引用本文： 劉柱, 田圣威, 史守興, 許春進. 胃癌細胞MKN-45外泌體攜帶miR-552對HUVEC細胞增殖、遷移和血管生成能力的影響. 中國普外基礎與臨床雜志, 2022, 29(6): 719-725. doi: 10.7507/1007-9424.202108082 復制
胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率在我國惡性腫瘤發病率中占第2位，死亡率占第3位[1]。由于胃癌早期癥狀不明顯，在早期被確診的患者不足10%，而晚期患者的預后差，5年生存率偏低，因此研究胃癌的發生發展機制對于胃癌的治療具有重要意義[2-3]。侵襲與轉移是胃癌死亡率高的主要原因，腫瘤的轉移與腫瘤血管生成密切相關，研究血管生成機制，對于抑制腫瘤的生長與轉移具有積極作用[4-5]。外泌體（exosome）內含有多種蛋白質及RNA分子，是細胞間傳遞信息的重要載體，在腫瘤微環境中發揮重要的調控作用。微小RNA（microRNA，miR）是外泌體中非編碼RNA的重要組分，可調控血管內皮細胞功能而影響腫瘤的生長、遷移和血管生成[6]。miR-552為miR的一種，在多種腫瘤中表達上調，促進骨肉瘤、喉癌等腫瘤細胞的增殖、遷移等[7-8]。研究[9-10]顯示，miR-552在胃癌和肝癌中呈高表達，可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，但miR-552在胃癌血管生成中的作用尚不清楚。本研究擬探究胃癌來源外泌體攜帶miR-552對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）細胞增殖、遷移和血管生成能力的影響，為尋找胃癌的潛在治療靶點提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
HUVEC 與胃癌細胞 MKN-45 購于中國科學院細胞庫。DMEM培養基購自Gibco公司，PKH26紅色熒光細胞連接試劑盒、牛血清白蛋白（BSA）購自sigma公司，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis kit及SYBR Premix Ex Taq定量PCR試劑盒購自Takara公司，外泌體純化試劑購自Invitrogen公司，抑制miR-552表達質粒（miR-552 inhibitor）及其對照質粒（NC inhibitor）由Genepharma公司合成，miR-552和U6引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成，Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒購自美國Thermo- fisher公司，噻唑藍（MTT）試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司，放射免疫沉淀分析（radioimmuno-precipitation assay，RIPA）蛋白裂解液、增強化學發光（enhanced chemiluminecence，ECL）液購自碧云天生物公司，兔抗人分化抗原63（CD63）、分化抗原9（CD9）、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）單克隆抗體購自美國Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養與處理
本研究前期預實驗顯示，胃癌細胞（包括MKN-45、MGC-803、SGC-7901和BGC-823細胞）中提取的外泌體中，MKN-45細胞外泌體中miR-552表達水平最高，故選擇該細胞系作為本研究的細胞系。將MKN-45細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，隔天換液，待細胞生長至對數期時，將細胞分為MKN-45空白對照組（未轉染任何質粒）、MKN-45 miR-552 抑制組 ［轉染抑制 miR-552 表達的質粒（miR-552抑制質粒）］ 和MKN-45 陰性對照組 ［轉染陰性對照質粒（空質粒）］，每組設置6個復孔。轉染使用Lipofectamine 2000，操作按試劑盒說明書進行。根據熒光標記判斷轉染是否成功，MKN-45 miR-552 抑制組相較于MKN-45 陰性對照組檢測到miR-552表達水平降低則證實轉染成功。細胞轉染6 h后，更換新鮮DMEM培養液繼續后續實驗。
1.2.2 外泌體的提取與鑒定
將MKN-45細胞及轉染的MKN-45細胞培養于培養瓶中，24 h后收集培養液，3000×g離心15 min，0.22 μm濾膜過濾后再3 000×g離心30 min，取上清，加入外泌體純化試劑，4 ℃孵育12 h，1 500×g離心15 min，收集沉淀即為MKN-45細胞外泌體，加PBS溶液重懸沉淀。吸取10 μL樣品滴加于銅網上沉淀1 min；吸取磷鎢酸滴加于銅網上，沉淀1 min，以濾紙吸去浮液，常溫干燥數分鐘，透射電鏡下觀察外泌體的形態結構。
1.2.3 免疫印跡（Western blotting，WB）法檢測CD63、CD9和TSG101蛋白的表達
采用WB法檢測外泌體中CD63、CD9、TSG101蛋白的表達：采用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，取適量蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入兔抗人CD63、CD9或TSG101（按照1∶1 000稀釋）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色曝光。以β-actin為內參，使用蛋白凝膠成像系統拍照，以Quantity One軟件分析灰度值。
1.2.4 外泌體示蹤實驗
采用PBS溶液重懸外泌體，加入2 μL的PKH26試劑，混合均勻孵育5 min，以0.5%的BSA終止反應，4 ℃條件下14 000 r/min離心30 min（r=10 cm），取沉淀即為PKH26標記的外泌體。培養基重懸外泌體與對數生長期的HUVEC細胞，共培養12 h，以2，6-二異丙基苯胺（diisopropyl aniline，DIPA）染色10 min，4%多聚甲醛固定20 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。
1.2.5 實時熒光定量PCR（real-time quantification PCR，RT-qPCR）實驗檢測miR-552表達水平
采用RT-qPCR法檢測miR-552的相對表達量。以U6為內參，RNA提取試劑盒提取總RNA，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis kit逆轉錄為cDNA，SYBR Premix Ex Taq定量PCR試劑盒檢測miR-552的表達，采用2－△△Ct法計算miR-552的相對表達量。miR-552上游引物序列（5′–3′）：CAGGTGACTGGTTAGAC；下游引物序列（5′–3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC。U6上游引物序列（5′–3′）：ATTGGAACGATACAGAGAAGATT；下游引物序列（5′–3′）：GGAACGCTTCACGAATTTG。操作按試劑盒說明書進行。
1.2.6 MTT法檢測細胞增殖
將HUVEC細胞以每孔2×105個細胞接種至96孔板中，待細胞融合至80%左右時，將細胞分為HUVEC對照組（加入PBS溶液）、HUVEC-外泌體組（加入MKN-45細胞來源外泌體）、HUVEC-陰性對照外泌體組（加入轉染陰性對照質粒的MKN-45細胞來源外泌體）和HUVEC-miR-552 抑制外泌體組（加入轉染miR-552 抑制質粒的MKN-45細胞來源外泌體），每組設6個復孔。其中，3組加入外泌體組每孔加入10 μg/mL的外泌體，HUVEC對照組加入等體積PBS溶液。分別于培養0、24 、48和72 h時，每孔加入10 μL的MTT溶液，繼續培養4 h后，加入二甲基亞砜（DMSO）溶液終止反應，測定酶標儀490 nm處的吸光度（A）值代表細胞增殖率，繪制生長曲線。
1.2.7 Transwell小室檢測細胞遷移
取與外泌體共培養的各組HUVEC細胞和HUVEC對照組細胞，用無血清培養基重懸細胞（2×105個/mL）。Transwell小室上室接種400 μL，培養24 h后，甲醇溶液固定30 min，0.5%結晶紫染色10 min，每個復孔隨機選擇6個視野進行顯微鏡下觀察，計算6個視野平均穿過微孔膜的細胞數作為該復孔的細胞遷移數。
1.2.8 血管生成實驗
取24孔板，每孔加入100 μL的Matrigel基質膠，37 ℃培養箱放置30 min，每孔接種1×105個外泌體共培養的各組HUVEC細胞和HUVEC對照組細胞，放入培養箱中培養12 h后，顯微鏡觀察小管生成節點數。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（
±s）描述，2組間比較采用成組設計兩樣本比較的t檢驗，3組間及組間兩兩比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MKN-45 細胞外泌體的提取與鑒定
本研究成功從MKN-45胃癌細胞中提取外泌體和抑制miR-552表達的外泌體，透射電鏡觀察外泌體均呈圓形或橢圓形，直徑在100～150 nm，可見外泌體囊泡結構，見圖1a～1c。WB結果顯示，提取的外泌體中可檢測到外泌體表面標志物CD63、CD9和TSG101蛋白的表達，而MKN-45細胞內則無CD63、CD9和TSG101蛋白表達，見圖1d。
圖1
示透射電鏡下觀察外泌體形態以及外泌體和MKN-45細胞中CD63、CD9和TSG101蛋白表達的WB鑒定結果
a～c：透射電鏡觀察外泌體形態（透射電鏡 ×50 000），見MKN-45空白對照組（a）、MKN-45 陰性對照組（b）和MKN-45 miR-552 抑制組（c）的外泌體均呈圓形或橢圓形，大小均勻，直徑100～150 nm；d：MKN-45 miR-552 抑制組 MKN-45 細胞外泌體和MKN-45細胞中CD63、CD9、TSG101蛋白表達的WB電泳結果
2.2 外泌體被HUVEC細胞內化
示蹤實驗結果顯示，MKN-45細胞來源的外泌體被HUVEC細胞內化，見圖2a。
圖2
示外泌體被HUVEC細胞內化以及4組細胞的增殖、遷移和血管生成實驗結果
a：HUVEC-miR-552 抑制外泌體組外泌體被HUVEC細胞內化（PKH26熒光標記 ×400），其中DAPI染色藍色部分為HUVEC細胞核，PKH26標記的外泌體顯示為紅色；b和c：MKN-45細胞外泌體（b）和抑制miR-552后MKN-45細胞來源外泌體（c）對HUVEC細胞增殖的影響；d～g：HUVEC對照組（d）、HUVEC-外泌體組（e）、HUVEC-陰性對照外泌體組（f）和HUVEC-miR-552 抑制外泌體組（g）的細胞遷移實驗結果（結晶紫染色 ×200）；h～k：HUVEC對照組（h）、HUVEC-外泌體組（i）、HUVEC-陰性對照外泌體組（j）和HUVEC-miR-552 抑制外泌體組（k）的血管生成實驗結果（倒置顯微鏡 ×100）
2.3 MKN-45細胞轉染miR-552 inhibitor后外泌體中的miR-552表達水平
MKN-45細胞轉染miR-552 抑制質粒后，與MKN-45空白對照組和MKN-45 陰性對照組相比，MKN-45 miR-552 抑制組外泌體中的miR-552相對表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05），表明獲得差異表達miR-552的外泌體，見表1。
表1
各組細胞外泌體中miR-552相對表達水平比較（
）
2.4 MKN-45細胞來源外泌體和抑制 miR-552 后 MKN-45 細胞來源外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、血管生成及miR-552表達的影響
MKN-45細胞和抑制miR-552表達后MKN-45細胞來源的外泌體對HUVEC細胞的影響見圖2b～2k。
2.4.1 MKN-45細胞來源外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、血管生成及miR-552表達的影響
與HUVEC對照組相比，HUVEC-外泌體組24、48和72 h的A490值增高，遷移細胞數、小管生成節點數和miR-552相對表達水平升高（P<0.05），表明MKN-45細胞外泌體促進HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，可能與促進miR-552表達有關，見表2、圖2b、2d、2e、2h和2i。
表2
MKN-45細胞外泌體對HUVEC細胞遷移、血管生成和 miR-552 表達的影響（
）
2.4.2 抑制miR-552后MKN-45細胞來源外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、血管生成及miR-552表達的影響
結果見表3和圖2c、2f、2g、2j和2k。與HUVEC-陰性對照外泌體組相比，HUVEC-miR-552 抑制外泌體組24、48 和72 h 的A490 值降低，且遷移細胞數、小管生成節點數及miR-552 的相對表達水平降低（P<0.05），表明抑制MKN-45 細胞外泌體miR-552 的表達能抑制HUVEC 細胞的增殖、遷移和血管生成。
表3
抑制miR-552后MKN-45細胞來源外泌體對HUVEC細胞遷移、血管生成和miR-552表達的影響（
）
3 討論
轉移是胃癌患者死亡的主要原因，轉移進程中涉及到腫瘤細胞生長、附著侵入、血管生成、細胞耐藥性等過程[11]。血管是腫瘤微環境的重要組成部分，可為腫瘤的生長提供氧氣和營養物質，血管生成包含內皮細胞生長、遷移、黏附等過程，與血管生成有關的調控分子可促進血管生成，且可促進腫瘤轉移，因此，抑制血管新生成為腫瘤治療的一個新方向[12]。外泌體是細胞外囊泡的一種，直徑40～200 nm，絕大多數細胞均可分泌，可介導細胞間信息傳遞[13]。外泌體中包含多種蛋白質、mRNA和miRNA，其中miRNA是外泌體的重要構成成分，外泌體來源的miRNA可參與調控胃癌的生長、轉移、侵襲，免疫調節、抗腫瘤治療等。已有研究顯示，多種外泌體來源的miRNA參與胃癌的發生發展[14-15]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是腫瘤微環境的重要組成部分，以從胃癌細胞提取的外泌體處理MSCs后，可促進巨噬細胞的吞噬作用，上調促炎因子的分泌，促進T細胞表面CD69和CD25的活化，其主要通過核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路影響MSCs的免疫調節功能，增強MSCs激活免疫細胞、維持炎癥環境、增強腫瘤生長的能力[16]。另有研究[17]顯示，胃癌細胞來源外泌體攜帶的miR-135b，可抑制內皮細胞中叉頭轉錄因子（forkhead transcription factor，FOXO1）的表達，并促進血管生成。本研究成功從MKN-45胃癌細胞中提取外泌體及抑制miR-552表達的外泌體，通過透射電鏡觀察到外泌體均呈圓形或橢圓形，直徑為100～150 nm，可見外泌體的囊泡結構，且存在外泌體表面標志物CD63、CD9和TSG101蛋白的表達，其大小、形態及標志蛋白均符合外泌體特征。將MKN-45細胞外泌體與HUVEC細胞共培養后，細胞增殖率（A490值）、遷移細胞數和小管生成節點數均升高，表明MKN-45細胞外泌體促進HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，然而其具體機制尚不清楚。
miRNA為小分子非編碼RNA，多項研究表明，miRNA參與調節胃癌細胞的增殖、遷移、血管生成等過程，與胃癌的發生發展及預后密切相關[18-20]。miR-552為miRNA的一種，與多種腫瘤的發生有關，研究顯示miR-552在乳腺癌[21]、喉癌[8]、肝癌[22]、結腸癌[23]等多種腫瘤中表達上調，促進腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲行為。本研究通過RT-qPCR檢測與外泌體共培養的HUVEC細胞中miR-552的表達水平，結果顯示，HUVEC-外泌體組的細胞增殖率（A490值）、遷移細胞數、小管生成節點數和miR-552表達水平均高于HUVEC對照組，提示miR-552可能與HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成有關。
研究[24]表明，miR-552在胃癌患者中高表達，與患者預后不良有關。miR-552可靶向叉頭盒O1蛋白調控磷脂酰肌醇3-激酶和蛋白激酶B通路，從而促進胃癌細胞的生長、轉移與上皮-間充質轉化。miR-552在其他腫瘤中也有研究，如在骨肉瘤中miR-552表達上調，miR-552可通過靶向抑制Wnt抑制因子-1的表達，而激活Wnt/β-catenin通路促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[25]。本研究將抑制miR-552表達的MKN-45細胞來源外泌體與HUVEC細胞共培養后發現，與HUVEC-陰性對照外泌體組相比，HUVEC-miR-552 抑制外泌體組的細胞增殖、遷移細胞數目和小管生成節點數降低，表明抑制MKN-45細胞外泌體的miR-552表達能抑制HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，提示MKN-45細胞外泌體可能通過高表達miR-552而促進血管新生，因此推測在胃癌轉移過程中，外泌體攜帶miR-552進入靶器官后，改變細胞周圍的微環境，通過靶向調控促進腫瘤細胞的增殖和血管新生。但本研究僅研究了1種胃癌細胞系的外泌體攜帶的miR-552對HUVEC細胞增殖、遷移和血管生成的影響，為本研究的不足，仍需選擇更多細胞系對本實驗結果進行驗證。
綜上所述，MKN-45細胞外泌體促進HUVEC細胞的增殖、遷移與血管生成，可能與外泌體中miR-552的高表達有關，但其具體機制尚不明確，仍需選擇更多的細胞系及動物模型來對miR-552的調控機制做進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉柱和田圣威設計研究、統計分析并撰寫論文；史守興和劉柱收集文章數據并查閱文獻；許春進給予指導。
胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率在我國惡性腫瘤發病率中占第2位，死亡率占第3位[1]。由于胃癌早期癥狀不明顯，在早期被確診的患者不足10%，而晚期患者的預后差，5年生存率偏低，因此研究胃癌的發生發展機制對于胃癌的治療具有重要意義[2-3]。侵襲與轉移是胃癌死亡率高的主要原因，腫瘤的轉移與腫瘤血管生成密切相關，研究血管生成機制，對于抑制腫瘤的生長與轉移具有積極作用[4-5]。外泌體（exosome）內含有多種蛋白質及RNA分子，是細胞間傳遞信息的重要載體，在腫瘤微環境中發揮重要的調控作用。微小RNA（microRNA，miR）是外泌體中非編碼RNA的重要組分，可調控血管內皮細胞功能而影響腫瘤的生長、遷移和血管生成[6]。miR-552為miR的一種，在多種腫瘤中表達上調，促進骨肉瘤、喉癌等腫瘤細胞的增殖、遷移等[7-8]。研究[9-10]顯示，miR-552在胃癌和肝癌中呈高表達，可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，但miR-552在胃癌血管生成中的作用尚不清楚。本研究擬探究胃癌來源外泌體攜帶miR-552對人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）細胞增殖、遷移和血管生成能力的影響，為尋找胃癌的潛在治療靶點提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
HUVEC 與胃癌細胞 MKN-45 購于中國科學院細胞庫。DMEM培養基購自Gibco公司，PKH26紅色熒光細胞連接試劑盒、牛血清白蛋白（BSA）購自sigma公司，RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis kit及SYBR Premix Ex Taq定量PCR試劑盒購自Takara公司，外泌體純化試劑購自Invitrogen公司，抑制miR-552表達質粒（miR-552 inhibitor）及其對照質粒（NC inhibitor）由Genepharma公司合成，miR-552和U6引物序列由上海生工生物工程有限公司設計合成，Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑盒購自美國Thermo- fisher公司，噻唑藍（MTT）試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司，放射免疫沉淀分析（radioimmuno-precipitation assay，RIPA）蛋白裂解液、增強化學發光（enhanced chemiluminecence，ECL）液購自碧云天生物公司，兔抗人分化抗原63（CD63）、分化抗原9（CD9）、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG101）單克隆抗體購自美國Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養與處理
本研究前期預實驗顯示，胃癌細胞（包括MKN-45、MGC-803、SGC-7901和BGC-823細胞）中提取的外泌體中，MKN-45細胞外泌體中miR-552表達水平最高，故選擇該細胞系作為本研究的細胞系。將MKN-45細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，隔天換液，待細胞生長至對數期時，將細胞分為MKN-45空白對照組（未轉染任何質粒）、MKN-45 miR-552 抑制組 ［轉染抑制 miR-552 表達的質粒（miR-552抑制質粒）］ 和MKN-45 陰性對照組 ［轉染陰性對照質粒（空質粒）］，每組設置6個復孔。轉染使用Lipofectamine 2000，操作按試劑盒說明書進行。根據熒光標記判斷轉染是否成功，MKN-45 miR-552 抑制組相較于MKN-45 陰性對照組檢測到miR-552表達水平降低則證實轉染成功。細胞轉染6 h后，更換新鮮DMEM培養液繼續后續實驗。
1.2.2 外泌體的提取與鑒定
將MKN-45細胞及轉染的MKN-45細胞培養于培養瓶中，24 h后收集培養液，3000×g離心15 min，0.22 μm濾膜過濾后再3 000×g離心30 min，取上清，加入外泌體純化試劑，4 ℃孵育12 h，1 500×g離心15 min，收集沉淀即為MKN-45細胞外泌體，加PBS溶液重懸沉淀。吸取10 μL樣品滴加于銅網上沉淀1 min；吸取磷鎢酸滴加于銅網上，沉淀1 min，以濾紙吸去浮液，常溫干燥數分鐘，透射電鏡下觀察外泌體的形態結構。
1.2.3 免疫印跡（Western blotting，WB）法檢測CD63、CD9和TSG101蛋白的表達
采用WB法檢測外泌體中CD63、CD9、TSG101蛋白的表達：采用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，取適量蛋白變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入兔抗人CD63、CD9或TSG101（按照1∶1 000稀釋）單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色曝光。以β-actin為內參，使用蛋白凝膠成像系統拍照，以Quantity One軟件分析灰度值。
1.2.4 外泌體示蹤實驗
采用PBS溶液重懸外泌體，加入2 μL的PKH26試劑，混合均勻孵育5 min，以0.5%的BSA終止反應，4 ℃條件下14 000 r/min離心30 min（r=10 cm），取沉淀即為PKH26標記的外泌體。培養基重懸外泌體與對數生長期的HUVEC細胞，共培養12 h，以2，6-二異丙基苯胺（diisopropyl aniline，DIPA）染色10 min，4%多聚甲醛固定20 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。
1.2.5 實時熒光定量PCR（real-time quantification PCR，RT-qPCR）實驗檢測miR-552表達水平
采用RT-qPCR法檢測miR-552的相對表達量。以U6為內參，RNA提取試劑盒提取總RNA，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis kit逆轉錄為cDNA，SYBR Premix Ex Taq定量PCR試劑盒檢測miR-552的表達，采用2－△△Ct法計算miR-552的相對表達量。miR-552上游引物序列（5′–3′）：CAGGTGACTGGTTAGAC；下游引物序列（5′–3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC。U6上游引物序列（5′–3′）：ATTGGAACGATACAGAGAAGATT；下游引物序列（5′–3′）：GGAACGCTTCACGAATTTG。操作按試劑盒說明書進行。
1.2.6 MTT法檢測細胞增殖
將HUVEC細胞以每孔2×105個細胞接種至96孔板中，待細胞融合至80%左右時，將細胞分為HUVEC對照組（加入PBS溶液）、HUVEC-外泌體組（加入MKN-45細胞來源外泌體）、HUVEC-陰性對照外泌體組（加入轉染陰性對照質粒的MKN-45細胞來源外泌體）和HUVEC-miR-552 抑制外泌體組（加入轉染miR-552 抑制質粒的MKN-45細胞來源外泌體），每組設6個復孔。其中，3組加入外泌體組每孔加入10 μg/mL的外泌體，HUVEC對照組加入等體積PBS溶液。分別于培養0、24 、48和72 h時，每孔加入10 μL的MTT溶液，繼續培養4 h后，加入二甲基亞砜（DMSO）溶液終止反應，測定酶標儀490 nm處的吸光度（A）值代表細胞增殖率，繪制生長曲線。
1.2.7 Transwell小室檢測細胞遷移
取與外泌體共培養的各組HUVEC細胞和HUVEC對照組細胞，用無血清培養基重懸細胞（2×105個/mL）。Transwell小室上室接種400 μL，培養24 h后，甲醇溶液固定30 min，0.5%結晶紫染色10 min，每個復孔隨機選擇6個視野進行顯微鏡下觀察，計算6個視野平均穿過微孔膜的細胞數作為該復孔的細胞遷移數。
1.2.8 血管生成實驗
取24孔板，每孔加入100 μL的Matrigel基質膠，37 ℃培養箱放置30 min，每孔接種1×105個外泌體共培養的各組HUVEC細胞和HUVEC對照組細胞，放入培養箱中培養12 h后，顯微鏡觀察小管生成節點數。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（±s）描述，2組間比較采用成組設計兩樣本比較的t檢驗，3組間及組間兩兩比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MKN-45 細胞外泌體的提取與鑒定
本研究成功從MKN-45胃癌細胞中提取外泌體和抑制miR-552表達的外泌體，透射電鏡觀察外泌體均呈圓形或橢圓形，直徑在100～150 nm，可見外泌體囊泡結構，見圖1a～1c。WB結果顯示，提取的外泌體中可檢測到外泌體表面標志物CD63、CD9和TSG101蛋白的表達，而MKN-45細胞內則無CD63、CD9和TSG101蛋白表達，見圖1d。
圖1
示透射電鏡下觀察外泌體形態以及外泌體和MKN-45細胞中CD63、CD9和TSG101蛋白表達的WB鑒定結果
a～c：透射電鏡觀察外泌體形態（透射電鏡 ×50 000），見MKN-45空白對照組（a）、MKN-45 陰性對照組（b）和MKN-45 miR-552 抑制組（c）的外泌體均呈圓形或橢圓形，大小均勻，直徑100～150 nm；d：MKN-45 miR-552 抑制組 MKN-45 細胞外泌體和MKN-45細胞中CD63、CD9、TSG101蛋白表達的WB電泳結果
2.2 外泌體被HUVEC細胞內化
示蹤實驗結果顯示，MKN-45細胞來源的外泌體被HUVEC細胞內化，見圖2a。
圖2
示外泌體被HUVEC細胞內化以及4組細胞的增殖、遷移和血管生成實驗結果
a：HUVEC-miR-552 抑制外泌體組外泌體被HUVEC細胞內化（PKH26熒光標記 ×400），其中DAPI染色藍色部分為HUVEC細胞核，PKH26標記的外泌體顯示為紅色；b和c：MKN-45細胞外泌體（b）和抑制miR-552后MKN-45細胞來源外泌體（c）對HUVEC細胞增殖的影響；d～g：HUVEC對照組（d）、HUVEC-外泌體組（e）、HUVEC-陰性對照外泌體組（f）和HUVEC-miR-552 抑制外泌體組（g）的細胞遷移實驗結果（結晶紫染色 ×200）；h～k：HUVEC對照組（h）、HUVEC-外泌體組（i）、HUVEC-陰性對照外泌體組（j）和HUVEC-miR-552 抑制外泌體組（k）的血管生成實驗結果（倒置顯微鏡 ×100）
2.3 MKN-45細胞轉染miR-552 inhibitor后外泌體中的miR-552表達水平
MKN-45細胞轉染miR-552 抑制質粒后，與MKN-45空白對照組和MKN-45 陰性對照組相比，MKN-45 miR-552 抑制組外泌體中的miR-552相對表達水平降低，差異有統計學意義（P<0.05），表明獲得差異表達miR-552的外泌體，見表1。
表1
各組細胞外泌體中miR-552相對表達水平比較（）
2.4 MKN-45細胞來源外泌體和抑制 miR-552 后 MKN-45 細胞來源外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、血管生成及miR-552表達的影響
MKN-45細胞和抑制miR-552表達后MKN-45細胞來源的外泌體對HUVEC細胞的影響見圖2b～2k。
2.4.1 MKN-45細胞來源外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、血管生成及miR-552表達的影響
與HUVEC對照組相比，HUVEC-外泌體組24、48和72 h的A490值增高，遷移細胞數、小管生成節點數和miR-552相對表達水平升高（P<0.05），表明MKN-45細胞外泌體促進HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，可能與促進miR-552表達有關，見表2、圖2b、2d、2e、2h和2i。
表2
MKN-45細胞外泌體對HUVEC細胞遷移、血管生成和 miR-552 表達的影響（）
2.4.2 抑制miR-552后MKN-45細胞來源外泌體對HUVEC細胞增殖、遷移、血管生成及miR-552表達的影響
結果見表3和圖2c、2f、2g、2j和2k。與HUVEC-陰性對照外泌體組相比，HUVEC-miR-552 抑制外泌體組24、48 和72 h 的A490 值降低，且遷移細胞數、小管生成節點數及miR-552 的相對表達水平降低（P<0.05），表明抑制MKN-45 細胞外泌體miR-552 的表達能抑制HUVEC 細胞的增殖、遷移和血管生成。
表3
抑制miR-552后MKN-45細胞來源外泌體對HUVEC細胞遷移、血管生成和miR-552表達的影響（）
3 討論
轉移是胃癌患者死亡的主要原因，轉移進程中涉及到腫瘤細胞生長、附著侵入、血管生成、細胞耐藥性等過程[11]。血管是腫瘤微環境的重要組成部分，可為腫瘤的生長提供氧氣和營養物質，血管生成包含內皮細胞生長、遷移、黏附等過程，與血管生成有關的調控分子可促進血管生成，且可促進腫瘤轉移，因此，抑制血管新生成為腫瘤治療的一個新方向[12]。外泌體是細胞外囊泡的一種，直徑40～200 nm，絕大多數細胞均可分泌，可介導細胞間信息傳遞[13]。外泌體中包含多種蛋白質、mRNA和miRNA，其中miRNA是外泌體的重要構成成分，外泌體來源的miRNA可參與調控胃癌的生長、轉移、侵襲，免疫調節、抗腫瘤治療等。已有研究顯示，多種外泌體來源的miRNA參與胃癌的發生發展[14-15]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是腫瘤微環境的重要組成部分，以從胃癌細胞提取的外泌體處理MSCs后，可促進巨噬細胞的吞噬作用，上調促炎因子的分泌，促進T細胞表面CD69和CD25的活化，其主要通過核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路影響MSCs的免疫調節功能，增強MSCs激活免疫細胞、維持炎癥環境、增強腫瘤生長的能力[16]。另有研究[17]顯示，胃癌細胞來源外泌體攜帶的miR-135b，可抑制內皮細胞中叉頭轉錄因子（forkhead transcription factor，FOXO1）的表達，并促進血管生成。本研究成功從MKN-45胃癌細胞中提取外泌體及抑制miR-552表達的外泌體，通過透射電鏡觀察到外泌體均呈圓形或橢圓形，直徑為100～150 nm，可見外泌體的囊泡結構，且存在外泌體表面標志物CD63、CD9和TSG101蛋白的表達，其大小、形態及標志蛋白均符合外泌體特征。將MKN-45細胞外泌體與HUVEC細胞共培養后，細胞增殖率（A490值）、遷移細胞數和小管生成節點數均升高，表明MKN-45細胞外泌體促進HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，然而其具體機制尚不清楚。
miRNA為小分子非編碼RNA，多項研究表明，miRNA參與調節胃癌細胞的增殖、遷移、血管生成等過程，與胃癌的發生發展及預后密切相關[18-20]。miR-552為miRNA的一種，與多種腫瘤的發生有關，研究顯示miR-552在乳腺癌[21]、喉癌[8]、肝癌[22]、結腸癌[23]等多種腫瘤中表達上調，促進腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲行為。本研究通過RT-qPCR檢測與外泌體共培養的HUVEC細胞中miR-552的表達水平，結果顯示，HUVEC-外泌體組的細胞增殖率（A490值）、遷移細胞數、小管生成節點數和miR-552表達水平均高于HUVEC對照組，提示miR-552可能與HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成有關。
研究[24]表明，miR-552在胃癌患者中高表達，與患者預后不良有關。miR-552可靶向叉頭盒O1蛋白調控磷脂酰肌醇3-激酶和蛋白激酶B通路，從而促進胃癌細胞的生長、轉移與上皮-間充質轉化。miR-552在其他腫瘤中也有研究，如在骨肉瘤中miR-552表達上調，miR-552可通過靶向抑制Wnt抑制因子-1的表達，而激活Wnt/β-catenin通路促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[25]。本研究將抑制miR-552表達的MKN-45細胞來源外泌體與HUVEC細胞共培養后發現，與HUVEC-陰性對照外泌體組相比，HUVEC-miR-552 抑制外泌體組的細胞增殖、遷移細胞數目和小管生成節點數降低，表明抑制MKN-45細胞外泌體的miR-552表達能抑制HUVEC細胞的增殖、遷移和血管生成，提示MKN-45細胞外泌體可能通過高表達miR-552而促進血管新生，因此推測在胃癌轉移過程中，外泌體攜帶miR-552進入靶器官后，改變細胞周圍的微環境，通過靶向調控促進腫瘤細胞的增殖和血管新生。但本研究僅研究了1種胃癌細胞系的外泌體攜帶的miR-552對HUVEC細胞增殖、遷移和血管生成的影響，為本研究的不足，仍需選擇更多細胞系對本實驗結果進行驗證。
綜上所述，MKN-45細胞外泌體促進HUVEC細胞的增殖、遷移與血管生成，可能與外泌體中miR-552的高表達有關，但其具體機制尚不明確，仍需選擇更多的細胞系及動物模型來對miR-552的調控機制做進一步研究。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們無相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉柱和田圣威設計研究、統計分析并撰寫論文；史守興和劉柱收集文章數據并查閱文獻；許春進給予指導。
