引用本文： 鐘自彪, 張萌, 熊艷, 王彥峰, 葉啟發. 家兔腦死亡供肝細胞凋亡水平的定量研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 23(1): 22-27. doi: 10.7507/1007-9424.20160006 復制
肝移植是目前治療終末期肝病的最佳選擇[1-2]，目前腦死亡供體（donor after brain death，DBD）已成為供肝來源的有效途徑。然而，DBD器官移植在近期或遠期療效上均較差[3-6]，具體機理不清，可能與血流動力學改變、炎癥因子的釋放、免疫狀態的改變等因素有關[7-8]。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種基本生物現象，細胞凋亡可能通過某些途徑在DBD供肝中發揮作用[9]。本實驗通過制作家兔腦死亡模型[10-11]，檢測腦死亡后不同時間點肝臟細胞凋亡的變化，并應用免疫學方法檢測不同時間點細胞凋亡蛋白caspase 3的表達情況，從而探討家兔腦死亡供肝細胞凋亡水平。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
健康雄性家兔60只，體質量（3.0±0.3）kg，12周齡，實驗動物均飼養于標準實驗條件下（溫度：20～25℃；濕度：50%～70%）。動物的管理及人文關懷均按照1998年中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》 [12]及1996年美國國家科學院制定的《實驗動物關懷及應用指南》執行[13]。
1.1.2 試劑與儀器
動物手術臺（興化市同昌不銹鋼制品廠），JR-1/2智能恒溫控制儀（成都泰盟科技有限公司），BL-420生物技能實驗系統（成都泰盟科技有限公司），HX-100E動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司），Fogarty 3F球囊導管（美國Baxter公司），顱骨鉆（上海醫療器械集團有限公司手術器械廠），鹽酸多巴胺注射液（20 mg/2 mL，批號：1005045，上海禾豐制藥有限公司），紫外分光光度計（上海現科儀器有限公司），臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），電泳儀（北京六一儀器廠），Caspase 3抗體（小鼠來源，碧云天進口分裝），BCA蛋白定量檢測試劑盒及Western blot試劑（碧云天）。
1.2 實驗分組及模型建立
60只雄性家兔隨機編為1～60號，其中1～30號歸為腦死亡組，31～60號歸為假手術組。腦死亡組根據腦死亡時間不同再分為2、6及8 h組，每組10只家兔；假手術組同樣分設2、6及8 h組，每組10只家兔。分別進行相應處理。
1.2.1 腦死亡組
行股動脈插管、氣管插管、顱骨鉆孔置管，并行顱內緩慢間斷加壓至家兔腦死亡，腦死亡標準參照美國神經醫學學會制定的《成人腦死亡診斷指南》 [14]，本實驗家兔腦死亡標準為：①深昏迷，排除麻醉、低體溫等可逆性昏迷的原因；②瞳孔對光反射消失(反復2次)，角膜反射消失；③自主呼吸停止；④腦電圖波動消失。用呼吸機及多巴胺維持腦死亡狀態到實驗對應時間點采集肝臟組織標本備檢。
1.2.2 假手術組
除不行顱內加壓處理外，其他操作同腦死亡組。到實驗對應時間點采集肝臟組織標本。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 肝臟細胞凋亡檢測
采用TUNEL法。分別取腦死亡組和假手術組2、6及8 h肝臟組織的石蠟切片，在二甲苯中脫蠟5～10 min，換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。滴加20 μg/mL不含核酸內切酶（Dnase）的蛋白酶K，20～37 ℃作用15～30 min，磷酸緩沖液（PBS）或平衡鹽溶液（HBSS）洗滌3次，配制TUNEL檢測液。破壞細胞膜后，用適當體積的TdT和dUTP按1 : 9的比例覆蓋細胞于濕盒中37 ℃ 、60 min。然后將切片轉移到含3% H2O2的甲醇中避光20 min。干燥后切片放在coverter-POD中覆蓋組織于濕盒37 ℃、30 min。顯色底物二氨基聯苯胺（diaminobenzidine）顯示出蛋白質的位置。陽性蛋白染色為棕色。細胞核被蘇木精染色。每張切片隨機挑選5個400倍視野進行拍照。拍照時讓組織充滿整個視野。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析，得出每張照片陽性細胞的比率（陽性細胞數/總細胞數）。每組所有照片的平均值代表該組的凋亡細胞比率，用均數±標準差（
1.3.2 免疫印跡法檢測Cleaved-caspase 3蛋白的表達
提取腦死亡組和假手術組2、6及8 h肝臟組織蛋白，按BCA試劑盒說明測定Cleaved-caspase 3蛋白濃度。取等量蛋白樣品用15% SDS-聚丙烯酰氨（SDS-PAGE）凝膠進行電泳，電泳完畢后轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，300 mA、3 h；在含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽溶液（TBST溶液)中37 ℃封閉2 h；分別加入Cleaved-caspase 3、caspase-3、β-actin抗體（1 : 500稀釋），4 ℃過夜；TBST充分洗滌后加入山羊抗兔二抗（1 : 3 000稀釋）室溫作用2 h，TBST再次充分洗滌；用ECL液（一種發光試劑）與膜反應后，X線片壓片曝光。電腦掃描記錄結果的X線片，Image J圖像分析軟件讀取膠片上蛋白條帶的灰度值。灰度比值(Cleaved-caspase 3/caspase-3)的大小代表各實驗組Cleaced-caspase 3蛋白表達量的多少。
1.3.3 免疫組織化學檢測Cleaved-caspase 3蛋白表達
取腦死亡組和假手術組動物2、6及8 h肝臟組織標本經10%甲醛溶液固定、石蠟包埋切片后，常規脫蠟和水化。用3%的H2O2 -甲醇溶液室溫孵育30 min以滅活內源性過氧化物酶，分別加入Cleaved-caspase 3抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，再加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液漂洗后，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，梯度脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性結果即為加入Cleaved-caspase 3抗體。每組內每張切片隨機挑選至少3個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野,保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件，選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準對每張照片進行分析，得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）。以每組所有照片的平均值代表該組的IOD值，用均數±標準差（
1.4 統計學方法
利用SPSS 21.0統計軟件進行數據統計分析。以上數據均利用SPSS 21.0統計軟件進行ANOVA統計分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 模型建立過程中家兔動脈血壓變化情況
所有腦死亡組家兔在誘導腦死亡過程中均出現較一致的血壓變化：誘導腦死亡前（即加壓前）家兔平均動脈壓為（185±12）mm Hg，以開始顱內加壓時計為0 min，在（16±2）min時家兔血壓開始急劇升高，（23±2）min時達到峰值（410±35）mm Hg，（33±4）min血壓急劇下降，（37±2）min時達到谷值（89±18）mm Hg，峰值和谷值與誘導前平均動脈壓比較其差異均有統計學意義（P<0.05）。建模成功的家兔靠機械通氣和多巴胺行呼吸循環支持，于開始顱內加壓后（40±5）min時血壓恢復至80 mmHg以上，之后通過調節多巴胺用量血壓維持在100 mm Hg，所有腦死亡建模成功后的家兔在行呼吸暫停實驗時均出現陽性[11]，撤出呼吸循環支持動物很快死亡。假手術組各時間點血壓變化不大、維持平穩（P>0.05）。具體見表 1。
表1
各組家兔各時間點平均動脈壓的變化(2.2 2組家兔肝細胞凋亡情況檢測結果
圖1
示假手術組肝細胞凋亡情況（TUNEL法 ×400）。1A：2 h；1B：6 h；1C：8 h ??圖 2 示腦死亡組肝細胞凋亡情況（TUNEL法 ×400）。2A：2 h；2B：6 h；2C：8 h
由圖 1及圖 2可見，凋亡細胞核固縮呈棕褐色，為圓形、新月形或不規則形；有的核分解碎裂形成凋亡小體，凋亡細胞如圖中黑色箭頭所示。在腦死亡組，肝細胞凋亡率隨著時間的延長而逐漸增高，腦死亡2 h時肝細胞凋亡率為（5.75±1.04）%，6 h為（11.51±2.18）%，8 h為（14.49±2.81）%。各時相間比較其差異均有統計學意義（P<0.05）；腦死亡組動物各時相的肝細胞凋亡率均高于同時相的假手術組（P<0.05），假手術組2 h為（1.61±0.23）%，6 h為（2.69±0.38）%，8 h為（3.42±0.43）%。具體見圖 3。
圖3
示2組家兔不同時間點肝細胞凋亡水平檢測結果。相同時間點腦死亡組與假手術組相比，*P<0.05；腦死亡組內不同時間點比較，#P<0.05 （n=5） ??圖 4 示免疫印跡法檢測2組家兔不同時間點Cleaved-caspase 3蛋白表達的電泳圖 圖 5 ??示免疫印跡法檢測2組家兔不同時間點Cleaved-caspase 3蛋白表達水平。相同時間點腦死亡組與假手術組相比，*P<0.05；腦死亡組內不同時間點比較，# P<0.05 （n=3）
2.3 免疫印跡法檢測Cleaved-caspase 3蛋白表達結果
結果見圖 4及圖 5。與假手術組相比，腦死亡組各時相cleaved-caspase 3蛋白條帶均明顯增寬，顏色加深，其相對表達量2組間差異具有統計學意義（P<0.05）。且隨著腦死亡時間的延長，可以看出條帶依次增寬，提示腦死亡組cleaved-caspase 3蛋白相對表達量增高，同時隨著時間的延長而依次增高，腦死亡組內各時相間比較差異均具有統計學意義（P<0.05）。
2.4 免疫組織化學檢測Cleaved-caspase 3表達結果
免疫組織化學法分別檢測假手術組和腦死亡組2、6及8 h的肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白的表達情況，如圖 6～圖 8所示，腦死亡組肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白呈陽性表達，且隨著腦死亡時間的延長，肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白相對表達量呈逐漸升高趨勢，組內各時相間的差異具有統計學意義（P<0.05）。與假手術組相比，腦死亡組各時相Cleaved-caspase 3蛋白相對表達量均明顯增高，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖6
示假手術組肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白的表達（免疫組化染色 ×200）。6A：2 h；6B：6 h；6C：8 h ??圖 7示腦死亡組肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白的表達（免疫組化染色 ×200）。7A：2 h；7B：6 h；7C：8 h
圖8
示2組家兔不同時間點肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白表達水平檢測結果。 相同時間點腦死亡組與假手術組相比，*P<0.05；腦死亡組內不同時間點比較，#P<0.05（n=3）
3 討論
細胞凋亡是細胞在一定生理或病理條件下程序性主動死亡的過程。凋亡受多種基因嚴格控制，如bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因p53等，凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系[15-19]。目前DBD已成為緩解移植器官來源短缺的有效途徑，然而，DBD器官移植效果相對較差。研究[20]表明，腦死亡的肝臟都存在細胞凋亡，并且會影響供體的質量以及移植后功能的恢復。DBD肝細胞凋亡的機理很多，如有研究[10]發現，腦死亡組與假手術組供肝存在10種差異蛋白，其中一種差異蛋白—ALDH2與機體物質代謝密切相關，其在腦死亡組中表達明顯降低；ALDH2對氧化應激導致的神經細胞及內皮細胞的損傷具有拮抗作用。通過基因轉導使ALDH2基因高表達可以保護細胞對抗體外化學毒性物質，還能通過抗氧化應激作用對抗細胞凋亡[21-25]。因此，DBD肝臟的ALDH2表達減少從而促進細胞凋亡是一種可能的機理[26-28]，而其具體機理未見進一步報道。同時，還可以從DBD肝臟中與細胞凋亡相關的各種酶和蛋白的表達入手，作為細胞凋亡的指標，來研究這些酶和基因與DBD肝細胞凋亡的關系。
本研究通過建立穩定的家兔腦死亡模型，檢測家兔腦死亡后不同時間點肝臟細胞的凋亡情況，應用TUNEL法、免疫印跡法和免疫組織化學方法分析肝細胞凋亡率和細胞凋亡相關蛋白Cleaved-caspase 3的表達，從而探究家兔腦死亡供肝細胞凋亡水平變化。其結果表明，腦死亡后家兔血壓穩定維持在100 mm Hg左右，需要維持循環（本實驗采用多巴胺泵入）和呼吸機輔助呼吸。通過緩慢間斷顱內加壓法可以建立穩定的家兔腦死亡動物模型。本實驗發現，腦死亡組的肝臟細胞凋亡率明顯高于假手術組，且隨著時間的延長，凋亡率逐漸升高。腦死亡組肝臟組織中細胞凋亡蛋白Cleaved-caspase 3的表達也明顯高于假手術組，也隨著時間的延長而表達增高。該實驗結果表明，腦死亡狀態能誘導肝細胞凋亡，對DBD肝臟功能造成一定損害，可影響肝移植的效果。并且隨著腦死亡時間的延長，肝臟細胞的凋亡率持續上升。因此，細胞凋亡與DBD肝的關系十分密切。
綜上所述，細胞凋亡與DBD肝的關系十分密切，隨著家兔腦死亡時間的延長，細胞凋亡率逐漸增高，從而影響腦死亡供肝的質量。然而，目前國內外尚未見有關細胞凋亡與腦死亡關系機理的研究報道。本研究結果提示，細胞凋亡和DBD肝有一定的聯系，但它們之間的確切關系以及相關的作用機理仍需進一步研究。
肝移植是目前治療終末期肝病的最佳選擇[1-2]，目前腦死亡供體（donor after brain death，DBD）已成為供肝來源的有效途徑。然而，DBD器官移植在近期或遠期療效上均較差[3-6]，具體機理不清，可能與血流動力學改變、炎癥因子的釋放、免疫狀態的改變等因素有關[7-8]。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種基本生物現象，細胞凋亡可能通過某些途徑在DBD供肝中發揮作用[9]。本實驗通過制作家兔腦死亡模型[10-11]，檢測腦死亡后不同時間點肝臟細胞凋亡的變化，并應用免疫學方法檢測不同時間點細胞凋亡蛋白caspase 3的表達情況，從而探討家兔腦死亡供肝細胞凋亡水平。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
健康雄性家兔60只，體質量（3.0±0.3）kg，12周齡，實驗動物均飼養于標準實驗條件下（溫度：20～25℃；濕度：50%～70%）。動物的管理及人文關懷均按照1998年中華人民共和國國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》 [12]及1996年美國國家科學院制定的《實驗動物關懷及應用指南》執行[13]。
1.1.2 試劑與儀器
動物手術臺（興化市同昌不銹鋼制品廠），JR-1/2智能恒溫控制儀（成都泰盟科技有限公司），BL-420生物技能實驗系統（成都泰盟科技有限公司），HX-100E動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司），Fogarty 3F球囊導管（美國Baxter公司），顱骨鉆（上海醫療器械集團有限公司手術器械廠），鹽酸多巴胺注射液（20 mg/2 mL，批號：1005045，上海禾豐制藥有限公司），紫外分光光度計（上海現科儀器有限公司），臺式離心機（上海安亭科學儀器廠），電泳儀（北京六一儀器廠），Caspase 3抗體（小鼠來源，碧云天進口分裝），BCA蛋白定量檢測試劑盒及Western blot試劑（碧云天）。
1.2 實驗分組及模型建立
60只雄性家兔隨機編為1～60號，其中1～30號歸為腦死亡組，31～60號歸為假手術組。腦死亡組根據腦死亡時間不同再分為2、6及8 h組，每組10只家兔；假手術組同樣分設2、6及8 h組，每組10只家兔。分別進行相應處理。
1.2.1 腦死亡組
行股動脈插管、氣管插管、顱骨鉆孔置管，并行顱內緩慢間斷加壓至家兔腦死亡，腦死亡標準參照美國神經醫學學會制定的《成人腦死亡診斷指南》 [14]，本實驗家兔腦死亡標準為：①深昏迷，排除麻醉、低體溫等可逆性昏迷的原因；②瞳孔對光反射消失(反復2次)，角膜反射消失；③自主呼吸停止；④腦電圖波動消失。用呼吸機及多巴胺維持腦死亡狀態到實驗對應時間點采集肝臟組織標本備檢。
1.2.2 假手術組
除不行顱內加壓處理外，其他操作同腦死亡組。到實驗對應時間點采集肝臟組織標本。
1.3 檢測指標及方法
1.3.1 肝臟細胞凋亡檢測
采用TUNEL法。分別取腦死亡組和假手術組2、6及8 h肝臟組織的石蠟切片，在二甲苯中脫蠟5～10 min，換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。滴加20 μg/mL不含核酸內切酶（Dnase）的蛋白酶K，20～37 ℃作用15～30 min，磷酸緩沖液（PBS）或平衡鹽溶液（HBSS）洗滌3次，配制TUNEL檢測液。破壞細胞膜后，用適當體積的TdT和dUTP按1 : 9的比例覆蓋細胞于濕盒中37 ℃ 、60 min。然后將切片轉移到含3% H2O2的甲醇中避光20 min。干燥后切片放在coverter-POD中覆蓋組織于濕盒37 ℃、30 min。顯色底物二氨基聯苯胺（diaminobenzidine）顯示出蛋白質的位置。陽性蛋白染色為棕色。細胞核被蘇木精染色。每張切片隨機挑選5個400倍視野進行拍照。拍照時讓組織充滿整個視野。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析，得出每張照片陽性細胞的比率（陽性細胞數/總細胞數）。每組所有照片的平均值代表該組的凋亡細胞比率，用均數±標準差（
1.3.2 免疫印跡法檢測Cleaved-caspase 3蛋白的表達
提取腦死亡組和假手術組2、6及8 h肝臟組織蛋白，按BCA試劑盒說明測定Cleaved-caspase 3蛋白濃度。取等量蛋白樣品用15% SDS-聚丙烯酰氨（SDS-PAGE）凝膠進行電泳，電泳完畢后轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，300 mA、3 h；在含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽溶液（TBST溶液)中37 ℃封閉2 h；分別加入Cleaved-caspase 3、caspase-3、β-actin抗體（1 : 500稀釋），4 ℃過夜；TBST充分洗滌后加入山羊抗兔二抗（1 : 3 000稀釋）室溫作用2 h，TBST再次充分洗滌；用ECL液（一種發光試劑）與膜反應后，X線片壓片曝光。電腦掃描記錄結果的X線片，Image J圖像分析軟件讀取膠片上蛋白條帶的灰度值。灰度比值(Cleaved-caspase 3/caspase-3)的大小代表各實驗組Cleaced-caspase 3蛋白表達量的多少。
1.3.3 免疫組織化學檢測Cleaved-caspase 3蛋白表達
取腦死亡組和假手術組動物2、6及8 h肝臟組織標本經10%甲醛溶液固定、石蠟包埋切片后，常規脫蠟和水化。用3%的H2O2 -甲醇溶液室溫孵育30 min以滅活內源性過氧化物酶，分別加入Cleaved-caspase 3抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，再加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS緩沖液漂洗后，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，梯度脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，陽性結果即為加入Cleaved-caspase 3抗體。每組內每張切片隨機挑選至少3個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野,保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件，選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統一標準對每張照片進行分析，得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）。以每組所有照片的平均值代表該組的IOD值，用均數±標準差（
1.4 統計學方法
利用SPSS 21.0統計軟件進行數據統計分析。以上數據均利用SPSS 21.0統計軟件進行ANOVA統計分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 模型建立過程中家兔動脈血壓變化情況
所有腦死亡組家兔在誘導腦死亡過程中均出現較一致的血壓變化：誘導腦死亡前（即加壓前）家兔平均動脈壓為（185±12）mm Hg，以開始顱內加壓時計為0 min，在（16±2）min時家兔血壓開始急劇升高，（23±2）min時達到峰值（410±35）mm Hg，（33±4）min血壓急劇下降，（37±2）min時達到谷值（89±18）mm Hg，峰值和谷值與誘導前平均動脈壓比較其差異均有統計學意義（P<0.05）。建模成功的家兔靠機械通氣和多巴胺行呼吸循環支持，于開始顱內加壓后（40±5）min時血壓恢復至80 mmHg以上，之后通過調節多巴胺用量血壓維持在100 mm Hg，所有腦死亡建模成功后的家兔在行呼吸暫停實驗時均出現陽性[11]，撤出呼吸循環支持動物很快死亡。假手術組各時間點血壓變化不大、維持平穩（P>0.05）。具體見表 1。
表1
各組家兔各時間點平均動脈壓的變化(2.2 2組家兔肝細胞凋亡情況檢測結果
圖1
示假手術組肝細胞凋亡情況（TUNEL法 ×400）。1A：2 h；1B：6 h；1C：8 h ??圖 2 示腦死亡組肝細胞凋亡情況（TUNEL法 ×400）。2A：2 h；2B：6 h；2C：8 h
由圖 1及圖 2可見，凋亡細胞核固縮呈棕褐色，為圓形、新月形或不規則形；有的核分解碎裂形成凋亡小體，凋亡細胞如圖中黑色箭頭所示。在腦死亡組，肝細胞凋亡率隨著時間的延長而逐漸增高，腦死亡2 h時肝細胞凋亡率為（5.75±1.04）%，6 h為（11.51±2.18）%，8 h為（14.49±2.81）%。各時相間比較其差異均有統計學意義（P<0.05）；腦死亡組動物各時相的肝細胞凋亡率均高于同時相的假手術組（P<0.05），假手術組2 h為（1.61±0.23）%，6 h為（2.69±0.38）%，8 h為（3.42±0.43）%。具體見圖 3。
圖3
示2組家兔不同時間點肝細胞凋亡水平檢測結果。相同時間點腦死亡組與假手術組相比，*P<0.05；腦死亡組內不同時間點比較，#P<0.05 （n=5） ??圖 4 示免疫印跡法檢測2組家兔不同時間點Cleaved-caspase 3蛋白表達的電泳圖 圖 5 ??示免疫印跡法檢測2組家兔不同時間點Cleaved-caspase 3蛋白表達水平。相同時間點腦死亡組與假手術組相比，*P<0.05；腦死亡組內不同時間點比較，# P<0.05 （n=3）
2.3 免疫印跡法檢測Cleaved-caspase 3蛋白表達結果
結果見圖 4及圖 5。與假手術組相比，腦死亡組各時相cleaved-caspase 3蛋白條帶均明顯增寬，顏色加深，其相對表達量2組間差異具有統計學意義（P<0.05）。且隨著腦死亡時間的延長，可以看出條帶依次增寬，提示腦死亡組cleaved-caspase 3蛋白相對表達量增高，同時隨著時間的延長而依次增高，腦死亡組內各時相間比較差異均具有統計學意義（P<0.05）。
2.4 免疫組織化學檢測Cleaved-caspase 3表達結果
免疫組織化學法分別檢測假手術組和腦死亡組2、6及8 h的肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白的表達情況，如圖 6～圖 8所示，腦死亡組肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白呈陽性表達，且隨著腦死亡時間的延長，肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白相對表達量呈逐漸升高趨勢，組內各時相間的差異具有統計學意義（P<0.05）。與假手術組相比，腦死亡組各時相Cleaved-caspase 3蛋白相對表達量均明顯增高，差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖6
示假手術組肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白的表達（免疫組化染色 ×200）。6A：2 h；6B：6 h；6C：8 h ??圖 7示腦死亡組肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白的表達（免疫組化染色 ×200）。7A：2 h；7B：6 h；7C：8 h
圖8
示2組家兔不同時間點肝臟組織中Cleaved-caspase 3蛋白表達水平檢測結果。 相同時間點腦死亡組與假手術組相比，*P<0.05；腦死亡組內不同時間點比較，#P<0.05（n=3）
3 討論
細胞凋亡是細胞在一定生理或病理條件下程序性主動死亡的過程。凋亡受多種基因嚴格控制，如bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因p53等，凋亡過程的紊亂可能與許多疾病的發生有直接或間接的關系[15-19]。目前DBD已成為緩解移植器官來源短缺的有效途徑，然而，DBD器官移植效果相對較差。研究[20]表明，腦死亡的肝臟都存在細胞凋亡，并且會影響供體的質量以及移植后功能的恢復。DBD肝細胞凋亡的機理很多，如有研究[10]發現，腦死亡組與假手術組供肝存在10種差異蛋白，其中一種差異蛋白—ALDH2與機體物質代謝密切相關，其在腦死亡組中表達明顯降低；ALDH2對氧化應激導致的神經細胞及內皮細胞的損傷具有拮抗作用。通過基因轉導使ALDH2基因高表達可以保護細胞對抗體外化學毒性物質，還能通過抗氧化應激作用對抗細胞凋亡[21-25]。因此，DBD肝臟的ALDH2表達減少從而促進細胞凋亡是一種可能的機理[26-28]，而其具體機理未見進一步報道。同時，還可以從DBD肝臟中與細胞凋亡相關的各種酶和蛋白的表達入手，作為細胞凋亡的指標，來研究這些酶和基因與DBD肝細胞凋亡的關系。
本研究通過建立穩定的家兔腦死亡模型，檢測家兔腦死亡后不同時間點肝臟細胞的凋亡情況，應用TUNEL法、免疫印跡法和免疫組織化學方法分析肝細胞凋亡率和細胞凋亡相關蛋白Cleaved-caspase 3的表達，從而探究家兔腦死亡供肝細胞凋亡水平變化。其結果表明，腦死亡后家兔血壓穩定維持在100 mm Hg左右，需要維持循環（本實驗采用多巴胺泵入）和呼吸機輔助呼吸。通過緩慢間斷顱內加壓法可以建立穩定的家兔腦死亡動物模型。本實驗發現，腦死亡組的肝臟細胞凋亡率明顯高于假手術組，且隨著時間的延長，凋亡率逐漸升高。腦死亡組肝臟組織中細胞凋亡蛋白Cleaved-caspase 3的表達也明顯高于假手術組，也隨著時間的延長而表達增高。該實驗結果表明，腦死亡狀態能誘導肝細胞凋亡，對DBD肝臟功能造成一定損害，可影響肝移植的效果。并且隨著腦死亡時間的延長，肝臟細胞的凋亡率持續上升。因此，細胞凋亡與DBD肝的關系十分密切。
綜上所述，細胞凋亡與DBD肝的關系十分密切，隨著家兔腦死亡時間的延長，細胞凋亡率逐漸增高，從而影響腦死亡供肝的質量。然而，目前國內外尚未見有關細胞凋亡與腦死亡關系機理的研究報道。本研究結果提示，細胞凋亡和DBD肝有一定的聯系，但它們之間的確切關系以及相關的作用機理仍需進一步研究。
