引用本文： 馬競優, 崔喆旭, 李華根, 楊富強, 王巖, 申浩, 劉珍. Notch-1在乳頭狀甲狀腺癌和頸部轉移淋巴結中的表達和臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2017, 24(1): 70-73. doi: 10.7507/1007-9424.201607012 復制
甲狀腺癌是常見的內分泌系統腫瘤，近年來甲狀腺癌發病率呈上升趨勢[1]。其中乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發病率最高，且較早發生淋巴結轉移[2-3]。隨著分子生物學的發展和對腫瘤基因的深入研究，越來越多地集中在腫瘤相關基因的研究。已有研究[4-6]表明，Notch蛋白家族在參與機體的細胞分化、器官發育以及腫瘤的發生發展和侵襲轉移中起重要作用。目前，Notch-1蛋白在PTC中研究較少、且結果尚存爭議，而在頸部轉移淋巴結中的研究國內外鮮有報道。本研究通過檢測Notch-1蛋白在PTC組織和頸部轉移淋巴結（MLN）中的表達，分析和探討Notch-1蛋白的表達和PTC臨床病理因素之間的關系，以更深入地了解兩者在PTC的發生發展和侵襲轉移中的作用，為PTC的淋巴結轉移提供一定的理論基礎，對腫瘤的靶向治療、預后判斷及手術治療提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 標本來源
選取內蒙古民族大學附屬醫院2010年11月至2015年11月期間手術切除的69例PTC患者的癌組織及其癌旁組織和34例MLN組織標本。69例PTC患者中男12例，女57例；年齡19～67歲，平均46.3歲；所選病例術前均未進行放化療，且術后經病理組織學檢查證實為PTC。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期為38例，Ⅲ+Ⅳ期為31例；腫瘤直徑≤2 cm 40例，＞2 cm 29例。手術方式：對于腫瘤直徑小于 1 cm者且無頸部放射、無遠處轉移、無甲狀腺外侵犯、切緣陰性和對側正常者行腺葉切除術+中央區淋巴結清掃術；對于腫瘤直徑＞1 cm或有對側轉移者行甲狀腺全切或次全切除術+中央區淋巴結清掃術；淋巴結陽性或懷疑有頸部淋巴結轉移者行甲狀腺改良根治性頸淋巴結清掃術。
1.2 試劑
Notch-1多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；試劑盒和檸檬酸抗原修復試劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.3 方法和結果判定標準
采用免疫組化SP法，將納入研究的標本制成 4 μm厚的組織切片，常規脫蠟水化。檸檬酸抗原修復，3%H2O2去離子水滅活內源性過氧化物酶，室溫下孵育10 min后；滴加動物非免疫血清，室溫下孵育10 min；除去血清，每張切片滴加Notch-1多克隆抗體一抗，室溫下孵育90 min；滴加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育30 min；DAB鏡下顯色。
Notch-l蛋白表達主要位于癌細胞胞漿和胞核，黃色顆粒為陽性表達[7]。依據半定量積分方法對陽性結果進行判定[8]。每個標本在高倍（×100）光鏡下隨機選取10個視野，計算每個高倍視野中陽性細胞所占的百分比進行評分，陽性細胞數按<10%判定為 0 分，10%～25%判為 1 分，25%～50%判定為 2 分，50%～70%判定為 3 分，>70%判定為 4 分。再根據細胞染色強度進行評分：無色判定為 0 分，黃色判定為 1 分，棕黃色判定為 2 分，棕褐色判定為 3 分。然后將陽性細胞百分率與染色強度兩項積分相乘進行綜合評分：0 分為陰性（–），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中度陽性（++），>8分為強陽性（+++）。合并陰性（–）和弱陽性（+）作為陰性表達標準，中度陽性（++）和強陽性（+++）作為陽性表達標準。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計學分析，采用χ2檢驗對研究結果進行統計學分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同組織中Notch-1蛋白的表達
不同組織中Notch-1蛋白表達免疫組化染色結果見圖 1。在PTC癌組織和MLN組織中，Notch-1蛋白表達陽性率明顯低于癌旁組織，其差異均有統計學意義(P＜0.05)。癌組織與MLN組織比較，Notch-1蛋白表達陽性率的差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 1。
圖1
示Notch-1蛋白在不同甲狀腺組織中表達的光鏡下觀察結果（SP ×100） a：PTC癌組織中Notch-1陽性表達；b：PTC癌組織中Notch-1陰性表達；c：MLN組織中Notch-1陽性表達；d：MLN組織中Notch-1陰性表達；e：PTC癌旁組織中Notch-1陽性表達；f：PTC癌旁組織中Notch-1陰性表達
表1
Notch-1蛋白在不同組織中的表達
2.2 PTC組織中Notch-1蛋白表達與其臨床病理因素之間的關系
在PTC組織中，Notch-1蛋白表達與腫瘤大小及包膜浸潤有關(P＜0. 05)，而與患者年齡、性別、有無淋巴結轉移以及TNM分期無關（P＞0.05）。見表 2。
表2
PTC組織中Notch-1蛋白表達與其臨床病理因素之間的關系
3 討論
Notch受體蛋白影響著細胞發育、增殖、分化等活動[9]，并且參與胚胎發育、腫瘤的發生發展、侵襲轉移等[10-11]。研究[12-14]表明，Notch信號對腫瘤的發生發展起重要的調控作用，在不同的組織可表現為完全相反的促癌或抑癌作用。在宮頸癌中的研究結果[15]顯示，由正常宮頸組織到宮頸上皮內瘤樣病變，再到早期分化好的宮頸癌，Notch-1的表達量逐漸增高，而晚期宮頸癌Notch-1表達水平顯著下降，提示Notch-1在宮頸癌發生早期階段為促癌作用，而晚期表現為抗癌作用。這些研究結果提示，在不同腫瘤組織、甚至是同一腫瘤組織的不同發展階段，Notch-1的作用可能是不同的。本研究發現，在PTC組織中，Notch-1蛋白表達陽性率明顯低于癌旁組織（P＜0.05），提示Notch-1蛋白表達下調可能與PTC的發生發展有關，可能起到抑癌作用；并且PTC組織中Notch-1蛋白陽性表達與PTC的包膜外侵犯有關（P＜0.05），提示Notch-1可能促進腫瘤侵襲轉移，這與既往研究結果[16-17]一致。PTC多發于女性，且較早發生淋巴結轉移[18]。本組病例資料結果顯示，PTC組織中Notch-1蛋白的表達與患者年齡、性別、有無淋巴結轉移及TNM分期無關（P＞0.05），這與Fu等[17]研究結果一致。而Park等[16]的研究結果顯示，PTC的侵襲轉移與淋巴結轉移有關，并且認為Notch-1陽性表達可能成為淋巴結轉移的預測因素。由于本研究納入的樣本量偏少，關于腫瘤大小、淋巴結轉移等危險因素與Notch-1蛋白表達的關系尚需進一步的研究結果來驗證。
PTC較早發生頸部淋巴結轉移，有研究[19-21]發現，腫瘤的淋巴結轉移與某些蛋白的表達有密切關系。邊學[22]利用固相化pH梯度雙相凝膠電泳技術，分離PTC以及LN組織的總蛋白，發現 7 種蛋白在兩種組織中有不同的表達，提示這些蛋白可能通過影響腫瘤細胞的結構與代謝以及腫瘤細胞的侵襲、轉移等不同的途徑參與了PTC的發生與發展。曾令瑞等[23]研究結果表明，與乳腺原發癌干細胞相比，淋巴結轉移癌干細胞中Notch-1處于更高的活化狀態，具有更高的侵襲和轉移能力，提示Notch-1在乳腺癌淋巴結轉移過程中表達增強。而本研究發現，Notch-1蛋白在PTC癌組織和頸部MLN組織中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），提示PTC在淋巴結轉移過程中保持著生物學行為相對穩定，其惡性程度沒有增強。這一研究結果符合分化型甲狀腺癌惡性程度較低、預后較好的生物特性[24-25]。
綜上，Notch-1與惡性腫瘤的發生發展有關。Notch-1蛋白可能在PTC發生發展中起抑癌作用，是否可以使用Notch-1類似物抑制Notch-1信號通路，從而抑制腫瘤的發展或轉移、改善預后，為臨床治療和預防PTC提供新思路。具體的分子作用機制值得進一步研究。
甲狀腺癌是常見的內分泌系統腫瘤，近年來甲狀腺癌發病率呈上升趨勢[1]。其中乳頭狀甲狀腺癌（PTC）發病率最高，且較早發生淋巴結轉移[2-3]。隨著分子生物學的發展和對腫瘤基因的深入研究，越來越多地集中在腫瘤相關基因的研究。已有研究[4-6]表明，Notch蛋白家族在參與機體的細胞分化、器官發育以及腫瘤的發生發展和侵襲轉移中起重要作用。目前，Notch-1蛋白在PTC中研究較少、且結果尚存爭議，而在頸部轉移淋巴結中的研究國內外鮮有報道。本研究通過檢測Notch-1蛋白在PTC組織和頸部轉移淋巴結（MLN）中的表達，分析和探討Notch-1蛋白的表達和PTC臨床病理因素之間的關系，以更深入地了解兩者在PTC的發生發展和侵襲轉移中的作用，為PTC的淋巴結轉移提供一定的理論基礎，對腫瘤的靶向治療、預后判斷及手術治療提供理論依據。
1 資料與方法
1.1 標本來源
選取內蒙古民族大學附屬醫院2010年11月至2015年11月期間手術切除的69例PTC患者的癌組織及其癌旁組織和34例MLN組織標本。69例PTC患者中男12例，女57例；年齡19～67歲，平均46.3歲；所選病例術前均未進行放化療，且術后經病理組織學檢查證實為PTC。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期為38例，Ⅲ+Ⅳ期為31例；腫瘤直徑≤2 cm 40例，＞2 cm 29例。手術方式：對于腫瘤直徑小于 1 cm者且無頸部放射、無遠處轉移、無甲狀腺外侵犯、切緣陰性和對側正常者行腺葉切除術+中央區淋巴結清掃術；對于腫瘤直徑＞1 cm或有對側轉移者行甲狀腺全切或次全切除術+中央區淋巴結清掃術；淋巴結陽性或懷疑有頸部淋巴結轉移者行甲狀腺改良根治性頸淋巴結清掃術。
1.2 試劑
Notch-1多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；試劑盒和檸檬酸抗原修復試劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.3 方法和結果判定標準
采用免疫組化SP法，將納入研究的標本制成 4 μm厚的組織切片，常規脫蠟水化。檸檬酸抗原修復，3%H2O2去離子水滅活內源性過氧化物酶，室溫下孵育10 min后；滴加動物非免疫血清，室溫下孵育10 min；除去血清，每張切片滴加Notch-1多克隆抗體一抗，室溫下孵育90 min；滴加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育30 min；DAB鏡下顯色。
Notch-l蛋白表達主要位于癌細胞胞漿和胞核，黃色顆粒為陽性表達[7]。依據半定量積分方法對陽性結果進行判定[8]。每個標本在高倍（×100）光鏡下隨機選取10個視野，計算每個高倍視野中陽性細胞所占的百分比進行評分，陽性細胞數按<10%判定為 0 分，10%～25%判為 1 分，25%～50%判定為 2 分，50%～70%判定為 3 分，>70%判定為 4 分。再根據細胞染色強度進行評分：無色判定為 0 分，黃色判定為 1 分，棕黃色判定為 2 分，棕褐色判定為 3 分。然后將陽性細胞百分率與染色強度兩項積分相乘進行綜合評分：0 分為陰性（–），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中度陽性（++），>8分為強陽性（+++）。合并陰性（–）和弱陽性（+）作為陰性表達標準，中度陽性（++）和強陽性（+++）作為陽性表達標準。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計學分析，采用χ2檢驗對研究結果進行統計學分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 不同組織中Notch-1蛋白的表達
不同組織中Notch-1蛋白表達免疫組化染色結果見圖 1。在PTC癌組織和MLN組織中，Notch-1蛋白表達陽性率明顯低于癌旁組織，其差異均有統計學意義(P＜0.05)。癌組織與MLN組織比較，Notch-1蛋白表達陽性率的差異無統計學意義(P＞0.05)。見表 1。
圖1
示Notch-1蛋白在不同甲狀腺組織中表達的光鏡下觀察結果（SP ×100） a：PTC癌組織中Notch-1陽性表達；b：PTC癌組織中Notch-1陰性表達；c：MLN組織中Notch-1陽性表達；d：MLN組織中Notch-1陰性表達；e：PTC癌旁組織中Notch-1陽性表達；f：PTC癌旁組織中Notch-1陰性表達
表1
Notch-1蛋白在不同組織中的表達
2.2 PTC組織中Notch-1蛋白表達與其臨床病理因素之間的關系
在PTC組織中，Notch-1蛋白表達與腫瘤大小及包膜浸潤有關(P＜0. 05)，而與患者年齡、性別、有無淋巴結轉移以及TNM分期無關（P＞0.05）。見表 2。
表2
PTC組織中Notch-1蛋白表達與其臨床病理因素之間的關系
3 討論
Notch受體蛋白影響著細胞發育、增殖、分化等活動[9]，并且參與胚胎發育、腫瘤的發生發展、侵襲轉移等[10-11]。研究[12-14]表明，Notch信號對腫瘤的發生發展起重要的調控作用，在不同的組織可表現為完全相反的促癌或抑癌作用。在宮頸癌中的研究結果[15]顯示，由正常宮頸組織到宮頸上皮內瘤樣病變，再到早期分化好的宮頸癌，Notch-1的表達量逐漸增高，而晚期宮頸癌Notch-1表達水平顯著下降，提示Notch-1在宮頸癌發生早期階段為促癌作用，而晚期表現為抗癌作用。這些研究結果提示，在不同腫瘤組織、甚至是同一腫瘤組織的不同發展階段，Notch-1的作用可能是不同的。本研究發現，在PTC組織中，Notch-1蛋白表達陽性率明顯低于癌旁組織（P＜0.05），提示Notch-1蛋白表達下調可能與PTC的發生發展有關，可能起到抑癌作用；并且PTC組織中Notch-1蛋白陽性表達與PTC的包膜外侵犯有關（P＜0.05），提示Notch-1可能促進腫瘤侵襲轉移，這與既往研究結果[16-17]一致。PTC多發于女性，且較早發生淋巴結轉移[18]。本組病例資料結果顯示，PTC組織中Notch-1蛋白的表達與患者年齡、性別、有無淋巴結轉移及TNM分期無關（P＞0.05），這與Fu等[17]研究結果一致。而Park等[16]的研究結果顯示，PTC的侵襲轉移與淋巴結轉移有關，并且認為Notch-1陽性表達可能成為淋巴結轉移的預測因素。由于本研究納入的樣本量偏少，關于腫瘤大小、淋巴結轉移等危險因素與Notch-1蛋白表達的關系尚需進一步的研究結果來驗證。
PTC較早發生頸部淋巴結轉移，有研究[19-21]發現，腫瘤的淋巴結轉移與某些蛋白的表達有密切關系。邊學[22]利用固相化pH梯度雙相凝膠電泳技術，分離PTC以及LN組織的總蛋白，發現 7 種蛋白在兩種組織中有不同的表達，提示這些蛋白可能通過影響腫瘤細胞的結構與代謝以及腫瘤細胞的侵襲、轉移等不同的途徑參與了PTC的發生與發展。曾令瑞等[23]研究結果表明，與乳腺原發癌干細胞相比，淋巴結轉移癌干細胞中Notch-1處于更高的活化狀態，具有更高的侵襲和轉移能力，提示Notch-1在乳腺癌淋巴結轉移過程中表達增強。而本研究發現，Notch-1蛋白在PTC癌組織和頸部MLN組織中的表達差異無統計學意義（P＞0.05），提示PTC在淋巴結轉移過程中保持著生物學行為相對穩定，其惡性程度沒有增強。這一研究結果符合分化型甲狀腺癌惡性程度較低、預后較好的生物特性[24-25]。
綜上，Notch-1與惡性腫瘤的發生發展有關。Notch-1蛋白可能在PTC發生發展中起抑癌作用，是否可以使用Notch-1類似物抑制Notch-1信號通路，從而抑制腫瘤的發展或轉移、改善預后，為臨床治療和預防PTC提供新思路。具體的分子作用機制值得進一步研究。
