引用本文： 董博文, 李子一, 李偉東, 代文杰. 雙硫侖聯合銅離子對樂伐替尼耐藥肝癌細胞 Huh7 增殖及凋亡的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2020, 27(2): 168-172. doi: 10.7507/1007-9424.201906108 復制
肝細胞肝癌（簡稱“肝癌”）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一[1]。大多數肝癌患者的診斷都在晚期，復發率高，預后不良[2]。隨著對肝癌病因學研究的不斷深入，已研制出了針對肝癌特異性途徑的靶向治療藥物。樂伐替尼作為可以替代索拉非尼的靶向治療藥為肝癌患者帶來了新的希望[3-5]。樂伐替尼是一種口服酪氨酸激酶受體抑制劑，其機制主要是抑制血管內皮生長因子受體 1–3（vascular endothelial growth factor receptors 1–3，VEGFR1–3）、成纖維細胞生長因子受體 1–4（fibroblast growth factor receptors 1–4，FGFR1–4）、c-Kit 蛋白和 RET 蛋白[4, 6-9]。樂伐替尼作為替代索拉非尼的靶向化療藥物，同索拉非尼一樣，隨著臨床的廣泛應用也會出現耐藥性等問題。雙硫侖作為一種廉價、安全的藥物，在乙醇依賴患者中展現了很好的療效，且發現其聯合銅離子在抗腫瘤方面展現了很好的效果[10-13]。本研究主要針對雙硫侖聯合銅離子對樂伐替尼肝癌耐藥細胞系 Huh7 抑制率及凋亡率的影響并探討其相關機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
Huh7 細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），樂伐替尼（濟南精合生物有限公司），雙硫侖（鎮江天茂生物科技有限公司），銅離子（美國 GNC），胰蛋白酶消化液、DMEM 培養基（賽默飛世爾儀器有限公司），胎牛血清（Science Cell），CCK8 檢測試劑盒（東仁化學科技有限公司），流式細胞凋亡檢測試劑盒（四正柏生物科技有限公司，FXP018-100），青霉素鏈霉素雙抗、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠配置試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Akt（CST 公司，9272），磷酸化 Akt（phospho-protein kinase B，p-Akt，CST 公司，4058，ser473），Cleaved-caspase-9（CST 公司，9505），Bcl-2（CST 公司，15071），β-Actin（上海碧云天生物技術有限公司，AF0003），山羊抗小鼠 IgG 二抗（LI-COR 公司，92568020）、山羊抗兔 IgG 二抗（LI-COR 公司，92568021），Akt 抑制劑 MK2206（MCE 公司），酶標儀（Biotek 公司），Western blot 紅外掃描儀（美國 LI-COR 公司），流式細胞儀（美國 BD 公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
選擇 Huh7 細胞系，培養基為 DMEM，10% 胎牛血清及 1% 的 10 000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 鏈霉素。細胞置于 37 ℃ 恒溫 5% CO2 培養箱中培養，取對數生長期細胞傳代進行下一步實驗。
1.2.2 檢測 Huh7 細胞半抑制濃度（50% inhibitor concentration，IC50）
按每孔 3 000 個細胞分別種于 96 孔板中，放置于 37 ℃ 5% CO2 培養箱中培養過夜，待細胞完全貼壁后吸出培養液準備加藥。樂伐替尼濃度設置分別為 10、20、40、60、80 及 160 μmol/L，每個濃度梯度設置 3 個復孔，作用 48 h 后，按 10∶1 體積加入 CCK8 檢測試劑培養 3 h 后置于酶標儀中 450 nm 波長檢測每孔吸光值，使用 GraphPad 軟件計算 IC50。
1.2.3 樂伐替尼耐藥 Huh7 細胞株的建立
先用樂伐替尼 IC50 的十分之一濃度誘導細胞耐藥，每次提高 0.4 μmol/L 樂伐替尼濃度，每兩周檢測細胞 IC50 濃度以觀察細胞耐藥性，經 4 個月培養，最終細胞在樂伐替尼 10 μmol/L 下穩定生長以確定樂伐替尼肝癌 Huh7 耐藥細胞株的成功建立。
1.2.4 CCK8 法檢測各組細胞存活率
各組細胞處理：① 對照組為 Huh7 細胞加普通培養液培養后的細胞；② 敏感組為 Huh7 細胞加 10 μmol/L 樂伐替尼培養后的細胞；③ 耐藥組為 Huh7 耐藥細胞加 10 μmol/L 樂伐替尼培養后的細胞；④ 聯合組為樂伐替尼 10 μmol/L+雙硫侖 1 μmol/L+0.5 μmol/L 銅離子培養的耐藥 Huh7 細胞；⑤ 抑制劑組為 10 μmol/L 樂伐替尼+10 μmol/L Akt 抑制劑 MK2206 培養的耐藥 Huh7 細胞。各組細胞按每孔 3 000 個細胞種于 96 孔板中，設置 3 個復孔，待細胞完全貼壁吸出培養液準備加藥，各組細胞作用 48 h 后，每孔按 10∶1 體積加入 CCK8 檢測試劑后細胞繼續培養 3 h 后于 450 nm 波長檢測每孔吸光度值，使用 GraphPad 軟件計算各組細胞存活率。
1.2.5 Western blot 法檢測各組細胞中 p-Akt、caspase-9、Bcl-2 蛋白的表達
將對照組、耐藥組、聯合組及抑制劑組細胞分別種于 6 孔板中，待細胞長到 6 孔板 80% 的密度時吸出培養液，PBS 洗 3 次后加入 80 μL 含磷酸酶蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，用細胞鏟刮下細胞 15 000×g 4 ℃ 離心 10 min 后取上清用 BCA 法進行蛋白濃度檢測。SDS-PAGE 膠中每孔蛋白上樣量 40 μg，電泳后濕轉法轉移至 NC 膜上，封閉 1 h 后加入一抗孵育過夜，PBST 洗 3 次，二抗孵育 1 h，PBST 洗 3 次后上紅外掃描儀顯影檢測灰度值。
1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡
收集對照組、耐藥組及聯合組細胞，按每孔 1.5×105個細胞分別種于 6 孔板中，培養過夜后待細胞完全貼璧，胰酶消化后轉移至離心管中，用 4 ℃ 預冷 PBS 重懸細胞，按試劑盒說明書加入 Annexin V/FITC 和 PI 后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.2.7 Transwell 法檢測細胞侵襲性
收集對照組、耐藥組及聯合組細胞，分別取 1×105個細胞重新懸浮于無血清培養基中并種于 Transwell 上室，在下室加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液，將 Transwell 小室置于 37 ℃、5% CO2 培養 24 h 后，用棉簽抹去未穿透的細胞及 Matirgel 膠，濾膜以甲醇固定 5 min 后結晶紫染色，采用 Image J 進行細胞計數。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件對數據進行分析。所有半定量試驗重復進行 3 次，數據以均數±標準差（
±s）表示，各組間總體比較采用方差分析法，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗方法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 樂伐替尼耐藥細胞株建立及各組細胞存活率結果
選取 10、20、40、60、80 及 160 μmol/L 6 個樂伐替尼濃度對 Huh7 細胞作用 48 h 后計算得出細胞 IC50 為 12.35 μmol/L，見圖 1a。各組細胞存活率見圖 1b、1c。從圖 1b 可見，耐藥組細胞存活率明顯高于敏感組（P<0.01）而低于對照組（P<0.01）；從圖 1c 可見，聯合組細胞存活率明顯低于耐藥組（P<0.01）和對照組（P<0.01），抑制劑組細胞存活率明顯低于耐藥組（P<0.05）和對照組（P<0.01）。
圖1
示本研究實驗主要結果
a：Huh7 細胞在樂伐替尼作用下 48 h 的抑制率；b：耐藥組及敏感組細胞存活率（*
2.2 Western blot 法檢測 p-Akt、caspase-9、Bcl-2 蛋白表達結果
Western blot 法檢測 p-Akt、caspase-9、Bcl-2 蛋白表達結果的定性結果見圖 1d、1e。p-Akt 蛋白在聯合組明顯低于耐藥組（P<0.01）及對照組（P<0.01），在抑制劑組明顯低于耐藥組（P<0.01）及對照組（P<0.01），見圖 1f、1g；caspase-9 蛋白表達在聯合組明顯高于耐藥組（P<0.01）及對照組（P<0.01），見圖 1h；Bcl-2 蛋白表達在各組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1i。
2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果
流式細胞儀檢測細胞凋亡結果見圖 1j-1l；半定量結果見圖 1m，從圖中 1m 可見，聯合組細胞凋亡率明顯高于耐藥組（P<0.01）和對照組（P<0.01）。
2.4 Transwell 法檢測雙硫侖聯合銅離子對耐藥細胞侵襲性的影響
定性結果見圖 1n-1p；半定量結果見圖 1q，從圖 1q 可見，聯合組的侵襲細胞數明顯少于耐藥組（P<0.01）和對照組（P<0.01）。
3 討論
目前肝癌的主要治療方法是手術切除、化學治療、放射治療、靶向治療、冷凍治療等[14-15]。其中靶向治療越來越受到人們的關注，而多重耐藥的出現大大降低了靶向藥物的療效。
樂伐替尼是一種口服的多激酶（VEGFRs、FGFR1–4、RET、c-Kit 等）抑制劑，可抑制血管生成，在多種腫瘤細胞系的異種移植模型中展現了有效的抗腫瘤活性[6]。在本研究中發現，10 μmol/L 樂伐替尼誘導肝癌細胞 4 個月時，肝癌 Huh7 細胞對樂伐替尼的敏感性下降，其耐藥組細胞存活率明顯高于敏感組。
雙硫侖作為一種戒酒藥物通過聯合銅離子在多種腫瘤細胞中展現了很好的抗癌效果，其機制是通過抑制蛋白酶體、核因子-κB 活性、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 通路等途徑[10, 13, 16-18]；雙硫侖聯合銅離子還能通過抑制多藥耐藥基因 1 改善細胞耐藥[19]。在本研究中發現，通過雙硫侖聯合銅離子后，其對耐藥細胞的抑制率明顯提高。
PI3K/Akt 通路是體內重要的生存增殖途徑，Akt 是其重要的下游分子，其通過多種途徑對靶蛋白磷酸化而發揮抗凋亡作用。有研究[20-23]顯示，p-Akt 是介導肝癌獲得性耐藥的關鍵因素。因此，本研究在對樂伐替尼耐藥組細胞加入雙硫侖銅離子后，通過 CCK8 檢測細胞抑制率發現，雙硫侖銅離子聯合樂伐替尼組的細胞抑制率明顯高于耐藥組，并且進一步對樂伐替尼耐藥組細胞進行檢測發現其 p-Akt 高表達，在加入 Akt 抑制劑 MK2206 對耐藥細胞進行干預后，其細胞抑制率明顯降低，結果提示，雙硫侖可能通過 Akt 通路影響耐藥細胞抑制率；然后本研究通過流式細胞儀檢測雙硫侖銅離子聯合樂伐替尼組及樂伐替尼耐藥組的凋亡率發現，前者的凋亡率明顯高于后者；Transwell 對其細胞侵襲性進行檢測，發現雙硫侖聯合銅離子抑制耐藥細胞侵襲。Western blot 檢測 Akt 下游相關凋亡蛋白發現，Bcl-2 蛋白表達沒有明顯變化，而 caspase-9 蛋白高表達，結果提示，雙硫侖可能是通過 PI3K/Akt 及其下游通路 caspase-9 促進細胞凋亡影響而細胞存活率。
盡管樂伐替尼在肝癌的治療中已經取得不錯的療效，其總生存率、客觀緩解率及無進展生存期均高于索拉非尼[24-25]，但從遠期來看，其存在同索拉非尼一樣的困境，即隨著時間的推移，樂伐替尼也會出現耐藥。通過本研究發現，雙硫侖加銅離子能明顯改善肝癌樂伐替尼耐藥，其機制可能是通過 PI3K/Akt 通路調節，抑制 p-Akt 磷酸化，促進下游 caspase-9 誘導細胞凋亡。樂伐替尼作為新型靶向治療藥物，在肝癌細胞中其耐藥機制仍不明確，在未來隨著樂伐替尼的廣泛應用，進一步尋找其耐藥機制以改善細胞耐藥是值得繼續研究的。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：董博文、李子一、李偉東負責試驗的設計、統計分析及論文撰寫與修改；代文杰指導實驗設計及審核數據。
肝細胞肝癌（簡稱“肝癌”）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一[1]。大多數肝癌患者的診斷都在晚期，復發率高，預后不良[2]。隨著對肝癌病因學研究的不斷深入，已研制出了針對肝癌特異性途徑的靶向治療藥物。樂伐替尼作為可以替代索拉非尼的靶向治療藥為肝癌患者帶來了新的希望[3-5]。樂伐替尼是一種口服酪氨酸激酶受體抑制劑，其機制主要是抑制血管內皮生長因子受體 1–3（vascular endothelial growth factor receptors 1–3，VEGFR1–3）、成纖維細胞生長因子受體 1–4（fibroblast growth factor receptors 1–4，FGFR1–4）、c-Kit 蛋白和 RET 蛋白[4, 6-9]。樂伐替尼作為替代索拉非尼的靶向化療藥物，同索拉非尼一樣，隨著臨床的廣泛應用也會出現耐藥性等問題。雙硫侖作為一種廉價、安全的藥物，在乙醇依賴患者中展現了很好的療效，且發現其聯合銅離子在抗腫瘤方面展現了很好的效果[10-13]。本研究主要針對雙硫侖聯合銅離子對樂伐替尼肝癌耐藥細胞系 Huh7 抑制率及凋亡率的影響并探討其相關機制。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
Huh7 細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心），樂伐替尼（濟南精合生物有限公司），雙硫侖（鎮江天茂生物科技有限公司），銅離子（美國 GNC），胰蛋白酶消化液、DMEM 培養基（賽默飛世爾儀器有限公司），胎牛血清（Science Cell），CCK8 檢測試劑盒（東仁化學科技有限公司），流式細胞凋亡檢測試劑盒（四正柏生物科技有限公司，FXP018-100），青霉素鏈霉素雙抗、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠配置試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Akt（CST 公司，9272），磷酸化 Akt（phospho-protein kinase B，p-Akt，CST 公司，4058，ser473），Cleaved-caspase-9（CST 公司，9505），Bcl-2（CST 公司，15071），β-Actin（上海碧云天生物技術有限公司，AF0003），山羊抗小鼠 IgG 二抗（LI-COR 公司，92568020）、山羊抗兔 IgG 二抗（LI-COR 公司，92568021），Akt 抑制劑 MK2206（MCE 公司），酶標儀（Biotek 公司），Western blot 紅外掃描儀（美國 LI-COR 公司），流式細胞儀（美國 BD 公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
選擇 Huh7 細胞系，培養基為 DMEM，10% 胎牛血清及 1% 的 10 000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 鏈霉素。細胞置于 37 ℃ 恒溫 5% CO2 培養箱中培養，取對數生長期細胞傳代進行下一步實驗。
1.2.2 檢測 Huh7 細胞半抑制濃度（50% inhibitor concentration，IC50）
按每孔 3 000 個細胞分別種于 96 孔板中，放置于 37 ℃ 5% CO2 培養箱中培養過夜，待細胞完全貼壁后吸出培養液準備加藥。樂伐替尼濃度設置分別為 10、20、40、60、80 及 160 μmol/L，每個濃度梯度設置 3 個復孔，作用 48 h 后，按 10∶1 體積加入 CCK8 檢測試劑培養 3 h 后置于酶標儀中 450 nm 波長檢測每孔吸光值，使用 GraphPad 軟件計算 IC50。
1.2.3 樂伐替尼耐藥 Huh7 細胞株的建立
先用樂伐替尼 IC50 的十分之一濃度誘導細胞耐藥，每次提高 0.4 μmol/L 樂伐替尼濃度，每兩周檢測細胞 IC50 濃度以觀察細胞耐藥性，經 4 個月培養，最終細胞在樂伐替尼 10 μmol/L 下穩定生長以確定樂伐替尼肝癌 Huh7 耐藥細胞株的成功建立。
1.2.4 CCK8 法檢測各組細胞存活率
各組細胞處理：① 對照組為 Huh7 細胞加普通培養液培養后的細胞；② 敏感組為 Huh7 細胞加 10 μmol/L 樂伐替尼培養后的細胞；③ 耐藥組為 Huh7 耐藥細胞加 10 μmol/L 樂伐替尼培養后的細胞；④ 聯合組為樂伐替尼 10 μmol/L+雙硫侖 1 μmol/L+0.5 μmol/L 銅離子培養的耐藥 Huh7 細胞；⑤ 抑制劑組為 10 μmol/L 樂伐替尼+10 μmol/L Akt 抑制劑 MK2206 培養的耐藥 Huh7 細胞。各組細胞按每孔 3 000 個細胞種于 96 孔板中，設置 3 個復孔，待細胞完全貼壁吸出培養液準備加藥，各組細胞作用 48 h 后，每孔按 10∶1 體積加入 CCK8 檢測試劑后細胞繼續培養 3 h 后于 450 nm 波長檢測每孔吸光度值，使用 GraphPad 軟件計算各組細胞存活率。
1.2.5 Western blot 法檢測各組細胞中 p-Akt、caspase-9、Bcl-2 蛋白的表達
將對照組、耐藥組、聯合組及抑制劑組細胞分別種于 6 孔板中，待細胞長到 6 孔板 80% 的密度時吸出培養液，PBS 洗 3 次后加入 80 μL 含磷酸酶蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，用細胞鏟刮下細胞 15 000×g 4 ℃ 離心 10 min 后取上清用 BCA 法進行蛋白濃度檢測。SDS-PAGE 膠中每孔蛋白上樣量 40 μg，電泳后濕轉法轉移至 NC 膜上，封閉 1 h 后加入一抗孵育過夜，PBST 洗 3 次，二抗孵育 1 h，PBST 洗 3 次后上紅外掃描儀顯影檢測灰度值。
1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡
收集對照組、耐藥組及聯合組細胞，按每孔 1.5×105個細胞分別種于 6 孔板中，培養過夜后待細胞完全貼璧，胰酶消化后轉移至離心管中，用 4 ℃ 預冷 PBS 重懸細胞，按試劑盒說明書加入 Annexin V/FITC 和 PI 后流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
1.2.7 Transwell 法檢測細胞侵襲性
收集對照組、耐藥組及聯合組細胞，分別取 1×105個細胞重新懸浮于無血清培養基中并種于 Transwell 上室，在下室加入含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養液，將 Transwell 小室置于 37 ℃、5% CO2 培養 24 h 后，用棉簽抹去未穿透的細胞及 Matirgel 膠，濾膜以甲醇固定 5 min 后結晶紫染色，采用 Image J 進行細胞計數。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件對數據進行分析。所有半定量試驗重復進行 3 次，數據以均數±標準差（±s）表示，各組間總體比較采用方差分析法，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗方法。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 樂伐替尼耐藥細胞株建立及各組細胞存活率結果
選取 10、20、40、60、80 及 160 μmol/L 6 個樂伐替尼濃度對 Huh7 細胞作用 48 h 后計算得出細胞 IC50 為 12.35 μmol/L，見圖 1a。各組細胞存活率見圖 1b、1c。從圖 1b 可見，耐藥組細胞存活率明顯高于敏感組（P<0.01）而低于對照組（P<0.01）；從圖 1c 可見，聯合組細胞存活率明顯低于耐藥組（P<0.01）和對照組（P<0.01），抑制劑組細胞存活率明顯低于耐藥組（P<0.05）和對照組（P<0.01）。
圖1
示本研究實驗主要結果
a：Huh7 細胞在樂伐替尼作用下 48 h 的抑制率；b：耐藥組及敏感組細胞存活率（*
2.2 Western blot 法檢測 p-Akt、caspase-9、Bcl-2 蛋白表達結果
Western blot 法檢測 p-Akt、caspase-9、Bcl-2 蛋白表達結果的定性結果見圖 1d、1e。p-Akt 蛋白在聯合組明顯低于耐藥組（P<0.01）及對照組（P<0.01），在抑制劑組明顯低于耐藥組（P<0.01）及對照組（P<0.01），見圖 1f、1g；caspase-9 蛋白表達在聯合組明顯高于耐藥組（P<0.01）及對照組（P<0.01），見圖 1h；Bcl-2 蛋白表達在各組間比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖 1i。
2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果
流式細胞儀檢測細胞凋亡結果見圖 1j-1l；半定量結果見圖 1m，從圖中 1m 可見，聯合組細胞凋亡率明顯高于耐藥組（P<0.01）和對照組（P<0.01）。
2.4 Transwell 法檢測雙硫侖聯合銅離子對耐藥細胞侵襲性的影響
定性結果見圖 1n-1p；半定量結果見圖 1q，從圖 1q 可見，聯合組的侵襲細胞數明顯少于耐藥組（P<0.01）和對照組（P<0.01）。
3 討論
目前肝癌的主要治療方法是手術切除、化學治療、放射治療、靶向治療、冷凍治療等[14-15]。其中靶向治療越來越受到人們的關注，而多重耐藥的出現大大降低了靶向藥物的療效。
樂伐替尼是一種口服的多激酶（VEGFRs、FGFR1–4、RET、c-Kit 等）抑制劑，可抑制血管生成，在多種腫瘤細胞系的異種移植模型中展現了有效的抗腫瘤活性[6]。在本研究中發現，10 μmol/L 樂伐替尼誘導肝癌細胞 4 個月時，肝癌 Huh7 細胞對樂伐替尼的敏感性下降，其耐藥組細胞存活率明顯高于敏感組。
雙硫侖作為一種戒酒藥物通過聯合銅離子在多種腫瘤細胞中展現了很好的抗癌效果，其機制是通過抑制蛋白酶體、核因子-κB 活性、磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/Akt 通路等途徑[10, 13, 16-18]；雙硫侖聯合銅離子還能通過抑制多藥耐藥基因 1 改善細胞耐藥[19]。在本研究中發現，通過雙硫侖聯合銅離子后，其對耐藥細胞的抑制率明顯提高。
PI3K/Akt 通路是體內重要的生存增殖途徑，Akt 是其重要的下游分子，其通過多種途徑對靶蛋白磷酸化而發揮抗凋亡作用。有研究[20-23]顯示，p-Akt 是介導肝癌獲得性耐藥的關鍵因素。因此，本研究在對樂伐替尼耐藥組細胞加入雙硫侖銅離子后，通過 CCK8 檢測細胞抑制率發現，雙硫侖銅離子聯合樂伐替尼組的細胞抑制率明顯高于耐藥組，并且進一步對樂伐替尼耐藥組細胞進行檢測發現其 p-Akt 高表達，在加入 Akt 抑制劑 MK2206 對耐藥細胞進行干預后，其細胞抑制率明顯降低，結果提示，雙硫侖可能通過 Akt 通路影響耐藥細胞抑制率；然后本研究通過流式細胞儀檢測雙硫侖銅離子聯合樂伐替尼組及樂伐替尼耐藥組的凋亡率發現，前者的凋亡率明顯高于后者；Transwell 對其細胞侵襲性進行檢測，發現雙硫侖聯合銅離子抑制耐藥細胞侵襲。Western blot 檢測 Akt 下游相關凋亡蛋白發現，Bcl-2 蛋白表達沒有明顯變化，而 caspase-9 蛋白高表達，結果提示，雙硫侖可能是通過 PI3K/Akt 及其下游通路 caspase-9 促進細胞凋亡影響而細胞存活率。
盡管樂伐替尼在肝癌的治療中已經取得不錯的療效，其總生存率、客觀緩解率及無進展生存期均高于索拉非尼[24-25]，但從遠期來看，其存在同索拉非尼一樣的困境，即隨著時間的推移，樂伐替尼也會出現耐藥。通過本研究發現，雙硫侖加銅離子能明顯改善肝癌樂伐替尼耐藥，其機制可能是通過 PI3K/Akt 通路調節，抑制 p-Akt 磷酸化，促進下游 caspase-9 誘導細胞凋亡。樂伐替尼作為新型靶向治療藥物，在肝癌細胞中其耐藥機制仍不明確，在未來隨著樂伐替尼的廣泛應用，進一步尋找其耐藥機制以改善細胞耐藥是值得繼續研究的。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：董博文、李子一、李偉東負責試驗的設計、統計分析及論文撰寫與修改；代文杰指導實驗設計及審核數據。
