引用本文： 周培華, 孫學軍, 鄭見寶, 王煒, 王孝瓏, 陳南征, 魏光兵, 范淵, 李孝彬, 王訓凱, 祿韶英. 5HRE聯合CEAp靶向調控RASSF1A基因對SGC7901胃癌細胞株抑制作用的研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2015, 22(10): 1201-1208. doi: 10.7507/1007-9424.20150312 復制
胃癌是全世界常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康[1-2]。雖然手術、放療、化療等傳統治療胃癌的方法取得了一定的進展，但是其預后仍然不理想。腫瘤的基因治療成為有希望治愈惡性腫瘤的新方法，目前已取得一些進展，但是其靶向性、治療基因表達的持久性及載體的安全性一直是腫瘤基因治療面臨的困難[3]。本實驗構建了5拷貝低氧反應元件（5HRE）聯合癌胚抗原啟動子（CEAp）雙靶向調控元件和調控RAS相關區域家族1A（RASSF1A）基因表達的慢病毒載體，以初步研究其對癌胚抗原（CEA）表達陽性胃癌細胞的靶向性及有效性。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
前期本課題組[4-5]已構建并保存攜帶5HRE及CEAp DNA片段的載體，RASSF1A基因片段及慢病毒載體均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，胃腺癌細胞株SGC7901、MKN28及乳腺正常腺上皮細胞株MCF-10A均購自中科院上海細胞庫，限制性內切酶、T4DNA連接酶、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、Premix TaqTM試劑盒及RNA逆轉錄試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司，細胞活性檢測試劑盒-8（CCK-8）購自日本同仁化學研究所，DNA Marker和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，螢光素酶報告基因載體pGL4.20、pGL4.74及雙螢光素酶檢測試劑盒Dual-Glo?LuciferaseAssay System均購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司，細胞培養基RPMI 1640和DMEM/F12均購自美國CORNING公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，RNAfast200-總RNA極速抽提試劑盒購自陜西先鋒生物科技有限公司，鼠抗人RASSF1A單克隆抗體購自美國eBioscience公司，辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗購自Pierce公司，兔抗人CEA多克隆抗體購自美國Proteintech公司，HRP標記的β-actin單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，細胞免疫組織化學SP法檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，CoCl2購自美國SIGMA-ALDRICH公司，TurboFect轉染試劑和顯影劑SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate均購自美國Thermo公司。引物均由上海生工生物有限公司合成，測序由華大科技公司完成。設備主要包括CFX96TM real-time PCR Detection System qPCR儀（美國伯樂公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養和細胞懸液制備
SGC7901和MKN28細胞株均在含10%胎牛血清、100μ/mL青霉素和100μ/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養，MCF-10A細胞株在含15%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μ/mL鏈霉素、10μg/mL胰島素及20 ng/mL表皮生長因子的DMEM/F12培養基中培養。所有細胞株均在37℃、含5% CO2、飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養，每2～3天換液1次。細胞懸液制備：采用90 mm培養皿培養細胞至指數增殖期時，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）換液，再以0.25%胰酶消化液消化至貼壁細胞呈圓形時，用含血清的細胞培養基終止消化并吹打細胞呈單細胞懸液，離心（800 r/min，r=10 cm，5 min）后，以PBS液洗細胞1遍，再以同樣條件離心。計數細胞后，稀釋至1×105個/mL，根據不同的實驗目的，稀釋細胞至不同的密度再接種至細胞培養板。
1.2.2 CEA及RASSF1A表達的檢測
①采用實時定量RT-PCR（qRT-PCR）法檢測3種細胞株中CEA mRNA的表達水平。通過RNAfast200-總RNA極速抽提試劑盒提取細胞的總RNA，具體操作步驟見試劑盒說明書。按逆轉錄說明書操作獲得cDNA（使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，體系如下：5×PrimeScript Buffer 10μL、總RNA 10μL及RNase Free ddH2O 30μL，共50μL），進行qPCR擴增。qPCR擴增采用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，反應體系如下：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，上下游混合引物（20μmol/L）0.5μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 11.0μL，共25μL；擴增條件為：94℃變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環。CEA引物序列（GenBank?/EMBL提取號碼：NM_004363.2）和β-actin（GenBank?/EMBL提取號碼：NM_001101.3）引物序列見表 1，以β-actin為內參。CEA mRNA的表達水平通過2-ΔΔCt方法計算。每個反應設3個復孔，重復實驗3次，取均值。②采用細胞免疫組織化學SP法檢測3種細胞株中CEA的表達水平。將細胞接種于24孔細胞培養板中，接種密度為5×104個/mL，每孔500μL；3 d后用PBS溶液清洗細胞3次，每次10 min；以4%多聚甲醛固定30 min后按說明書行SP法免疫組織化學染色。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，DAB顯色時間為2 min。當陰性對照結果為陰性時，視檢測結果可信。CEA蛋白的陽性表達主要定位在細胞的細胞膜和細胞漿中，以出現棕黃色顆粒為陽性。用Nikon倒置顯微鏡通過Nikon數碼相機和NIS-Elements D采圖軟件在20倍物鏡下按照同一采集參數拍攝，每孔細胞樣品隨機截取5個不同的陽性部位采集圖像（200倍），其測量均值代表該孔細胞測量值。用Image Pro Plus 6圖像分析軟件隨機選取每張圖像中的陽性細胞簇作為測量區域（area of interesting，AOI），測量該區域的面積。在該區域內通過分色工具測量棕黃色顆粒的積分光密度（integrated option density，IOD），計算平均密度（mean density，MD）。MD=IOD/AOI的面積。MD值代每個單位面積的染色強度，可以較準確地反映陽性產物的濃度。每種細胞設3個復孔，重復實驗3次，取均值。③通過Western blot法[6]檢測3種細胞株中RASSF1A蛋白的表達水平（因條帶結果較明顯，故未定量），以β-actin作為內參。每種細胞設3個復孔，重復實驗3次，取均值。
表1
引物序列
1.2.3 載體構建
①螢光素酶報告基因載體pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc的構建。以載體pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM為模板，采用PCR法擴增CEAp和5HRE-CEAp片段（引物序列見表 1）。反應體系：Premix TaqTM 25μL、cDNA 2μL、混合引物（20μmol/L）1μL、ddH2O 22μL，共50μL。PCR反應條件：94℃變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸7 min。片段經過瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收，通過分子克隆技術將各片段分別插入pGL4.20多克隆位點（操作按試劑盒說明書進行），構建pGL-4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc載體。②慢病毒載體pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A的構建。首先通過PCR法擴增RASSF1A基因片段（引物序列見表 1），通過分子克隆技術將5HRE-CEAp片段與RASSF1A片段連接并插入慢病毒載體的多克隆位點（操作按試劑盒說明書進行）。將構建的載體送華大科技公司測序驗證。
1.2.4 雙螢光素酶報告基因實驗
以含有螢火蟲螢光素酶報告基因的無啟動子載體pGL4.20作為陰性對照，以含有海腎螢光素酶報告基因的載體pGL4.74作為共轉染表達載體〔該載體含單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子（HSV-TKp）〕，以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc載體作為實驗對象。各載體結構見圖 1。首先開展CoCl2的濃度梯度和時間梯度實驗，選擇最佳作用濃度和最佳作用時間（作用細胞為SGC7901細胞株）。在濃度梯度實驗中，以不同濃度的CoCl2（0、100、200、300、400及500μmol/L）作用12 h，結果300μmol/L的活性倍數最高；在時間梯度實驗中，以固定濃度的CoCl2（200μmol/L）作用不同時間（0、4、8、12、24及48 h），結果作用24 h的活性倍數最高。再取對數生長期的細胞株，以5×103個/孔接種于96孔板中，待細胞融合度達70%時，將載體pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc（3種細胞株）、pGL4.20-CEAp-Luc（僅轉染SGC7901細胞株）及pGL4.20（3種細胞株）分別與pGL4.74（30 ng）共轉染細胞（操作按試劑盒說明書進行，載體均為200 ng）。24 h后更換培養基并按設計加（缺氧組）或不加CoCl2（常氧組），CoCl2濃度為200μmol/L（預實驗發現300μmol/L的CoCl2可導致較多的細胞死亡，所以最終選擇200μmol/L），作用時長為24 h。活性倍數的檢測：終止培養后，按照Dual-Glo?Luciferase Assay System試劑盒說明書操作，在酶標儀（510 nm）上檢測螢光素酶活性。為便于比較不同組啟動子的啟動活性，其結果使用活性倍數進行比較。活性倍數=樣本活性比值（螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性）/陰性對照活性比值（螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性）。
圖1
雙螢光素酶報告基因實驗載體的結構示意圖。hRluc：海腎螢光素酶報告基因；Luc：螢火蟲螢光素酶基因
1.2.5 細胞感染
重組慢病毒載體（pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A）及相應空病毒載體均由吉凱公司包裝成病毒顆粒LV-5HC-RASSF1A（感染組）和LV-NC（陰性對照組）。取對數生長期的SGC7901及MKN28細胞，以1×105個/孔接種于96孔板中，培養24 h后感染病毒〔感染復數（MOI）為10〕，操作按試劑盒說明書進行。以未感染任何病毒的細胞作為空白對照組。48 h后根據設計需要加（缺氧組）或不加CoCl2（常氧組），濃度為300μmol/L，作用24 h。每組設3個復孔。在培養24 h后，檢測細胞生長抑制率（操作按CCK-8檢測試劑盒說明書進行），在酶標儀（450 nm波長）上檢測吸光度值（A值）。抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%，其中對照組為不做任何處理的SGC7901及MKN28細胞，實驗組為加或不加CoCl2的細胞（感染或未感染病毒顆粒）。同時采用Western blot法檢測細胞中RASSF1A蛋白的表達水平（方法同上）。
1.3 統計學方法
數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所得實驗結果以均數±標準差（
2 結果
2.1 內源性CEA和RASSF1A的表達結果
qRT-PCR結果顯示，SGC7901細胞株中CEA mRNA的表達水平高于MKN28及MCF-10A細胞株（P < 0.05），而MKN28及MCF-10A細胞株間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 2。免疫組織化學染色結果顯示：CEA的表達水平在SGC7901、MKN28及MCF-10A細胞株中依次遞減，兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 3和圖 4。Western blot結果顯示，在SGC7901及MKN28細胞株中均未檢測到RASSF1A蛋白的電泳條帶，而在MCF-10A細胞株中可檢測到（圖 5）。依據該結果，本實驗確定SGC7901細胞株為實驗細胞（CEA mRNA表達陽性，RASSF1A蛋白表達陰性），MKN28細胞株為陰性對照細胞（CEA mRNA表達陰性，RASSF1A蛋白表達陰性）。
圖2
示3種細胞株中CEA mRNA表達水平檢測結果。與MKN28和MCF-10A細胞株比較，* P < 0.05??圖 3??示3種細胞株中CEA蛋白表達水平檢測結果。與SGC7901細胞株比較，* P < 0.05；與MKN28細胞株比較，# P < 0.05??圖 4??示3種細胞株中CEA的免疫組織化學染色結果（SP×200）。4A：SGC7901細胞株；4B：MKN28細胞株；4C：MCF-10A細胞株??圖 5??示RASSF1A蛋白的電泳結果。1：SGC7901細胞株；2：MKN28細胞株；3：MCF-10A細胞株
2.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A載體構建
構建的pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A載體經測序均構建成功。
2.3 梯度試驗和雙螢光素酶報告基因實驗結果
2.3.1 以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc轉染SGC7901細胞株后，CoCl2不同作用濃度和不同作用時間的活性倍數結果
在300μmol/L以下，隨CoCl2濃度升高，活性倍數相應升高；而在300μmol/L以上，隨著CoCl2濃度升高，活性倍數下降，見6A。24 h之前，隨著CoCl2作用時間延長，活性倍數相應升高；24 h之后，活性倍數開始下降，見6B。由此確定了300μmol/L為CoCl2的最優濃度，24 h為其最優作用時間。
2.3.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體在SGC7901、MKN28及MCF-10A細胞株中的啟動活性
雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，在SGC7901細胞株及MKN28細胞株中，同種細胞株內與常氧組比較，缺氧組細胞的活性倍數均升高（P < 0.01）；而在MCF-10A細胞株中，常氧組和缺氧組細胞的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 7。在不加入CoCl2條件下，與SGC7901細胞株比較，MKN28及MCF-10A細胞株的活性倍數均較低（P < 0.05）；與MKN28細胞株比較，MCF-10A細胞株的活性倍數較低（P < 0.01），見圖 7。在加入CoCl2條件下，與SGC7901細胞株比較，MKN28及MCF-10A細胞株的活性倍數均較低（P < 0.01）；與MKN28細胞株比較，MCF-10A細胞株的活性倍數較低（P < 0.05），見圖 7。該結果提示，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體具有靶向CEA轉錄陽性細胞及低氧誘導的雙重轉錄調控能力。
圖6
示CoCl2不同濃度（6A）和不同作用時間（6B）的活性倍數結果??圖 7??示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體在3種細胞株中的轉錄活性。同種細胞株內與常氧組比較，* P < 0.01；同種CoCl2條件下與SGC7901細胞株比較，# P < 0.05，## P < 0.01；同種CoCl2條件下與MKN28細胞株比較，△P < 0.05，△△P < 0.01??圖 8??示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc與pGL4.20-CEAp-Luc載體在SGC7901細胞株中的轉錄活性。同種細胞株內與缺氧組比較，* P < 0.05；同種CoCl2條件下與5HRE-CEAp比較，# P < 0.05??圖 9??示SGC7901（9A）和MKN28（9B）細胞株感染慢病毒顆粒后細胞中RASSF1A蛋白表達的電泳結果。1：空白對照組；2：陰性對照組；3：感染組；N：常氧組；H：缺氧組??圖 10??示SGC7901細胞的CCK-8檢測結果。與其余5組比較，* P < 0.05??圖 11??示MKN28細胞的CCK-8檢測結果。與空白對照-常氧組和空白對照-缺氧組比較，* P < 0.05
2.3.3 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc與pGL4.20-CEAp-Luc載體在SGC7901細胞株中的轉錄活性
雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，經過CoCl2處理24 h后，缺氧組的活性倍數比常氧組升高約1倍（P < 0.05）；而對pGL4.20-CEAp-Luc載體而言，常氧組與缺氧組的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05）。在加入CoCl2條件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體組細胞的轉錄活性高于pGL4.20-CEAp-Luc載體（P < 0.05）；在不加入CoCl2條件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體組細胞的轉錄活性與pGL4.20-CEAp-Luc載體組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 8。該結果提示，在缺氧條件下的SGC7901細胞株中，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體的轉錄活性比pGL4.20-CEAp-Luc載體高。
2.4 細胞感染后的增殖抑制率和RASSF1A蛋白表達結果
Western blot結果顯示：在SGC7901細胞，空白對照組/陰性對照組細胞在常氧和缺氧條件下其RASSF1A蛋白均呈弱表達，差異不明顯；感染組細胞在常氧條件下RASSF1A蛋白呈弱表達，而在缺氧條件下RASSF1A蛋白的表達水平明顯增強，見圖 9。在MKN28細胞，空白對照組、陰性對照組以及感染組細胞在常氧及缺氧條件下均未見RASSF1A蛋白表達的電泳條帶（圖 9）。
CCK-8檢測結果顯示：在SGC7901細胞，與感染-缺氧組比較，其余5組細胞的生長抑制率均較低（P < 0.05），見圖 10。在MKN28細胞，與空白對照-常氧組和空白對照-缺氧組細胞比較，其余4組細胞的生長抑制率均較高（P < 0.05），但該4組細胞間比較差異無統計學意義（P > 0.05），且空白對照-常氧組和空白對照-缺氧組間比較差異也無統計學意義（P > 0.05）。見圖 11。
3 討論
腫瘤的基因治療經過20多年的發展，已取得了一些成績，但仍然無法滿足人類對基因治療的期望值，尚有許多困難需要克服，如治療載體的靶向性、安全性及治療基因的有效性。在本實驗中，筆者構建了5HRE及CEAp雙靶向調控抑癌基因RASSF1A的慢病毒治療載體，通過雙螢光素酶報告基因實驗及CCK-8實驗初步驗證了該治療載體對CEA表達陽性胃癌細胞的靶向性及有效性。
隨著對腫瘤研究的深入，不同的策略被用于腫瘤的基因治療中。低氧微環境是實體瘤的特征，有50%～60%的局部進展期實體瘤內不均勻分布著低氧區域[7]。研究[8-9]表明，氧濃度依賴性的低氧誘導因子1（HIF-1）通過與靶基因順式作用元件中的低氧反應元件（HRE）結合而促進靶基因的轉錄，從而促進惡性腫瘤的發生和發展。利用該特點，不同的團隊[10-12]利用不同拷貝的HRE核心元件作為增強子置于治療基因前面，結果發現在低氧誘導條件下導入治療載體的腫瘤細胞均表現出高表達治療基因的特性。CEA是一類在上皮源性惡性腫瘤組織中高表達的糖蛋白，包括胃癌、結直腸癌、胰腺癌、肺癌等[13-15]。雖然CEAp的啟動活性較弱，但是通過在啟動子前加入增強子后，其能表現出較強的針對CEA陽性腫瘤細胞的靶向性及抗腫瘤活性[16-19]。RASSF1A基因是RAS相關結構域家族成員，位于染色體3p21.3。自2000年首次被報道以來，大量的文獻資料[20-23]表明，RASSF1A基因是一功能強大的抑癌基因，在大多數實體瘤組織中表達缺失，該基因參與細胞微管動力、細胞周期、凋亡、基因組穩定性、細胞遷移、細胞老化等生物學過程。本課題組設想，通過低氧聯合CEAp靶向誘導抑癌基因RASSF1A在CEA陽性腫瘤細胞中的高表達，以實現雙重調控、靶向抑制腫瘤的作用。
首先，本課題組通過qRT-PCR、細胞免疫組織化學染色及Western blot技術檢測了不同細胞株中CEA mRNA及其蛋白，以及RASSF1A蛋白的表達，結果發現：SGC7901細胞株中CEA mRNA及其蛋白的表達水平均高于MKN28及MCF-10A細胞株（P < 0.05），且在SGC7901及MKN28細胞株中未檢測到RASSF1A蛋白的電泳條帶。故依據該結果篩選出CEA mRNA表達陽性及RASSF1A蛋白表達陰性的SGC7901胃癌細胞株為實驗細胞，CEA mRNA表達陰性及RASSF1A蛋白表達陰性的MKN28胃癌細胞株為陰性對照細胞。在調控基因表達實驗方面，本課題組選擇靈敏度相對高、干擾小、結果可靠的雙螢光素酶報告基因檢測系統。結果發現：對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，在SGC7901細胞株中及MKN28細胞株中，同種細胞株內與常氧組比較，缺氧組細胞的活性倍數均升高（P < 0.01），而在MCF-10A細胞株中，常氧組和缺氧組細胞的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05）；在SGC7901細胞株中，經過CoCl2處理24 h后，對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，缺氧組的活性倍數比常氧組明顯升高（P < 0.05），而對GL4.20-CEAp-Luc載體而言，常氧組與缺氧組的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05）。該實驗結果表明，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體具有在低氧條件下調控靶基因在CEA轉錄陽性的腫瘤細胞中高表達的特性，從而使治療靶基因只在低氧的腫瘤微環境下CEA轉錄陽性的腫瘤細胞中高表達成為可能。但奇怪的是，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體在CEA mRNA表達陰性的MKN28細胞株中也表現出低的啟動活性；且免疫組織化學染色結果發現，雖然MKN28細胞中CEA mRNA表達陰性，但CEA蛋白表達陽性，考慮可能是MKN28細胞株中CEA基因的轉錄效率低、降解快而導致檢測不到有關，此外還可能與其復雜的表達調控機理有關[24-25]。此外，梯度實驗結果顯示：CoCl2的最佳濃度為300μmol/L，最佳處理時間是24 h，這種逐漸升高，到達峰值之后再逐漸下降的模式與文獻[26]報道一致，考慮與CoCl2作用時間及濃度依賴的負反饋機理有關。
在接下來的CCK-8實驗中，對SGC7901細胞而言，感染-常氧組細胞表現出最高的生長抑制率（P < 0.05）；而對MKN28細胞而言，陰性對照-常氧組、陰性對照-缺氧組、感染-常氧組及感染-缺氧組間的生長抑制率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。Western blot檢測結果也證實，對SGC7901細胞株而言，感染組細胞在常氧條件下RASSF1A蛋白呈弱表達，而在缺氧條件下RASSF1A蛋白的表達水平明顯增加；而對MKN28細胞株而言，空白對照組、陰性對照組及感染組細胞在常氧及缺氧條件下均未見RASSF1A蛋白表達的電泳條帶。考慮由于CEA基因轉錄能力弱，以及存在復雜的表達調控機理，從而導致感染組的MKN28細胞在缺氧誘導下無RASSF1A蛋白的表達上調。以上實驗結果提示，慢病毒載體pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A在低氧誘導下具有抑制SGC7901胃癌細胞株增殖的能力。
綜上所述，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體具有低氧誘導及CEA靶向性的雙重調控特征；其慢病毒載體pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A通過調控抑癌基因RASSF1A的表達，初步顯示了其具有在低氧誘導下明顯抑制CEA陽性SGC7901胃癌細胞增殖的潛能。本實驗為繼續開展pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A治療載體的體內及體外實驗奠定了實驗基礎。
胃癌是全世界常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康[1-2]。雖然手術、放療、化療等傳統治療胃癌的方法取得了一定的進展，但是其預后仍然不理想。腫瘤的基因治療成為有希望治愈惡性腫瘤的新方法，目前已取得一些進展，但是其靶向性、治療基因表達的持久性及載體的安全性一直是腫瘤基因治療面臨的困難[3]。本實驗構建了5拷貝低氧反應元件（5HRE）聯合癌胚抗原啟動子（CEAp）雙靶向調控元件和調控RAS相關區域家族1A（RASSF1A）基因表達的慢病毒載體，以初步研究其對癌胚抗原（CEA）表達陽性胃癌細胞的靶向性及有效性。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑和設備
前期本課題組[4-5]已構建并保存攜帶5HRE及CEAp DNA片段的載體，RASSF1A基因片段及慢病毒載體均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，胃腺癌細胞株SGC7901、MKN28及乳腺正常腺上皮細胞株MCF-10A均購自中科院上海細胞庫，限制性內切酶、T4DNA連接酶、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、Premix TaqTM試劑盒及RNA逆轉錄試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，質粒提取試劑盒購自美國OMEGA公司，細胞活性檢測試劑盒-8（CCK-8）購自日本同仁化學研究所，DNA Marker和瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，螢光素酶報告基因載體pGL4.20、pGL4.74及雙螢光素酶檢測試劑盒Dual-Glo?LuciferaseAssay System均購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司，細胞培養基RPMI 1640和DMEM/F12均購自美國CORNING公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，RNAfast200-總RNA極速抽提試劑盒購自陜西先鋒生物科技有限公司，鼠抗人RASSF1A單克隆抗體購自美國eBioscience公司，辣根過氧化酶（HRP）標記的羊抗鼠二抗購自Pierce公司，兔抗人CEA多克隆抗體購自美國Proteintech公司，HRP標記的β-actin單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，細胞免疫組織化學SP法檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，CoCl2購自美國SIGMA-ALDRICH公司，TurboFect轉染試劑和顯影劑SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate均購自美國Thermo公司。引物均由上海生工生物有限公司合成，測序由華大科技公司完成。設備主要包括CFX96TM real-time PCR Detection System qPCR儀（美國伯樂公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養和細胞懸液制備
SGC7901和MKN28細胞株均在含10%胎牛血清、100μ/mL青霉素和100μ/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基中培養，MCF-10A細胞株在含15%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μ/mL鏈霉素、10μg/mL胰島素及20 ng/mL表皮生長因子的DMEM/F12培養基中培養。所有細胞株均在37℃、含5% CO2、飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養，每2～3天換液1次。細胞懸液制備：采用90 mm培養皿培養細胞至指數增殖期時，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）換液，再以0.25%胰酶消化液消化至貼壁細胞呈圓形時，用含血清的細胞培養基終止消化并吹打細胞呈單細胞懸液，離心（800 r/min，r=10 cm，5 min）后，以PBS液洗細胞1遍，再以同樣條件離心。計數細胞后，稀釋至1×105個/mL，根據不同的實驗目的，稀釋細胞至不同的密度再接種至細胞培養板。
1.2.2 CEA及RASSF1A表達的檢測
①采用實時定量RT-PCR（qRT-PCR）法檢測3種細胞株中CEA mRNA的表達水平。通過RNAfast200-總RNA極速抽提試劑盒提取細胞的總RNA，具體操作步驟見試劑盒說明書。按逆轉錄說明書操作獲得cDNA（使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，體系如下：5×PrimeScript Buffer 10μL、總RNA 10μL及RNase Free ddH2O 30μL，共50μL），進行qPCR擴增。qPCR擴增采用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，反應體系如下：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，上下游混合引物（20μmol/L）0.5μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 11.0μL，共25μL；擴增條件為：94℃變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，35個循環。CEA引物序列（GenBank?/EMBL提取號碼：NM_004363.2）和β-actin（GenBank?/EMBL提取號碼：NM_001101.3）引物序列見表 1，以β-actin為內參。CEA mRNA的表達水平通過2-ΔΔCt方法計算。每個反應設3個復孔，重復實驗3次，取均值。②采用細胞免疫組織化學SP法檢測3種細胞株中CEA的表達水平。將細胞接種于24孔細胞培養板中，接種密度為5×104個/mL，每孔500μL；3 d后用PBS溶液清洗細胞3次，每次10 min；以4%多聚甲醛固定30 min后按說明書行SP法免疫組織化學染色。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，DAB顯色時間為2 min。當陰性對照結果為陰性時，視檢測結果可信。CEA蛋白的陽性表達主要定位在細胞的細胞膜和細胞漿中，以出現棕黃色顆粒為陽性。用Nikon倒置顯微鏡通過Nikon數碼相機和NIS-Elements D采圖軟件在20倍物鏡下按照同一采集參數拍攝，每孔細胞樣品隨機截取5個不同的陽性部位采集圖像（200倍），其測量均值代表該孔細胞測量值。用Image Pro Plus 6圖像分析軟件隨機選取每張圖像中的陽性細胞簇作為測量區域（area of interesting，AOI），測量該區域的面積。在該區域內通過分色工具測量棕黃色顆粒的積分光密度（integrated option density，IOD），計算平均密度（mean density，MD）。MD=IOD/AOI的面積。MD值代每個單位面積的染色強度，可以較準確地反映陽性產物的濃度。每種細胞設3個復孔，重復實驗3次，取均值。③通過Western blot法[6]檢測3種細胞株中RASSF1A蛋白的表達水平（因條帶結果較明顯，故未定量），以β-actin作為內參。每種細胞設3個復孔，重復實驗3次，取均值。
表1
引物序列
1.2.3 載體構建
①螢光素酶報告基因載體pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc的構建。以載體pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM為模板，采用PCR法擴增CEAp和5HRE-CEAp片段（引物序列見表 1）。反應體系：Premix TaqTM 25μL、cDNA 2μL、混合引物（20μmol/L）1μL、ddH2O 22μL，共50μL。PCR反應條件：94℃變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸7 min。片段經過瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收，通過分子克隆技術將各片段分別插入pGL4.20多克隆位點（操作按試劑盒說明書進行），構建pGL-4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc載體。②慢病毒載體pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A的構建。首先通過PCR法擴增RASSF1A基因片段（引物序列見表 1），通過分子克隆技術將5HRE-CEAp片段與RASSF1A片段連接并插入慢病毒載體的多克隆位點（操作按試劑盒說明書進行）。將構建的載體送華大科技公司測序驗證。
1.2.4 雙螢光素酶報告基因實驗
以含有螢火蟲螢光素酶報告基因的無啟動子載體pGL4.20作為陰性對照，以含有海腎螢光素酶報告基因的載體pGL4.74作為共轉染表達載體〔該載體含單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子（HSV-TKp）〕，以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc載體作為實驗對象。各載體結構見圖 1。首先開展CoCl2的濃度梯度和時間梯度實驗，選擇最佳作用濃度和最佳作用時間（作用細胞為SGC7901細胞株）。在濃度梯度實驗中，以不同濃度的CoCl2（0、100、200、300、400及500μmol/L）作用12 h，結果300μmol/L的活性倍數最高；在時間梯度實驗中，以固定濃度的CoCl2（200μmol/L）作用不同時間（0、4、8、12、24及48 h），結果作用24 h的活性倍數最高。再取對數生長期的細胞株，以5×103個/孔接種于96孔板中，待細胞融合度達70%時，將載體pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc（3種細胞株）、pGL4.20-CEAp-Luc（僅轉染SGC7901細胞株）及pGL4.20（3種細胞株）分別與pGL4.74（30 ng）共轉染細胞（操作按試劑盒說明書進行，載體均為200 ng）。24 h后更換培養基并按設計加（缺氧組）或不加CoCl2（常氧組），CoCl2濃度為200μmol/L（預實驗發現300μmol/L的CoCl2可導致較多的細胞死亡，所以最終選擇200μmol/L），作用時長為24 h。活性倍數的檢測：終止培養后，按照Dual-Glo?Luciferase Assay System試劑盒說明書操作，在酶標儀（510 nm）上檢測螢光素酶活性。為便于比較不同組啟動子的啟動活性，其結果使用活性倍數進行比較。活性倍數=樣本活性比值（螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性）/陰性對照活性比值（螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性）。
圖1
雙螢光素酶報告基因實驗載體的結構示意圖。hRluc：海腎螢光素酶報告基因；Luc：螢火蟲螢光素酶基因
1.2.5 細胞感染
重組慢病毒載體（pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A）及相應空病毒載體均由吉凱公司包裝成病毒顆粒LV-5HC-RASSF1A（感染組）和LV-NC（陰性對照組）。取對數生長期的SGC7901及MKN28細胞，以1×105個/孔接種于96孔板中，培養24 h后感染病毒〔感染復數（MOI）為10〕，操作按試劑盒說明書進行。以未感染任何病毒的細胞作為空白對照組。48 h后根據設計需要加（缺氧組）或不加CoCl2（常氧組），濃度為300μmol/L，作用24 h。每組設3個復孔。在培養24 h后，檢測細胞生長抑制率（操作按CCK-8檢測試劑盒說明書進行），在酶標儀（450 nm波長）上檢測吸光度值（A值）。抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%，其中對照組為不做任何處理的SGC7901及MKN28細胞，實驗組為加或不加CoCl2的細胞（感染或未感染病毒顆粒）。同時采用Western blot法檢測細胞中RASSF1A蛋白的表達水平（方法同上）。
1.3 統計學方法
數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所得實驗結果以均數±標準差（
2 結果
2.1 內源性CEA和RASSF1A的表達結果
qRT-PCR結果顯示，SGC7901細胞株中CEA mRNA的表達水平高于MKN28及MCF-10A細胞株（P < 0.05），而MKN28及MCF-10A細胞株間比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 2。免疫組織化學染色結果顯示：CEA的表達水平在SGC7901、MKN28及MCF-10A細胞株中依次遞減，兩兩比較差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 3和圖 4。Western blot結果顯示，在SGC7901及MKN28細胞株中均未檢測到RASSF1A蛋白的電泳條帶，而在MCF-10A細胞株中可檢測到（圖 5）。依據該結果，本實驗確定SGC7901細胞株為實驗細胞（CEA mRNA表達陽性，RASSF1A蛋白表達陰性），MKN28細胞株為陰性對照細胞（CEA mRNA表達陰性，RASSF1A蛋白表達陰性）。
圖2
示3種細胞株中CEA mRNA表達水平檢測結果。與MKN28和MCF-10A細胞株比較，* P < 0.05??圖 3??示3種細胞株中CEA蛋白表達水平檢測結果。與SGC7901細胞株比較，* P < 0.05；與MKN28細胞株比較，# P < 0.05??圖 4??示3種細胞株中CEA的免疫組織化學染色結果（SP×200）。4A：SGC7901細胞株；4B：MKN28細胞株；4C：MCF-10A細胞株??圖 5??示RASSF1A蛋白的電泳結果。1：SGC7901細胞株；2：MKN28細胞株；3：MCF-10A細胞株
2.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A載體構建
構建的pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A載體經測序均構建成功。
2.3 梯度試驗和雙螢光素酶報告基因實驗結果
2.3.1 以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc轉染SGC7901細胞株后，CoCl2不同作用濃度和不同作用時間的活性倍數結果
在300μmol/L以下，隨CoCl2濃度升高，活性倍數相應升高；而在300μmol/L以上，隨著CoCl2濃度升高，活性倍數下降，見6A。24 h之前，隨著CoCl2作用時間延長，活性倍數相應升高；24 h之后，活性倍數開始下降，見6B。由此確定了300μmol/L為CoCl2的最優濃度，24 h為其最優作用時間。
2.3.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體在SGC7901、MKN28及MCF-10A細胞株中的啟動活性
雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，在SGC7901細胞株及MKN28細胞株中，同種細胞株內與常氧組比較，缺氧組細胞的活性倍數均升高（P < 0.01）；而在MCF-10A細胞株中，常氧組和缺氧組細胞的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 7。在不加入CoCl2條件下，與SGC7901細胞株比較，MKN28及MCF-10A細胞株的活性倍數均較低（P < 0.05）；與MKN28細胞株比較，MCF-10A細胞株的活性倍數較低（P < 0.01），見圖 7。在加入CoCl2條件下，與SGC7901細胞株比較，MKN28及MCF-10A細胞株的活性倍數均較低（P < 0.01）；與MKN28細胞株比較，MCF-10A細胞株的活性倍數較低（P < 0.05），見圖 7。該結果提示，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體具有靶向CEA轉錄陽性細胞及低氧誘導的雙重轉錄調控能力。
圖6
示CoCl2不同濃度（6A）和不同作用時間（6B）的活性倍數結果??圖 7??示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體在3種細胞株中的轉錄活性。同種細胞株內與常氧組比較，* P < 0.01；同種CoCl2條件下與SGC7901細胞株比較，# P < 0.05，## P < 0.01；同種CoCl2條件下與MKN28細胞株比較，△P < 0.05，△△P < 0.01??圖 8??示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc與pGL4.20-CEAp-Luc載體在SGC7901細胞株中的轉錄活性。同種細胞株內與缺氧組比較，* P < 0.05；同種CoCl2條件下與5HRE-CEAp比較，# P < 0.05??圖 9??示SGC7901（9A）和MKN28（9B）細胞株感染慢病毒顆粒后細胞中RASSF1A蛋白表達的電泳結果。1：空白對照組；2：陰性對照組；3：感染組；N：常氧組；H：缺氧組??圖 10??示SGC7901細胞的CCK-8檢測結果。與其余5組比較，* P < 0.05??圖 11??示MKN28細胞的CCK-8檢測結果。與空白對照-常氧組和空白對照-缺氧組比較，* P < 0.05
2.3.3 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc與pGL4.20-CEAp-Luc載體在SGC7901細胞株中的轉錄活性
雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，經過CoCl2處理24 h后，缺氧組的活性倍數比常氧組升高約1倍（P < 0.05）；而對pGL4.20-CEAp-Luc載體而言，常氧組與缺氧組的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05）。在加入CoCl2條件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體組細胞的轉錄活性高于pGL4.20-CEAp-Luc載體（P < 0.05）；在不加入CoCl2條件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體組細胞的轉錄活性與pGL4.20-CEAp-Luc載體組比較差異無統計學意義（P > 0.05），見圖 8。該結果提示，在缺氧條件下的SGC7901細胞株中，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體的轉錄活性比pGL4.20-CEAp-Luc載體高。
2.4 細胞感染后的增殖抑制率和RASSF1A蛋白表達結果
Western blot結果顯示：在SGC7901細胞，空白對照組/陰性對照組細胞在常氧和缺氧條件下其RASSF1A蛋白均呈弱表達，差異不明顯；感染組細胞在常氧條件下RASSF1A蛋白呈弱表達，而在缺氧條件下RASSF1A蛋白的表達水平明顯增強，見圖 9。在MKN28細胞，空白對照組、陰性對照組以及感染組細胞在常氧及缺氧條件下均未見RASSF1A蛋白表達的電泳條帶（圖 9）。
CCK-8檢測結果顯示：在SGC7901細胞，與感染-缺氧組比較，其余5組細胞的生長抑制率均較低（P < 0.05），見圖 10。在MKN28細胞，與空白對照-常氧組和空白對照-缺氧組細胞比較，其余4組細胞的生長抑制率均較高（P < 0.05），但該4組細胞間比較差異無統計學意義（P > 0.05），且空白對照-常氧組和空白對照-缺氧組間比較差異也無統計學意義（P > 0.05）。見圖 11。
3 討論
腫瘤的基因治療經過20多年的發展，已取得了一些成績，但仍然無法滿足人類對基因治療的期望值，尚有許多困難需要克服，如治療載體的靶向性、安全性及治療基因的有效性。在本實驗中，筆者構建了5HRE及CEAp雙靶向調控抑癌基因RASSF1A的慢病毒治療載體，通過雙螢光素酶報告基因實驗及CCK-8實驗初步驗證了該治療載體對CEA表達陽性胃癌細胞的靶向性及有效性。
隨著對腫瘤研究的深入，不同的策略被用于腫瘤的基因治療中。低氧微環境是實體瘤的特征，有50%～60%的局部進展期實體瘤內不均勻分布著低氧區域[7]。研究[8-9]表明，氧濃度依賴性的低氧誘導因子1（HIF-1）通過與靶基因順式作用元件中的低氧反應元件（HRE）結合而促進靶基因的轉錄，從而促進惡性腫瘤的發生和發展。利用該特點，不同的團隊[10-12]利用不同拷貝的HRE核心元件作為增強子置于治療基因前面，結果發現在低氧誘導條件下導入治療載體的腫瘤細胞均表現出高表達治療基因的特性。CEA是一類在上皮源性惡性腫瘤組織中高表達的糖蛋白，包括胃癌、結直腸癌、胰腺癌、肺癌等[13-15]。雖然CEAp的啟動活性較弱，但是通過在啟動子前加入增強子后，其能表現出較強的針對CEA陽性腫瘤細胞的靶向性及抗腫瘤活性[16-19]。RASSF1A基因是RAS相關結構域家族成員，位于染色體3p21.3。自2000年首次被報道以來，大量的文獻資料[20-23]表明，RASSF1A基因是一功能強大的抑癌基因，在大多數實體瘤組織中表達缺失，該基因參與細胞微管動力、細胞周期、凋亡、基因組穩定性、細胞遷移、細胞老化等生物學過程。本課題組設想，通過低氧聯合CEAp靶向誘導抑癌基因RASSF1A在CEA陽性腫瘤細胞中的高表達，以實現雙重調控、靶向抑制腫瘤的作用。
首先，本課題組通過qRT-PCR、細胞免疫組織化學染色及Western blot技術檢測了不同細胞株中CEA mRNA及其蛋白，以及RASSF1A蛋白的表達，結果發現：SGC7901細胞株中CEA mRNA及其蛋白的表達水平均高于MKN28及MCF-10A細胞株（P < 0.05），且在SGC7901及MKN28細胞株中未檢測到RASSF1A蛋白的電泳條帶。故依據該結果篩選出CEA mRNA表達陽性及RASSF1A蛋白表達陰性的SGC7901胃癌細胞株為實驗細胞，CEA mRNA表達陰性及RASSF1A蛋白表達陰性的MKN28胃癌細胞株為陰性對照細胞。在調控基因表達實驗方面，本課題組選擇靈敏度相對高、干擾小、結果可靠的雙螢光素酶報告基因檢測系統。結果發現：對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，在SGC7901細胞株中及MKN28細胞株中，同種細胞株內與常氧組比較，缺氧組細胞的活性倍數均升高（P < 0.01），而在MCF-10A細胞株中，常氧組和缺氧組細胞的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05）；在SGC7901細胞株中，經過CoCl2處理24 h后，對pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體而言，缺氧組的活性倍數比常氧組明顯升高（P < 0.05），而對GL4.20-CEAp-Luc載體而言，常氧組與缺氧組的活性倍數比較差異無統計學意義（P > 0.05）。該實驗結果表明，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體具有在低氧條件下調控靶基因在CEA轉錄陽性的腫瘤細胞中高表達的特性，從而使治療靶基因只在低氧的腫瘤微環境下CEA轉錄陽性的腫瘤細胞中高表達成為可能。但奇怪的是，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體在CEA mRNA表達陰性的MKN28細胞株中也表現出低的啟動活性；且免疫組織化學染色結果發現，雖然MKN28細胞中CEA mRNA表達陰性，但CEA蛋白表達陽性，考慮可能是MKN28細胞株中CEA基因的轉錄效率低、降解快而導致檢測不到有關，此外還可能與其復雜的表達調控機理有關[24-25]。此外，梯度實驗結果顯示：CoCl2的最佳濃度為300μmol/L，最佳處理時間是24 h，這種逐漸升高，到達峰值之后再逐漸下降的模式與文獻[26]報道一致，考慮與CoCl2作用時間及濃度依賴的負反饋機理有關。
在接下來的CCK-8實驗中，對SGC7901細胞而言，感染-常氧組細胞表現出最高的生長抑制率（P < 0.05）；而對MKN28細胞而言，陰性對照-常氧組、陰性對照-缺氧組、感染-常氧組及感染-缺氧組間的生長抑制率比較差異無統計學意義（P > 0.05）。Western blot檢測結果也證實，對SGC7901細胞株而言，感染組細胞在常氧條件下RASSF1A蛋白呈弱表達，而在缺氧條件下RASSF1A蛋白的表達水平明顯增加；而對MKN28細胞株而言，空白對照組、陰性對照組及感染組細胞在常氧及缺氧條件下均未見RASSF1A蛋白表達的電泳條帶。考慮由于CEA基因轉錄能力弱，以及存在復雜的表達調控機理，從而導致感染組的MKN28細胞在缺氧誘導下無RASSF1A蛋白的表達上調。以上實驗結果提示，慢病毒載體pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A在低氧誘導下具有抑制SGC7901胃癌細胞株增殖的能力。
綜上所述，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc載體具有低氧誘導及CEA靶向性的雙重調控特征；其慢病毒載體pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A通過調控抑癌基因RASSF1A的表達，初步顯示了其具有在低氧誘導下明顯抑制CEA陽性SGC7901胃癌細胞增殖的潛能。本實驗為繼續開展pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A治療載體的體內及體外實驗奠定了實驗基礎。
