細胞形態和PTH水平綜合推測，培養10 d內的原代甲狀旁腺細胞的分泌功能最強，狀態最佳，可作為移植的最佳供體；傳代后的細胞雖然仍可分泌PTH，但其分泌功能明顯低于原代。
綜上所述，本實驗結果提示，采用膠原酶消化法可獲得具有良好形態結構及PTH分泌功能的甲狀旁腺細胞。在2001年，就有將微囊化技術與甲狀旁腺細胞結合治療甲狀旁腺功能低下的相關實驗研究[20]，但由于微囊化技術不成熟，該技術未得到廣泛重視。近年來，隨著生物工程技術的發展，微囊的制備工藝不斷得到完善，微囊化技術在醫學領域越來越受到學者們的重視[21-22]。多種細胞和組織已被包裹在微囊中，用于臨床治療[23-24]。因此，甲狀旁腺細胞與微囊化技術的結合為永久性甲狀旁腺功能低下患者的同種異體細胞移植提供了可靠的理論基礎。
