引用本文： 龐長安, 朱洪海, 李雪娟, 李紅強. 瞬時受體蛋白通道 C5 和 miR-320a 在甲狀腺癌中的表達及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2021, 28(9): 1165-1170. doi: 10.7507/1007-9424.202011099 復制
甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，其中以女性居多，約占 75%[1-2]。甲狀腺癌可按病理類型分為乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡狀甲狀腺癌（follictalar thyroid carcinoma，FTC）、未分化癌、髓樣癌[3-4]。雖然近些年甲狀腺癌的病死率有所下降，但其發病率仍持續增長，而且其發病機制仍不清楚[5]。近年來有許多關于甲狀腺癌生物標志物的研究被報道，以期望其在疾病診斷、臨床治療及預后分析中發揮重要作用。鈣離子（Ca2+）通道在維持機體正常生理活動中起極其重要的作用，瞬時受體蛋白通道（transient receptor potential channel，TRPC）C5 即 TRPC5 是 TRPC C 亞族成員之一，其作為鈣離子通道參與許多惡性腫瘤的發生[6]。有研究[7]發現，過表達的 TRPC5 參與乳腺癌的發生且與其化療耐藥性相關。微小 RNA（microRNA，miR）是一類非編碼小 RNA，其作為重要的轉錄后調控因子參與細胞的分化、增殖、凋亡等生理病理過程，而微小 RNA-320a（microRNA-320a，miR-320a）是其成員之一，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[8]，其參與多種腫瘤的發生發展，如乳腺癌[9]、非小細胞肺癌[8]、食管鱗癌[10]等。目前關于 TRPC5 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌中的相關報道較少見，因此本研究通過檢測 TRPC5、miR-320a 在甲狀腺癌組織中的表達，探究二者與甲狀腺癌患者臨床病理特征及預后的關系，以期為甲狀腺癌的早期檢測、臨床分析提供參考。
1 資料與方法
1.1 Ualcan 數據庫資料
通過 Ualcan 數據庫（
1.2 臨床資料
1.2.1 納入患者標準及患者情況
初次確診為甲狀腺癌；臨床資料完整；未接受其他手術、藥物、化療等醫療手段治療；均未患其他惡性腫瘤疾病、免疫系統疾病及心血管、肝、腎功能等相關疾病；均通過鄭州市第七人民醫院醫學倫理委員會批準；所有受試者及其家屬知情同意并簽署同意書。共選取 2014 年 3 月至 2015 年 3 月期間鄭州市第七人民醫院已確診且符合納入標準的甲狀腺癌患者 80 例，年齡 32～61 歲、（47±12）歲；其中男 27 例，女 53 例；有淋巴結轉移 36 例，無淋巴結轉移 44 例；腫瘤分化程度：低、中、高分別為 26、21、33 例；PTC 50 例，FTC 30 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期 46 例，Ⅲ～Ⅳ期 34 例。甲狀腺腺瘤患者 35 例，年齡 31～62 歲、（47±11）歲；其中男 15 例，女 20 例。甲狀腺腺瘤旁經檢測證實的正常甲狀腺組織 32 例，患者年齡 30～61 歲、（46±11）歲；其中男 15 例，女 17 例。對出院的甲狀腺癌患者進行為期5 年的隨訪，隨訪截止時間為患者死亡時間或至 2020 年 3 月結束，每個月以電話或復查形式記錄患者預后情況。
1.2.2 方法
1.2.2.1 主要試劑與儀器
① 主要試劑：實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）試劑盒（貨號：XY-TE-0731）購自上海烜雅生物科技有限公司；總 RNA 提取試劑盒（貨號：AR1200-100T）購自上海吉至生化科技有限公司；Qiagen 反轉錄試劑盒（貨號：205311）購自上海科敏生物科技有限公司；兔抗 TRPC5（貨號：25890-1-AP）購自 Proteintech 公司；兔抗 β-actin（貨號：4970）購自 Cell Signaling Technology 公司；BCA 蛋白檢測試劑盒、HRP 標記的山羊抗兔 IgG 二抗抗體（貨號：K12862、WE0381-QAN）購自北京百奧萊博科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號：CD-13559-ML）購自武漢純度生物科技有限公司。② 主要儀器：Sigma 臺式高速離心機 3K15（貨號：V118926）和 Bio-Rad 熒光定量 PCR 儀 CFX Connect（貨號：CFX Connect）購自南京貝登醫療股份有限公司；BioTek 全自動酶標儀（貨號：26262060）購自北京安麥格貿易有限公司；iBright 蛋白免疫印跡成像系統購自賽默飛世爾科技。
1.2.2.2 樣品采集及保存
將經手術切除的甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織以及腺瘤旁正常甲狀腺組織樣本經液氮冷凍后放至–80 ℃ 冰箱待測。
1.2.2.3 qRT-PCR 檢測各樣本中 TRPC5、miR-320a mRNA 表達
用液氮將組織樣本在研缽中進行研磨，用 RNA 提取試劑盒提取各樣本中總 RNA 后反轉錄成 cDNA。反轉錄反應體系：RNase Free dH2O（up to 20 μL）+總 RNA（1 000/c）+4 μL Mix，以此為模板采用 qRT-PCR 檢測 TRPC5、miR-320a mRNA 在各樣本中的表達水平。PCR 反應體系：0.25 μL cDNA 模板+5 μL ddH2O+0.5 μL 正向引物+0.5 μL 逆向引物+6.25 μL 2×Taq PCR master Mix。以 β-actin 和 U6 為參照對 mRNA 進行標準化，使用 2???Ct 法計算二者的表達水平。用軟件 Oligo 7 和 Primer 3.0 設計引物（表 1），然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表1
qRT-PCR 檢測所用引物
1.2.2.4 Western blot 檢測 TRPC5 蛋白表達情況
采用 BCA 蛋白試劑盒對組織中總蛋白含量進行測定，SDS-PAGE 電泳后低溫轉膜，用脫脂奶粉封閉 1 h，添加兔抗 TRPC5、β-actin 一抗，4 ℃ 孵育過夜，添加山羊抗兔 IgG 抗體二抗孵育 2 h。在蛋白凝膠成像儀下對 TRPC5 蛋白進行定量分析。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行分析。采用 WK 方法檢驗計量資料是否符合正態分布，正態分布數據以均數±標準差（
±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗。計數資料以頻數表示并采用卡方檢驗。TRPC5 mRNA 和 miR-320a mRNA 間的相關性分析采用 Pearson 簡單相關分析；不同 TRPC5、miR-320amRNA 表達患者的生存曲線采用 Kaplan-Meier 法繪制；使用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸模型分析影響患者預后的因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Ualcan 數據庫中正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織 TRPC5、miR-320a mRNA 表達水平
Ualcan 數據庫中的數據結果顯示，甲狀腺癌組織中的 TRPC5 mRNA 表達水平高于正常甲狀腺組織（P<0.001），而 miR-320a mRNA 表達水平則低于正常甲狀腺組織（P<0.001），見圖 1a、1b。
圖1
示 Ualcan 數據庫中正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA（a）和 miR-320a mRNA（b）表達情況、臨床病例甲狀腺癌組織中 TRPC5 和 miR-320a mRNA 表達水平的相關性散點圖（c）以及 TRPC5 mRNA（d）和 miR-320a mRNA（e）表達與甲狀腺癌患者預后的關系
2.2 TRPC5 mRNA、miR-320a mRNA 以及 TRPC5 蛋白在不同組織中的表達
結果見表 2。從表 2 可見，與甲狀腺正常組織比較，甲狀腺腺瘤組織和甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA 和蛋白表達水平增高（P<0.05），而 miR-320a mRNA 表達水平則降低（P<0.05）；與甲狀腺腺瘤組織比較，甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA 和蛋白表達水平均增高（P<0.05），miR-320a mRNA 表達水平降低（P<0.05）。
表2
不同組織中 TRPC5 和 miR-320a 分子的表達水平（
）
2.3 TRPC5、miR-320a mRNA 表達與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關系
分別以 TRPC5、miR-320a mRNA 表達水平的中位數 4.22 和 0.47 將患者分為高、低表達組，>中位數為高表達，反之為低表達。結果見表 3，TRPC5 mRNA 高表達率在低分化程度、有淋巴結轉移及Ⅲ～Ⅳ期甲狀腺癌患者中高于高分化程度、無淋巴結轉移及Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.05），miR-320a mRNA 高表達率則與之相反（P<0.05）；TRPC5 和 miR-320a mRNA 高表達率與患者的年齡、性別、組織學類型、腫瘤大小無關（P>0.05）。
表3
TRPC5 和 miR-320a mRNA 表達與甲狀腺癌臨床病理特征的關系（例）
2.4 TRPC5 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌組織中表達的相關性及其與甲狀腺癌患者預后的關系
TRPC5 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌組織中的表達呈負相關（r=–0.653，P<0.001），見圖 1c。經過 5 年隨訪，80 例甲狀腺癌患者中有 67 例生存（83.75%），13 例（16.25%）死亡。Kaplan-Meier 生存曲線見圖 1d、1e。TRPC5 mRNA 高表達組生存率為 75.00%，低表達組生存率為 92.50%；TRPC5 mRNA 高表達組的生存情況差于低表達組（χ2=4.709，P=0.030）。miR-320a mRNA 低表達組患者的生存率為 75.50%，而高表達組生存率為 95.00%；miR-320a mRNA 高表達組的生存情況優于低表達組（χ2=13.702，P=0.001）。單因素 Cox 比例風險回歸分析結果發現，腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、TRPC5 mRNA 表達和 miR-320a mRNA 表達均對患者預后有影響（P<0.05）；多因素 Cox 比例風險回歸分析發現，腫瘤分化程度低、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達是影響預后的危險因素（P<0.05）。見表 4 和表 5。
表4
影響甲狀腺癌患者預后的單因素分析結果
表5
影響甲狀腺癌患者預后的多因素分析結果
3 討論
甲狀腺癌約占全球惡性腫瘤相關疾病的 3.8%，潛伏期長達 5～10 年且無任何癥狀，其多數可以治愈，尤其是 PTC 預后最為良好，但也常會發生早期淋巴結轉移、腫瘤浸潤[12-15]。雖然甲狀腺癌患者的治愈率增加及病死率下降，但其發病率卻仍處于持續增加狀態[16]。因此，探尋甲狀腺癌的早期檢測、臨床分析及預后判斷指標顯得非常有必要。
已有大量研究表明，TRPC5 作為 Ca2+ 通道參與許多惡性腫瘤的發生，其主要通過觸發 Ca2+ 進入途徑或者改變膜極化來介導 Ca2+ 失調，從而促進惡性腫瘤發生[6]。化學抗性是惡性腫瘤的主要特征，乳腺癌中異常高表達的 TRPC5 促進 Ca2+ 通道活性增強，Ca2+ 信號激活轉錄因子 NFATC3 以啟動 P-糖蛋白的轉錄，從而產生化學抗性[17]；TRPC5 還可通過增加 Ca2+ 來激活 Wnt/β-連環蛋白途徑，促進 Wnt/β-連環蛋白介導的癌細胞上皮-間質轉化[14]；除此之外，在結腸癌中 TRPC5 通過促進缺氧誘導因子-1α 表達激活 Twist 信號通路，從而誘導上皮-間質轉化，促進腫瘤轉移[18]。Ualcan 是能夠分析惡性腫瘤和非惡性腫瘤組織間表達情況的工具[19]，本研究首先通過檢索 Ualcan 數據庫以了解甲狀腺癌中 TRPC5 mRNA 的表達情況，結果發現，TRPC5 mRNA 在 505 例甲狀腺癌組織中的表達水平增高；然后再通過鄭州市第七人民醫院的臨床病例分析發現，甲狀腺腺瘤和甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA 及其蛋白的表達水平均高于甲狀腺正常組織，與 Ualcan 數據庫數據得出的結論基本一致，結果提示，在甲狀腺癌中 TRPC5 也可能通過某種機制反應參與甲狀腺癌的發生及轉移。
miRNA 可在轉錄后水平調控惡性腫瘤相關因子，參與腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡[20]。miR-320a 是 miRNA 成員之一，其參與多種腫瘤的發生發展，并且與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[8]。有文獻[21]報道，miR-320a 在肝癌組織及細胞中表達下調，但其表達上調可通過靶向肝癌細胞中的 c-Myc 抑制腫瘤的增殖和侵襲。本研究首先通過檢索 Ualcan 數據庫以了解甲狀腺癌中 miR-320a mRNA 的表達情況，結果發現，miR-320a mRNA 在 501 例甲狀腺癌組織中的表達水平降低；然后再通過鄭州市第七人民醫院的臨床病例分析發現，甲狀腺腺瘤和甲狀腺癌組織中 miR-320a mRNA 表達水平均低于甲狀腺正常組織，與 Ualcan 數據庫數據得出的結論基本一致，結果提示，miR-320a mRNA 可能參與甲狀腺癌的發生過程。還有研究[16]發現，miR-320a 可以靶向和降解 TRPC5 和 NFATC3 mRNA。在本研究中還發現，TRPC5 mRNA 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌組織中的表達呈負相關，提示二者可能通過相互作用共同參與甲狀腺癌的發生。
有研究[22]發現，高水平 TRPC5 通過 Ca2+-Wnt5a 信號通路降低腫瘤細胞分化，并且 TRPC5 高表達的患者生存率較低，是結直腸癌患者死亡的獨立危險因素。淋巴結轉移與惡性腫瘤患者的臨床分期及預后有關，而 miR-320a 可通過作用于信號轉導與轉錄激活因子 3（STAT3）促進惡性腫瘤的淋巴結轉移[23]。本研究發現，TRPC5、miR-320a mRNA 表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM 分期有關（P<0.05），并且 TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達患者的 5 年生存率較低。多因素分析發現，腫瘤分化程度低、TNM 分期晚、有淋巴結轉移、TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達是影響預后的危險因素（P<0.05），結果提示，TRPC5 mRNA、miR-320a mRNA 有作為甲狀腺癌的臨床與預后監測指標的潛能。
綜上所述，甲狀腺癌組織中 TRPC5 分子的表達水平顯著增高，而 miR-320a 表達水平則顯著降低，二者的表達情況與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM 分期及預后有關。多因素分析結果發現，TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達均是影響預后的危險因素。本研究結果可能為甲狀腺癌的早期檢測、臨床分析提供一定的參考，有助于患者的臨床治療效果和預后情況的判斷，但在未來的研究中還應進一步探究二者在甲狀腺癌中的詳細作用機制，為尋找甲狀腺癌的生物標志物提供數據支持。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：龐長安、朱洪海設計研究并完成論文撰寫；李雪娟完成數據的收集與分析；李紅強給予項目研究的經費支持。
倫理聲明：本研究通過了鄭州市第七人民醫院醫學倫理委員會審批（批文編號：IEC-A-005-A14-V1.0）。
甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤，其中以女性居多，約占 75%[1-2]。甲狀腺癌可按病理類型分為乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）、濾泡狀甲狀腺癌（follictalar thyroid carcinoma，FTC）、未分化癌、髓樣癌[3-4]。雖然近些年甲狀腺癌的病死率有所下降，但其發病率仍持續增長，而且其發病機制仍不清楚[5]。近年來有許多關于甲狀腺癌生物標志物的研究被報道，以期望其在疾病診斷、臨床治療及預后分析中發揮重要作用。鈣離子（Ca2+）通道在維持機體正常生理活動中起極其重要的作用，瞬時受體蛋白通道（transient receptor potential channel，TRPC）C5 即 TRPC5 是 TRPC C 亞族成員之一，其作為鈣離子通道參與許多惡性腫瘤的發生[6]。有研究[7]發現，過表達的 TRPC5 參與乳腺癌的發生且與其化療耐藥性相關。微小 RNA（microRNA，miR）是一類非編碼小 RNA，其作為重要的轉錄后調控因子參與細胞的分化、增殖、凋亡等生理病理過程，而微小 RNA-320a（microRNA-320a，miR-320a）是其成員之一，與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[8]，其參與多種腫瘤的發生發展，如乳腺癌[9]、非小細胞肺癌[8]、食管鱗癌[10]等。目前關于 TRPC5 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌中的相關報道較少見，因此本研究通過檢測 TRPC5、miR-320a 在甲狀腺癌組織中的表達，探究二者與甲狀腺癌患者臨床病理特征及預后的關系，以期為甲狀腺癌的早期檢測、臨床分析提供參考。
1 資料與方法
1.1 Ualcan 數據庫資料
通過 Ualcan 數據庫（
1.2 臨床資料
1.2.1 納入患者標準及患者情況
初次確診為甲狀腺癌；臨床資料完整；未接受其他手術、藥物、化療等醫療手段治療；均未患其他惡性腫瘤疾病、免疫系統疾病及心血管、肝、腎功能等相關疾病；均通過鄭州市第七人民醫院醫學倫理委員會批準；所有受試者及其家屬知情同意并簽署同意書。共選取 2014 年 3 月至 2015 年 3 月期間鄭州市第七人民醫院已確診且符合納入標準的甲狀腺癌患者 80 例，年齡 32～61 歲、（47±12）歲；其中男 27 例，女 53 例；有淋巴結轉移 36 例，無淋巴結轉移 44 例；腫瘤分化程度：低、中、高分別為 26、21、33 例；PTC 50 例，FTC 30 例；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期 46 例，Ⅲ～Ⅳ期 34 例。甲狀腺腺瘤患者 35 例，年齡 31～62 歲、（47±11）歲；其中男 15 例，女 20 例。甲狀腺腺瘤旁經檢測證實的正常甲狀腺組織 32 例，患者年齡 30～61 歲、（46±11）歲；其中男 15 例，女 17 例。對出院的甲狀腺癌患者進行為期5 年的隨訪，隨訪截止時間為患者死亡時間或至 2020 年 3 月結束，每個月以電話或復查形式記錄患者預后情況。
1.2.2 方法
1.2.2.1 主要試劑與儀器
① 主要試劑：實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）試劑盒（貨號：XY-TE-0731）購自上海烜雅生物科技有限公司；總 RNA 提取試劑盒（貨號：AR1200-100T）購自上海吉至生化科技有限公司；Qiagen 反轉錄試劑盒（貨號：205311）購自上海科敏生物科技有限公司；兔抗 TRPC5（貨號：25890-1-AP）購自 Proteintech 公司；兔抗 β-actin（貨號：4970）購自 Cell Signaling Technology 公司；BCA 蛋白檢測試劑盒、HRP 標記的山羊抗兔 IgG 二抗抗體（貨號：K12862、WE0381-QAN）購自北京百奧萊博科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號：CD-13559-ML）購自武漢純度生物科技有限公司。② 主要儀器：Sigma 臺式高速離心機 3K15（貨號：V118926）和 Bio-Rad 熒光定量 PCR 儀 CFX Connect（貨號：CFX Connect）購自南京貝登醫療股份有限公司；BioTek 全自動酶標儀（貨號：26262060）購自北京安麥格貿易有限公司；iBright 蛋白免疫印跡成像系統購自賽默飛世爾科技。
1.2.2.2 樣品采集及保存
將經手術切除的甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織以及腺瘤旁正常甲狀腺組織樣本經液氮冷凍后放至–80 ℃ 冰箱待測。
1.2.2.3 qRT-PCR 檢測各樣本中 TRPC5、miR-320a mRNA 表達
用液氮將組織樣本在研缽中進行研磨，用 RNA 提取試劑盒提取各樣本中總 RNA 后反轉錄成 cDNA。反轉錄反應體系：RNase Free dH2O（up to 20 μL）+總 RNA（1 000/c）+4 μL Mix，以此為模板采用 qRT-PCR 檢測 TRPC5、miR-320a mRNA 在各樣本中的表達水平。PCR 反應體系：0.25 μL cDNA 模板+5 μL ddH2O+0.5 μL 正向引物+0.5 μL 逆向引物+6.25 μL 2×Taq PCR master Mix。以 β-actin 和 U6 為參照對 mRNA 進行標準化，使用 2???Ct 法計算二者的表達水平。用軟件 Oligo 7 和 Primer 3.0 設計引物（表 1），然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表1
qRT-PCR 檢測所用引物
1.2.2.4 Western blot 檢測 TRPC5 蛋白表達情況
采用 BCA 蛋白試劑盒對組織中總蛋白含量進行測定，SDS-PAGE 電泳后低溫轉膜，用脫脂奶粉封閉 1 h，添加兔抗 TRPC5、β-actin 一抗，4 ℃ 孵育過夜，添加山羊抗兔 IgG 抗體二抗孵育 2 h。在蛋白凝膠成像儀下對 TRPC5 蛋白進行定量分析。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計學軟件對數據進行分析。采用 WK 方法檢驗計量資料是否符合正態分布，正態分布數據以均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗。計數資料以頻數表示并采用卡方檢驗。TRPC5 mRNA 和 miR-320a mRNA 間的相關性分析采用 Pearson 簡單相關分析；不同 TRPC5、miR-320amRNA 表達患者的生存曲線采用 Kaplan-Meier 法繪制；使用單因素和多因素 Cox 比例風險回歸模型分析影響患者預后的因素。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Ualcan 數據庫中正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織 TRPC5、miR-320a mRNA 表達水平
Ualcan 數據庫中的數據結果顯示，甲狀腺癌組織中的 TRPC5 mRNA 表達水平高于正常甲狀腺組織（P<0.001），而 miR-320a mRNA 表達水平則低于正常甲狀腺組織（P<0.001），見圖 1a、1b。
圖1
示 Ualcan 數據庫中正常甲狀腺組織與甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA（a）和 miR-320a mRNA（b）表達情況、臨床病例甲狀腺癌組織中 TRPC5 和 miR-320a mRNA 表達水平的相關性散點圖（c）以及 TRPC5 mRNA（d）和 miR-320a mRNA（e）表達與甲狀腺癌患者預后的關系
2.2 TRPC5 mRNA、miR-320a mRNA 以及 TRPC5 蛋白在不同組織中的表達
結果見表 2。從表 2 可見，與甲狀腺正常組織比較，甲狀腺腺瘤組織和甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA 和蛋白表達水平增高（P<0.05），而 miR-320a mRNA 表達水平則降低（P<0.05）；與甲狀腺腺瘤組織比較，甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA 和蛋白表達水平均增高（P<0.05），miR-320a mRNA 表達水平降低（P<0.05）。
表2
不同組織中 TRPC5 和 miR-320a 分子的表達水平（）
2.3 TRPC5、miR-320a mRNA 表達與甲狀腺癌患者臨床病理特征的關系
分別以 TRPC5、miR-320a mRNA 表達水平的中位數 4.22 和 0.47 將患者分為高、低表達組，>中位數為高表達，反之為低表達。結果見表 3，TRPC5 mRNA 高表達率在低分化程度、有淋巴結轉移及Ⅲ～Ⅳ期甲狀腺癌患者中高于高分化程度、無淋巴結轉移及Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.05），miR-320a mRNA 高表達率則與之相反（P<0.05）；TRPC5 和 miR-320a mRNA 高表達率與患者的年齡、性別、組織學類型、腫瘤大小無關（P>0.05）。
表3
TRPC5 和 miR-320a mRNA 表達與甲狀腺癌臨床病理特征的關系（例）
2.4 TRPC5 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌組織中表達的相關性及其與甲狀腺癌患者預后的關系
TRPC5 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌組織中的表達呈負相關（r=–0.653，P<0.001），見圖 1c。經過 5 年隨訪，80 例甲狀腺癌患者中有 67 例生存（83.75%），13 例（16.25%）死亡。Kaplan-Meier 生存曲線見圖 1d、1e。TRPC5 mRNA 高表達組生存率為 75.00%，低表達組生存率為 92.50%；TRPC5 mRNA 高表達組的生存情況差于低表達組（χ2=4.709，P=0.030）。miR-320a mRNA 低表達組患者的生存率為 75.50%，而高表達組生存率為 95.00%；miR-320a mRNA 高表達組的生存情況優于低表達組（χ2=13.702，P=0.001）。單因素 Cox 比例風險回歸分析結果發現，腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移、TRPC5 mRNA 表達和 miR-320a mRNA 表達均對患者預后有影響（P<0.05）；多因素 Cox 比例風險回歸分析發現，腫瘤分化程度低、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達是影響預后的危險因素（P<0.05）。見表 4 和表 5。
表4
影響甲狀腺癌患者預后的單因素分析結果
表5
影響甲狀腺癌患者預后的多因素分析結果
3 討論
甲狀腺癌約占全球惡性腫瘤相關疾病的 3.8%，潛伏期長達 5～10 年且無任何癥狀，其多數可以治愈，尤其是 PTC 預后最為良好，但也常會發生早期淋巴結轉移、腫瘤浸潤[12-15]。雖然甲狀腺癌患者的治愈率增加及病死率下降，但其發病率卻仍處于持續增加狀態[16]。因此，探尋甲狀腺癌的早期檢測、臨床分析及預后判斷指標顯得非常有必要。
已有大量研究表明，TRPC5 作為 Ca2+ 通道參與許多惡性腫瘤的發生，其主要通過觸發 Ca2+ 進入途徑或者改變膜極化來介導 Ca2+ 失調，從而促進惡性腫瘤發生[6]。化學抗性是惡性腫瘤的主要特征，乳腺癌中異常高表達的 TRPC5 促進 Ca2+ 通道活性增強，Ca2+ 信號激活轉錄因子 NFATC3 以啟動 P-糖蛋白的轉錄，從而產生化學抗性[17]；TRPC5 還可通過增加 Ca2+ 來激活 Wnt/β-連環蛋白途徑，促進 Wnt/β-連環蛋白介導的癌細胞上皮-間質轉化[14]；除此之外，在結腸癌中 TRPC5 通過促進缺氧誘導因子-1α 表達激活 Twist 信號通路，從而誘導上皮-間質轉化，促進腫瘤轉移[18]。Ualcan 是能夠分析惡性腫瘤和非惡性腫瘤組織間表達情況的工具[19]，本研究首先通過檢索 Ualcan 數據庫以了解甲狀腺癌中 TRPC5 mRNA 的表達情況，結果發現，TRPC5 mRNA 在 505 例甲狀腺癌組織中的表達水平增高；然后再通過鄭州市第七人民醫院的臨床病例分析發現，甲狀腺腺瘤和甲狀腺癌組織中 TRPC5 mRNA 及其蛋白的表達水平均高于甲狀腺正常組織，與 Ualcan 數據庫數據得出的結論基本一致，結果提示，在甲狀腺癌中 TRPC5 也可能通過某種機制反應參與甲狀腺癌的發生及轉移。
miRNA 可在轉錄后水平調控惡性腫瘤相關因子，參與腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡[20]。miR-320a 是 miRNA 成員之一，其參與多種腫瘤的發生發展，并且與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[8]。有文獻[21]報道，miR-320a 在肝癌組織及細胞中表達下調，但其表達上調可通過靶向肝癌細胞中的 c-Myc 抑制腫瘤的增殖和侵襲。本研究首先通過檢索 Ualcan 數據庫以了解甲狀腺癌中 miR-320a mRNA 的表達情況，結果發現，miR-320a mRNA 在 501 例甲狀腺癌組織中的表達水平降低；然后再通過鄭州市第七人民醫院的臨床病例分析發現，甲狀腺腺瘤和甲狀腺癌組織中 miR-320a mRNA 表達水平均低于甲狀腺正常組織，與 Ualcan 數據庫數據得出的結論基本一致，結果提示，miR-320a mRNA 可能參與甲狀腺癌的發生過程。還有研究[16]發現，miR-320a 可以靶向和降解 TRPC5 和 NFATC3 mRNA。在本研究中還發現，TRPC5 mRNA 和 miR-320a mRNA 在甲狀腺癌組織中的表達呈負相關，提示二者可能通過相互作用共同參與甲狀腺癌的發生。
有研究[22]發現，高水平 TRPC5 通過 Ca2+-Wnt5a 信號通路降低腫瘤細胞分化，并且 TRPC5 高表達的患者生存率較低，是結直腸癌患者死亡的獨立危險因素。淋巴結轉移與惡性腫瘤患者的臨床分期及預后有關，而 miR-320a 可通過作用于信號轉導與轉錄激活因子 3（STAT3）促進惡性腫瘤的淋巴結轉移[23]。本研究發現，TRPC5、miR-320a mRNA 表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM 分期有關（P<0.05），并且 TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達患者的 5 年生存率較低。多因素分析發現，腫瘤分化程度低、TNM 分期晚、有淋巴結轉移、TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達是影響預后的危險因素（P<0.05），結果提示，TRPC5 mRNA、miR-320a mRNA 有作為甲狀腺癌的臨床與預后監測指標的潛能。
綜上所述，甲狀腺癌組織中 TRPC5 分子的表達水平顯著增高，而 miR-320a 表達水平則顯著降低，二者的表達情況與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、TNM 分期及預后有關。多因素分析結果發現，TRPC5 mRNA 高表達和 miR-320a mRNA 低表達均是影響預后的危險因素。本研究結果可能為甲狀腺癌的早期檢測、臨床分析提供一定的參考，有助于患者的臨床治療效果和預后情況的判斷，但在未來的研究中還應進一步探究二者在甲狀腺癌中的詳細作用機制，為尋找甲狀腺癌的生物標志物提供數據支持。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：龐長安、朱洪海設計研究并完成論文撰寫；李雪娟完成數據的收集與分析；李紅強給予項目研究的經費支持。
倫理聲明：本研究通過了鄭州市第七人民醫院醫學倫理委員會審批（批文編號：IEC-A-005-A14-V1.0）。
