引用本文： 鄧大煒, 吳斌, 嚴舒, 張光年, 蘭川, 弋鵬圣, 曾麗娟, 李建水. 肝細胞肝癌 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 基因沉默對奧沙利鉑的化療增敏作用. 中國普外基礎與臨床雜志, 2018, 25(3): 289-295. doi: 10.7507/1007-9424.201708067 復制
中國是肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高發國家，在我國 HCC 的發病率占所有腫瘤的第 4 位，死亡率占所有腫瘤的第 2 位[1]。目前對 HCC 的治療是以手術切除為主，同時聯合肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）及分子靶向藥物的綜合治療，但其5 年生存率仍然只有 30%～40%[2]。HCC 治療效果差的主要原因是對化療藥物不敏感或耐藥[3]。如何提高 HCC 對化療藥物的敏感性及分子靶向藥物的研發是目前研究的熱點。叉頭框蛋白 Q1（forkhead box Q1，FOXQ1）是新發現的叉頭框基因家族的重要成員之一，在許多腫瘤中呈異常高表達，作為原癌基因被人們認識[4]。FOXQ1 基因作為轉錄因子，與多條信號通路交互作用，調控下游靶基因，從而參與腫瘤惡性生物學行為的維持[5]。前期研究[6-8]表明，FOXQ1 基因參與調控 HCC 的侵襲、轉移及血管生成，但沉默 FOXQ1 基因后 HCC 細胞對化療藥物的敏感性如何尚不清楚。本實驗利用 RNA 干擾（RNAi）技術，觀察了 FOXQ1 基因沉默后 SMMC-7721 細胞對化療藥物的敏感性的變化。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑與設備
重組慢病毒（pLKD.CMV.GFP.U6shRNA）為上海紐恩公司產品。人肝癌 SMMC-7721 細胞系由川北醫學院肝膽胰腸研究所提供。主要試劑：Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培養基購于美國 Hyclone 公司，胎牛血清購于美國 Hyclone 公司，胰蛋白酶購于北京鼎國昌盛公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）相關試劑盒及擴增引物均為 Takara 公司產品，Western bolt 相關試劑盒購于上海碧云天公司，FOXQ1 一抗購于 Santa Cruz 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體購于武漢三鷹公司，辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔二抗購于上海生工公司，Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒購于上海銳賽生物技術有限公司，奧沙利鉑（oxaliptin，OXA）化療藥購于揚子江藥業公司，Annexin V-PE 試劑盒購于上海碧云天公司。主要設備：CO2 細胞培養箱（3131）購于美國 Thermo 公司，倒置熒光顯微鏡（LX-71）購于日本 Olympus 公司，qRT-PCR 擴增儀（CFX96）購于美國 Bio-Rad 公司，凝膠圖像分析系統（Fusion FX7）購于法國 VILBER Lour MAT 公司，自動酶標儀（M88）購于美國 Thermo 公司，流式細胞儀（FACSCalibur）購于美國 BD 公司。
1.2 細胞培養
SMMC-7721 細胞用完全培養基 RPMI 1640 加 10% 胎牛血清培養，培養條件為：37 ℃、5% CO2 及常規濕度。
1.3 篩選最佳的重組慢病毒干擾載體
1.3.1 重組慢病毒干擾載體的構建及篩選
慢病毒與 3 種干擾序列以及陰性對照序列的連接、合成、包裝等工序均由上海紐恩公司完成。干擾序列和陰性對照序列見表 1。通過 qRT-PCR 法和 Western blot 法檢測 3 種重組慢病毒載體沉默后 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達（操作見后文），以篩選沉默效果最佳的重組慢病毒載體。
表1
干擾載體和陰性對照序列
1.3.2 細胞分組
本部分實驗將細胞分為 3 組：FOXQ1-shRNA-1 組、FOXQ1-shRNA-2 組及 FOXQ1-shRNA-3 組，每組設 3 個復孔。首先取對數生長期的 SMMC-7721 細胞接種于 6 孔板中（4×105個/孔），細胞貼壁后換液，每孔加入 1 mL 無血清培養基，分別加入 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體、FOXQ1-shRNA-2 重組慢病毒載體及 FOXQ1-shRNA-3 重組慢病毒載體。感染復數（multiplicity of infection，MOI）值為 30，此外每孔加入終濃度為 5 μg/mL 的轉染增敏劑（polybrene），具體轉染操作按試劑盒說明書進行。轉染 8 h 后換液，加入新鮮全培養基繼續培養。72 h 后于熒光顯微鏡下觀察熒光強度并攝像，檢測轉染效率（本實驗為 90%），轉染后的細胞留待后續實驗。
1.3.3 qRT-PCR 法檢測細胞中 FOXQ1 mRNA 的表達
按照說明書進行操作，提取細胞的總 RNA，測定濃度及純度，符合要求后逆轉錄為 cDNA，行擴增反應，擴增條件為：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性5 s，50～60 ℃ 不等退火 30 s，共 40 個循環。擴增體系根據說明書操作，本實驗為 20 μL 體系。各目的基因引物序列如下：GAPDH 基因的正義鏈為 5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，反義鏈為 5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′，擴增產物長度為 132 bp；FOXQ1 基因的正義鏈為 5′-TGATT-TCTTGCTATTGACCGATGC-3′，反義鏈為 5′-GCCC-AAGGAGACCACAGTTAGAG-3′，擴增產物長度為 162 bp。根據 2△△Ct法計算 FOXQ1 mRNA 的相對表達水平。所有實驗重復 3 次（取均值）。
1.3.4 Western blot 法檢測細胞中 FOXQ1 蛋白的表達
首先采用碧云天蛋白抽提試劑盒提取細胞的總蛋白，行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔道上樣量為 40 μg 總蛋白，電泳時間約為 2 h。根據各目的蛋白的分子量切膠，以常規濕法轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以 5% 牛血清白蛋白（BSA）封閉 2 h，加入 FOXQ1 一抗（稀釋比例為 1∶500）/GAPDH 一抗（稀釋比例為 1∶2 000），4 ℃ 孵育過夜；次日清晨復溫 2 h，以 TBST 溶液充分漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為 1∶2 000），37 ℃ 孵育 1 h。以 GAPDH 為內參，采用電化學發光（ECL）染色，用 Quantity One 灰度分析軟件分析，目的蛋白的相對表達水平以目的蛋白的灰度值與 GAPDH 灰度值的比值表示。所有實驗重復 3 次（取均值）。
1.4 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體干擾效果的測定
本部分實驗將細胞分為 3 組：干擾組、陰性對照組及空白對照組，每組設 3 個復孔。干擾組加入 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體（MOI 值為 30），陰性對照組加入陰性對照重組慢病毒載體（MOI 值為 30），具體轉染操作同上。空白對照組未加入任何試劑進行處理。轉染 8 h 后換液，加入新鮮全培養基繼續培養 72 h，之后的轉染率檢測、細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達檢測操作同上。
1.5 藥敏實驗
1.5.1 流式細胞儀檢測 3 組細胞的凋亡率
另取細胞分為 3 組：干擾組、陰性對照組與空白對照組，每組 8 個復孔，轉染的載體類型同上。每組的 8 個復孔中，4 個復孔常規培養 48 h 后檢測細胞凋亡率，4 個復孔加入 OXA（終濃度為 20 μmoL/L）后常規培養 48 h 后再檢測細胞凋亡率。培養的細胞用 0.25% 的胰酶消化后，1 000×g 離心 2 min，收集細胞，用 PBS 溶液清洗 2 次，每次 1 min。采用 Annexin V-PE 試劑盒檢測細胞凋亡率，細胞染色后避光孵育 15 min，上流式細胞儀檢測。采用累積曲線分割法計算各期細胞所占比例。所有實驗重復3 次（取均值）。
1.5.2 CCK8 法檢測細胞活力
細胞活力實驗的分組、復孔數量、接受 OXA 處理的復孔數量及 OXA 濃度設置同1.5.1。處理 48 h后，每孔更換新培養基 100 μL，再加入 CCK8 10 μL，繼續培養 1 h，以酶標儀（450 nm 波長）檢測各孔的吸光度（A）值。取空白對照組細胞為空白對照孔，其細胞活力記為 1，通過與空白對照孔比較計算各組及加入藥物處理后的細胞活力。實驗重復 3 次（取均值）。
1.6 統計學方法
應用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多組間的均數比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用 Student-t 檢驗）或析因設計的方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 FOXQ1-shRNA 重組慢病毒載體的篩選結果
qRT-PCR 檢測結果和 Western blot 結果顯示，FOXQ1-shRNA-1 組細胞中 FOXQ1-1 mRNA 及其蛋白的表達水平均低于 FOXQ1-shRNA-2 組和 FOXQ1-shRNA-3 組（P<0.05），見圖 1，提示 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體的沉默效果最好，故后續實驗選擇 FOXQ1-shRNA-1重組慢病毒載體為干擾載體，用以轉染 SMMC-7721 細胞。
圖1
示 3 種重組慢病毒載體沉默后 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 分子的表達
a： FOXQ1 mRNA 的相對表達水平，與 FOXQ1-shRNA-1 組比較，*
2.2 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體的干擾效果
2.2.1 轉染效果
轉染 72 h 后，干擾組和陰性對照組的 SMMC-7721 細胞均有綠色熒光蛋白表達（圖 2）。
圖2
示干擾組（a）和陰性對照組（b）的 SMMC-7721 細胞均見綠色熒光蛋白表達（熒光顯微鏡 ×200）
2.2.2 干擾組、陰性對照組及空白對照組細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達
干擾組細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達水平均低于陰性對照組和空白對照組（P<0.05），但陰性對照組和空白對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05），具體見圖 3和圖 4。
圖3
示空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞中FOXQ1 mRNA的相對表達水平
與干擾組比較，*
2.3 藥敏實驗結果
2.3.1 細胞凋亡率檢測結果
析因設計的方差分析結果表明，組別與 OXA 間存在交互作用（P<0.05）。不管是在加入 OXA 條件下，還是在未加入 OXA 條件下，干擾組細胞的凋亡率均高于陰性對照組與空白對照組（P<0.05），但同條件下陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；在干擾組、陰性對照組和空白對照組中，均是加入 OXA 組的細胞凋亡率高于未加入 OXA 組（P<0.05）。具體見圖 5 和表 2。
圖5
示 6 組 SMMC-7721 細胞的凋亡率
a：空白對照組；b：陰性對照組；c：干擾組；d：空白對照+OXA 組；e：陰性對照+OXA 組；f：干擾+OXA 組
圖4
示空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞中 FOXQ1 蛋白的表達結果
a：電泳結果；b：相對表達水平，與干擾組比較，*
表2
細胞凋亡率檢測結果（%，
，n=4）
2.3.2 細胞活力檢測結果
析因設計的方差分析結果表明，組別與 OXA 間存在交互作用（P<0.05）。不管是在加入 OXA 條件下，還是在未加入 OXA 條件下，干擾組的細胞生長活力均低于陰性對照組與空白對照組（P<0.05），但同條件下陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。在干擾組、陰性對照組和空白對照組中，均是加入 OXA 組的細胞活力低于未加入 OXA 組（P<0.05）。見表 3。
表3
細胞活力檢測結果（%，
，n=4）
3 討論
系統性化療、TACE 及分子靶向治療是治療 HCC 與鞏固手術療效的重要方法[9-10]。OXA 屬于第 3 代金屬鉑類絡合物，以 DNA 為靶作用部位，被廣泛應用于 HCC 的治療中[11-12]。目前傳統化療聯合基因治療逐漸成為臨床治療 HCC 的趨勢，如索拉菲尼聯合 OXA 等治療正大量應用于臨床，并取得了較好的效果[13-15]。但是，腫瘤的耐藥以及大劑量藥物導致的肝功能衰竭進而失去再治療機會，均極大地限制了化療藥物的廣泛應用[16-18]。因此，研究如何提高化療的敏感性以及減少藥物導致的毒副作用具有重要的意義[17, 19]。
FOXQ1 基因異常高表達于多種腫瘤中，它可以通過基因擴增、整合、染色體異位和轉錄調控來參與腫瘤的形成及惡性生物學行為[20-22]。相關研究[23]表明，FOXQ1 分子參與調節胰腺癌干細胞的自我更新與對化療藥物的敏感性。Kaneda 等[24]對肺癌細胞的研究表明，FOXQ1 分子的表達影響了腫瘤對阿霉素和羥基喜樹堿的敏感性。因此在 HCC 中， FOXQ1 分子對調控化療藥物敏感性的作用有待進一步研究。
為了探討肝癌細胞系 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 分子的表達對細胞凋亡的影響，本實驗利用 RNAi 技術，沉默了 FOXQ1 基因的表達，結果發現，FOXQ1 基因沉默后 SMMC-7721 細胞的凋亡率增加，說明高表達 FOXQ1 mRNA 具有抑制腫瘤細胞凋亡的作用。FOXQ1 基因調控凋亡的機制可能是，其作為原癌基因，表達被抑制后，減少了對腫瘤細胞凋亡的異常調控。為了明確沉默 FOXQ1 基因后 SMMC-7721 細胞對化療藥物敏感性的變化，本研究觀察了 FOXQ1 基因沉默后 SMMC-7721 細胞對 OXA 敏感性的變化，結果發現，不管是在加入 OXA 條件下還是在未加入 OXA 條件下，與空白對照組和陰性對照組比較，干擾組的細胞活力明顯降低、凋亡率顯著增加，其結果提示：干擾組的細胞對 OXA 表現出更高的藥物敏感性。FOXQ1 基因沉默聯合 OXA 的抗腫瘤效應明顯強于僅行 FOXQ1 基因沉默或單用 OXA 組，這表明 FOXQ1 基因沉默可能會增加 HCC 對化療藥物的敏感性。FOXQ1 mRNA 作為轉錄因子，可能通過調控相關靶基因來調控腫瘤對化療藥物的敏感性，但其具體調控機制有待進一步研究。
綜上所述，沉默 FOXQ1 基因的表達能夠有效誘導 SMMC-7721 細胞凋亡，并增強其對 OXA 的化療敏感性，這為臨床提高 HCC 藥物的療效提供了實驗與理論依據，值得進一步探索。
中國是肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的高發國家，在我國 HCC 的發病率占所有腫瘤的第 4 位，死亡率占所有腫瘤的第 2 位[1]。目前對 HCC 的治療是以手術切除為主，同時聯合肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）及分子靶向藥物的綜合治療，但其5 年生存率仍然只有 30%～40%[2]。HCC 治療效果差的主要原因是對化療藥物不敏感或耐藥[3]。如何提高 HCC 對化療藥物的敏感性及分子靶向藥物的研發是目前研究的熱點。叉頭框蛋白 Q1（forkhead box Q1，FOXQ1）是新發現的叉頭框基因家族的重要成員之一，在許多腫瘤中呈異常高表達，作為原癌基因被人們認識[4]。FOXQ1 基因作為轉錄因子，與多條信號通路交互作用，調控下游靶基因，從而參與腫瘤惡性生物學行為的維持[5]。前期研究[6-8]表明，FOXQ1 基因參與調控 HCC 的侵襲、轉移及血管生成，但沉默 FOXQ1 基因后 HCC 細胞對化療藥物的敏感性如何尚不清楚。本實驗利用 RNA 干擾（RNAi）技術，觀察了 FOXQ1 基因沉默后 SMMC-7721 細胞對化療藥物的敏感性的變化。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑與設備
重組慢病毒（pLKD.CMV.GFP.U6shRNA）為上海紐恩公司產品。人肝癌 SMMC-7721 細胞系由川北醫學院肝膽胰腸研究所提供。主要試劑：Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培養基購于美國 Hyclone 公司，胎牛血清購于美國 Hyclone 公司，胰蛋白酶購于北京鼎國昌盛公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）相關試劑盒及擴增引物均為 Takara 公司產品，Western bolt 相關試劑盒購于上海碧云天公司，FOXQ1 一抗購于 Santa Cruz 公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體購于武漢三鷹公司，辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔二抗購于上海生工公司，Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒購于上海銳賽生物技術有限公司，奧沙利鉑（oxaliptin，OXA）化療藥購于揚子江藥業公司，Annexin V-PE 試劑盒購于上海碧云天公司。主要設備：CO2 細胞培養箱（3131）購于美國 Thermo 公司，倒置熒光顯微鏡（LX-71）購于日本 Olympus 公司，qRT-PCR 擴增儀（CFX96）購于美國 Bio-Rad 公司，凝膠圖像分析系統（Fusion FX7）購于法國 VILBER Lour MAT 公司，自動酶標儀（M88）購于美國 Thermo 公司，流式細胞儀（FACSCalibur）購于美國 BD 公司。
1.2 細胞培養
SMMC-7721 細胞用完全培養基 RPMI 1640 加 10% 胎牛血清培養，培養條件為：37 ℃、5% CO2 及常規濕度。
1.3 篩選最佳的重組慢病毒干擾載體
1.3.1 重組慢病毒干擾載體的構建及篩選
慢病毒與 3 種干擾序列以及陰性對照序列的連接、合成、包裝等工序均由上海紐恩公司完成。干擾序列和陰性對照序列見表 1。通過 qRT-PCR 法和 Western blot 法檢測 3 種重組慢病毒載體沉默后 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達（操作見后文），以篩選沉默效果最佳的重組慢病毒載體。
表1
干擾載體和陰性對照序列
1.3.2 細胞分組
本部分實驗將細胞分為 3 組：FOXQ1-shRNA-1 組、FOXQ1-shRNA-2 組及 FOXQ1-shRNA-3 組，每組設 3 個復孔。首先取對數生長期的 SMMC-7721 細胞接種于 6 孔板中（4×105個/孔），細胞貼壁后換液，每孔加入 1 mL 無血清培養基，分別加入 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體、FOXQ1-shRNA-2 重組慢病毒載體及 FOXQ1-shRNA-3 重組慢病毒載體。感染復數（multiplicity of infection，MOI）值為 30，此外每孔加入終濃度為 5 μg/mL 的轉染增敏劑（polybrene），具體轉染操作按試劑盒說明書進行。轉染 8 h 后換液，加入新鮮全培養基繼續培養。72 h 后于熒光顯微鏡下觀察熒光強度并攝像，檢測轉染效率（本實驗為 90%），轉染后的細胞留待后續實驗。
1.3.3 qRT-PCR 法檢測細胞中 FOXQ1 mRNA 的表達
按照說明書進行操作，提取細胞的總 RNA，測定濃度及純度，符合要求后逆轉錄為 cDNA，行擴增反應，擴增條件為：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性5 s，50～60 ℃ 不等退火 30 s，共 40 個循環。擴增體系根據說明書操作，本實驗為 20 μL 體系。各目的基因引物序列如下：GAPDH 基因的正義鏈為 5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′，反義鏈為 5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′，擴增產物長度為 132 bp；FOXQ1 基因的正義鏈為 5′-TGATT-TCTTGCTATTGACCGATGC-3′，反義鏈為 5′-GCCC-AAGGAGACCACAGTTAGAG-3′，擴增產物長度為 162 bp。根據 2△△Ct法計算 FOXQ1 mRNA 的相對表達水平。所有實驗重復 3 次（取均值）。
1.3.4 Western blot 法檢測細胞中 FOXQ1 蛋白的表達
首先采用碧云天蛋白抽提試劑盒提取細胞的總蛋白，行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔道上樣量為 40 μg 總蛋白，電泳時間約為 2 h。根據各目的蛋白的分子量切膠，以常規濕法轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以 5% 牛血清白蛋白（BSA）封閉 2 h，加入 FOXQ1 一抗（稀釋比例為 1∶500）/GAPDH 一抗（稀釋比例為 1∶2 000），4 ℃ 孵育過夜；次日清晨復溫 2 h，以 TBST 溶液充分漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為 1∶2 000），37 ℃ 孵育 1 h。以 GAPDH 為內參，采用電化學發光（ECL）染色，用 Quantity One 灰度分析軟件分析，目的蛋白的相對表達水平以目的蛋白的灰度值與 GAPDH 灰度值的比值表示。所有實驗重復 3 次（取均值）。
1.4 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體干擾效果的測定
本部分實驗將細胞分為 3 組：干擾組、陰性對照組及空白對照組，每組設 3 個復孔。干擾組加入 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體（MOI 值為 30），陰性對照組加入陰性對照重組慢病毒載體（MOI 值為 30），具體轉染操作同上。空白對照組未加入任何試劑進行處理。轉染 8 h 后換液，加入新鮮全培養基繼續培養 72 h，之后的轉染率檢測、細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達檢測操作同上。
1.5 藥敏實驗
1.5.1 流式細胞儀檢測 3 組細胞的凋亡率
另取細胞分為 3 組：干擾組、陰性對照組與空白對照組，每組 8 個復孔，轉染的載體類型同上。每組的 8 個復孔中，4 個復孔常規培養 48 h 后檢測細胞凋亡率，4 個復孔加入 OXA（終濃度為 20 μmoL/L）后常規培養 48 h 后再檢測細胞凋亡率。培養的細胞用 0.25% 的胰酶消化后，1 000×g 離心 2 min，收集細胞，用 PBS 溶液清洗 2 次，每次 1 min。采用 Annexin V-PE 試劑盒檢測細胞凋亡率，細胞染色后避光孵育 15 min，上流式細胞儀檢測。采用累積曲線分割法計算各期細胞所占比例。所有實驗重復3 次（取均值）。
1.5.2 CCK8 法檢測細胞活力
細胞活力實驗的分組、復孔數量、接受 OXA 處理的復孔數量及 OXA 濃度設置同1.5.1。處理 48 h后，每孔更換新培養基 100 μL，再加入 CCK8 10 μL，繼續培養 1 h，以酶標儀（450 nm 波長）檢測各孔的吸光度（A）值。取空白對照組細胞為空白對照孔，其細胞活力記為 1，通過與空白對照孔比較計算各組及加入藥物處理后的細胞活力。實驗重復 3 次（取均值）。
1.6 統計學方法
應用 SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多組間的均數比較采用單因素方差分析（兩兩比較采用 Student-t 檢驗）或析因設計的方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 FOXQ1-shRNA 重組慢病毒載體的篩選結果
qRT-PCR 檢測結果和 Western blot 結果顯示，FOXQ1-shRNA-1 組細胞中 FOXQ1-1 mRNA 及其蛋白的表達水平均低于 FOXQ1-shRNA-2 組和 FOXQ1-shRNA-3 組（P<0.05），見圖 1，提示 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體的沉默效果最好，故后續實驗選擇 FOXQ1-shRNA-1重組慢病毒載體為干擾載體，用以轉染 SMMC-7721 細胞。
圖1
示 3 種重組慢病毒載體沉默后 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 分子的表達
a： FOXQ1 mRNA 的相對表達水平，與 FOXQ1-shRNA-1 組比較，*
2.2 FOXQ1-shRNA-1 重組慢病毒載體的干擾效果
2.2.1 轉染效果
轉染 72 h 后，干擾組和陰性對照組的 SMMC-7721 細胞均有綠色熒光蛋白表達（圖 2）。
圖2
示干擾組（a）和陰性對照組（b）的 SMMC-7721 細胞均見綠色熒光蛋白表達（熒光顯微鏡 ×200）
2.2.2 干擾組、陰性對照組及空白對照組細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達
干擾組細胞中 FOXQ1 mRNA 及其蛋白的表達水平均低于陰性對照組和空白對照組（P<0.05），但陰性對照組和空白對照組比較差異均無統計學意義（P>0.05），具體見圖 3和圖 4。
圖3
示空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞中FOXQ1 mRNA的相對表達水平
與干擾組比較，*
2.3 藥敏實驗結果
2.3.1 細胞凋亡率檢測結果
析因設計的方差分析結果表明，組別與 OXA 間存在交互作用（P<0.05）。不管是在加入 OXA 條件下，還是在未加入 OXA 條件下，干擾組細胞的凋亡率均高于陰性對照組與空白對照組（P<0.05），但同條件下陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；在干擾組、陰性對照組和空白對照組中，均是加入 OXA 組的細胞凋亡率高于未加入 OXA 組（P<0.05）。具體見圖 5 和表 2。
圖5
示 6 組 SMMC-7721 細胞的凋亡率
a：空白對照組；b：陰性對照組；c：干擾組；d：空白對照+OXA 組；e：陰性對照+OXA 組；f：干擾+OXA 組
圖4
示空白對照組、陰性對照組和干擾組細胞中 FOXQ1 蛋白的表達結果
a：電泳結果；b：相對表達水平，與干擾組比較，*
表2
細胞凋亡率檢測結果（%，
，n=4）
2.3.2 細胞活力檢測結果
析因設計的方差分析結果表明，組別與 OXA 間存在交互作用（P<0.05）。不管是在加入 OXA 條件下，還是在未加入 OXA 條件下，干擾組的細胞生長活力均低于陰性對照組與空白對照組（P<0.05），但同條件下陰性對照組和空白對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。在干擾組、陰性對照組和空白對照組中，均是加入 OXA 組的細胞活力低于未加入 OXA 組（P<0.05）。見表 3。
表3
細胞活力檢測結果（%，
，n=4）
3 討論
系統性化療、TACE 及分子靶向治療是治療 HCC 與鞏固手術療效的重要方法[9-10]。OXA 屬于第 3 代金屬鉑類絡合物，以 DNA 為靶作用部位，被廣泛應用于 HCC 的治療中[11-12]。目前傳統化療聯合基因治療逐漸成為臨床治療 HCC 的趨勢，如索拉菲尼聯合 OXA 等治療正大量應用于臨床，并取得了較好的效果[13-15]。但是，腫瘤的耐藥以及大劑量藥物導致的肝功能衰竭進而失去再治療機會，均極大地限制了化療藥物的廣泛應用[16-18]。因此，研究如何提高化療的敏感性以及減少藥物導致的毒副作用具有重要的意義[17, 19]。
FOXQ1 基因異常高表達于多種腫瘤中，它可以通過基因擴增、整合、染色體異位和轉錄調控來參與腫瘤的形成及惡性生物學行為[20-22]。相關研究[23]表明，FOXQ1 分子參與調節胰腺癌干細胞的自我更新與對化療藥物的敏感性。Kaneda 等[24]對肺癌細胞的研究表明，FOXQ1 分子的表達影響了腫瘤對阿霉素和羥基喜樹堿的敏感性。因此在 HCC 中， FOXQ1 分子對調控化療藥物敏感性的作用有待進一步研究。
為了探討肝癌細胞系 SMMC-7721 細胞中 FOXQ1 分子的表達對細胞凋亡的影響，本實驗利用 RNAi 技術，沉默了 FOXQ1 基因的表達，結果發現，FOXQ1 基因沉默后 SMMC-7721 細胞的凋亡率增加，說明高表達 FOXQ1 mRNA 具有抑制腫瘤細胞凋亡的作用。FOXQ1 基因調控凋亡的機制可能是，其作為原癌基因，表達被抑制后，減少了對腫瘤細胞凋亡的異常調控。為了明確沉默 FOXQ1 基因后 SMMC-7721 細胞對化療藥物敏感性的變化，本研究觀察了 FOXQ1 基因沉默后 SMMC-7721 細胞對 OXA 敏感性的變化，結果發現，不管是在加入 OXA 條件下還是在未加入 OXA 條件下，與空白對照組和陰性對照組比較，干擾組的細胞活力明顯降低、凋亡率顯著增加，其結果提示：干擾組的細胞對 OXA 表現出更高的藥物敏感性。FOXQ1 基因沉默聯合 OXA 的抗腫瘤效應明顯強于僅行 FOXQ1 基因沉默或單用 OXA 組，這表明 FOXQ1 基因沉默可能會增加 HCC 對化療藥物的敏感性。FOXQ1 mRNA 作為轉錄因子，可能通過調控相關靶基因來調控腫瘤對化療藥物的敏感性，但其具體調控機制有待進一步研究。
綜上所述，沉默 FOXQ1 基因的表達能夠有效誘導 SMMC-7721 細胞凋亡，并增強其對 OXA 的化療敏感性，這為臨床提高 HCC 藥物的療效提供了實驗與理論依據，值得進一步探索。
